Methodenartikel

Laser microdissectie voor species-agnostische single-tissue toepassingen

DOI:

10.3791/63666

⸱

31 maart 2022

 ,  ,  ,  , 
1Center for Developmental Genetics, New York University, 2Sacred Heart University, 3Baylor School

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er wordt een protocol beschreven dat lasermicrodissectie gebruikt om individuele nematodenweefsels te isoleren voor RNA-sequencing. Het protocol vereist geen soortspecifieke genetische toolkits, waardoor genexpressieprofielen kunnen worden vergeleken tussen verschillende soorten op het niveau van single-tissue monsters.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Single-cell methodologieën hebben een revolutie teweeggebracht in de analyse van de transcriptomen van specifieke celtypen. Ze vereisen echter vaak soortspecifieke genetische "toolkits", zoals promotors die weefselspecifieke expressie van fluorescerende eiwitten aansturen. Verder verwijderen protocollen die weefsels verstoren om individuele cellen te isoleren cellen uit hun oorspronkelijke omgeving (bijvoorbeeld signalering van buren) en kunnen ze resulteren in stressreacties of andere verschillen met inheemse genexpressietoestanden. In het huidige protocol is lasermicrodissectie (LMD) geoptimaliseerd om individuele nematodenstaarttips te isoleren voor de studie van genexpressie tijdens de morfogenese van de mannelijke staartpunt.

LMD maakt de isolatie van een deel van het dier mogelijk zonder de noodzaak van cellulaire verstoring of soortspecifieke toolkits en is dus van toepassing op elke soort. Vervolgens kunnen eencellige RNA-seq-bibliotheekvoorbereidingsprotocollen zoals CEL-Seq2 worden toegepast op LMD-geïsoleerde afzonderlijke weefsels en worden geanalyseerd met behulp van standaardpijpleidingen, aangezien een goed geannoteerd genoom of transcriptoom beschikbaar is voor de soort. Dergelijke gegevens kunnen worden gebruikt om vast te stellen hoe geconserveerd of verschillend de transcriptomen zijn die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling van dat weefsel in verschillende soorten.

Beperkingen zijn onder meer de mogelijkheid om het weefsel van belang uit te snijden en de steekproefgrootte. Uit een vermogensanalyse blijkt dat er maar liefst 70 staartpunten per conditie nodig zijn voor 80% vermogen. Nauwe synchronisatie van de ontwikkeling is nodig om dit aantal dieren in hetzelfde ontwikkelingsstadium te verkrijgen. Zo wordt ook een methode beschreven om dieren met intervallen van 1 uur te synchroniseren.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nematoden - met name de rhabditid-nematoden gerelateerd aan het modelsysteem Caenorhabditis elegans - zijn om vele redenen een prachtige groep dieren voor evolutionaire ontwikkelingsbiologie (EDB) 1,2. Voordelen zijn onder meer hun kleine aantal cellen, gedefinieerde en consistente cellijnlijnen, transparantie en gemak van cultuur en houderij. Er zijn ook veel bronnen beschikbaar, waaronder hoogwaardige genomen voor meerdere soorten, en voor C. elegans, uitgebreide moleculair genetische hulpmiddelen en kennis over ontwikkeling, genetica, anatomie en fysiologie 3,4,5,6.

Net als bij veel andere organismen heeft het vermogen om transcriptoomdynamiek in afzonderlijke weefsels of afzonderlijke cellen te karakteriseren een revolutie teweeggebracht in de analyse van de ontwikkeling in C. elegans 7,8,9,10. In staat zijn om eencellige transcriptomen tussen nematoden te vergelijken, zou EDB op dezelfde manier transformeren met behulp van deze organismen. Dergelijke vergelijkingen zouden bijvoorbeeld inzicht geven in hoe genregulerende netwerken zijn geëvolueerd voor personages (eigenschappen) die zijn bewaard gebleven, voor personages die zijn afgeweken of voor personages die onafhankelijk zijn geëvolueerd.

Het isoleren van bepaalde weefsels of cellen van nematoden is echter een van de grote uitdagingen. Voor veel organismen kunnen afzonderlijke cellen worden losgekoppeld van weefsels en op een onbevooroordeelde manier worden geoogst of kunnen worden gelabeld met weefselspecifieke expressie van een fluorescerend eiwit en gesorteerd op fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS)11. In C. elegans is high-throughput (HTP) isolatie van cellen meestal beperkt tot embryo's omdat de taaie buitenste cuticula (en hydrostatisch skelet) de celisolatie van larven en volwassenen heeft belemmerd. Om deze uitdaging te omzeilen, hebben sommige methoden genetische hulpmiddelen gebruikt in hele C. elegans-wormen, zoals weefselspecifieke mRNA-tagging12 en differentiële expressievergelijkingen tussen wildtype en mutanten die een celtype13 beïnvloeden. Meer recente methoden hebben de uitdaging overwonnen door de cuticula op te lossen om kernen14 of hele cellen 8,9,15 te isoleren. Celisolatie en celcultuur hebben echter de voor de hand liggende nadelen dat cellen worden verwijderd uit hun natuurlijke ontwikkelings- of anatomische context - bijvoorbeeld weg van cel-celsignalering en contact met de extracellulaire matrix - die naar verwachting het genexpressieprofiel zullen beïnvloeden15. Bovendien zijn de genetische hulpmiddelen en weefselspecifieke markers soortspecifiek (d.w.z. ze kunnen alleen worden gebruikt in C. elegans).

LMD biedt een alternatieve methode voor het isoleren van weefsels zonder de natuurlijke context van cellen te verstoren. Belangrijk voor EDB is dat LMD ook transcriptomen van homologe weefsels van verschillende soorten kan vergelijken zonder dat er soortspecifieke genetische toolkits nodig zijn als genoom- of hele transcriptoomsequenties van deze soorten beschikbaar zijn. LMD omvat het richten van weefsels door directe microscopische observatie en het gebruik van een lasermicrobeam - geïntegreerd in de optica van de microscoop - om het weefsel van belang uit te snijden en te oogsten (vast te leggen) 16. Beperkingen van LMD zijn dat het niet bevorderlijk is voor zeer HTP-benaderingen (hoewel de transcriptieprofielen voor staartpunten, zoals beschreven in dit protocol, robuust waren met ~ 70 monsters), bepaalde monsters moeilijk te ontleden kunnen zijn en sneden beperkt zijn tot de precisie van de laser en wat kan worden gevisualiseerd in de microscoop.

Het doel van dit protocol is om te beschrijven hoe LMD, gevolgd door single-tissue RNA-Seq, kan worden gebruikt om stadium- en weefselspecifieke transcriptoomgegevens van nematoden te verkrijgen. Specifiek demonstreert het LMD voor het isoleren van staartpunten van larven in het vierde stadium (L4) van C. elegans. Deze methode kan echter worden aangepast aan andere weefsels en, natuurlijk, verschillende soorten.

Bij C. elegans zijn er 4 cellen die de staartpunt maken bij zowel mannetjes als hermafrodieten. Tijdens het L4-stadium bij mannen - maar niet bij hermafrodieten - veranderen de staartpuntcellen van vorm en migreren ze vooraan en naar binnen. Dit proces komt ook voor bij sommige, maar niet alle andere rhabditid nematodensoorten. Daarom is de staartpunt een goed model voor de evolutie van seksuele dimorfe morfogenese. Door zijn positie is de staartpunt ook gemakkelijk te isoleren door LMD.

Om transcriptoomprofielen van staartpunten te verkrijgen, maakt het huidige protocol gebruik van CEL-Seq2, een RNA-seq-methode die is ontwikkeld voor enkele cellen17,18. Deze methode heeft verschillende voordelen voor lmd-afgeleide weefsels. CEL-Seq2 is zeer gevoelig en efficiënt en maakt gebruik van unieke moleculaire identificatiemiddelen (UMI's) om eenvoudige kwantificering van mRNA-metingen mogelijk te maken, in vitro transcriptie om lineaire amplificatie te garanderen en barcodering die multiplexing van individuele weefselmonsters mogelijk maakt. De enige beperking van CEL-Seq2 is dat herstelde reads vertekend zijn tot het 3'-einde van mRNA's, en de meeste isovormen kunnen dus niet worden onderscheiden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Worm synchronisatie

OPMERKING: Twee methoden worden hieronder beschreven om de ontwikkeling van C. elegans en andere rhabditid-soorten te synchroniseren.

  1. Synchroniseren door eerste larvale stadium (L1) arrestatie na alkalische hypochloriet (bleekmiddel) behandeling.
    OPMERKING: Deze methode is eerder in detail beschreven19. Deze methode is gebaseerd op twee kenmerken van C. elegans die ook gelden voor verschillende andere rhabditid-soorten: (1) De eierschaal is resistent tegen bleekmiddel, terwijl de cuticula rond volwassen en larvale wormen dat niet is. (2) Larven in de eerste fase stoppen de ontwikkeling wanneer ze zonder voedsel worden gehouden20.
    1. Behandel gravid hermafrodieten (of vrouwtjes) met een verdunde bleekoplossing om hun nagelriem te breken en embryo's vrij te geven.
    2. Haal de embryo's uit het bleekmiddel en bewaar ze zonder voedsel totdat alle L1 zijn uitgekomen.
    3. Plaats de gearresteerde L1 op voedsel, waar ze allemaal op ongeveer hetzelfde moment de ontwikkeling hervatten.
      OPMERKING: Exit from L1 arrestatie kan binnen een uur plaatsvinden.
  2. Synchronisatie met de "hatch-off" methode (hier gebruikt; Figuur 1 boven):
    OPMERKING: De hatch-off-methode maakt een strakke synchronisatie mogelijk zonder verstoring van de ontwikkeling (L1-arrestatie beïnvloedt de ontwikkeling zelfs van latere stadia21). Het protocol is aangepast van Pepper et al.22. Het doel van deze methode is om L1 die over een bepaalde periode zijn uitgekomen te verzamelen uit een plaat die alleen embryo's bevat.
    1. Kies moeders: Op de avond voordat u de hatch-off uitvoert, plukt u ~ 30 gravid hermafrodieten op een bord bezaaid met E. coli OP50.
    2. Incubeer bij 25 °C voor het leggen van eieren 's nachts.
      OPMERKING: Kies een bord zonder scheuren of bubbels waar wormen vast kunnen komen te zitten. Vermijd platen met een zeer dik bacterieel gazon, omdat het later moeilijk zal zijn om alle wormen te verwijderen. Als u met een temperatuurgevoelige stam werkt, past u de legtijd van de eieren aan om rekening te houden met een langere embryogenese. Kies moeders in de maximale legfase.
    3. Verwijder moeders en larven: de volgende ochtend, onder de ontleedmicroscoop (20x vergroting), pipetteer voorzichtig 1-2 ml M9-buffer tegen de wand van de plaat zonder te spuiten; draai de plaat om de wormen te verjagen.
    4. Verwijder en gooi alle vloeistof en wormen weg door de pipetpunt tegen de wand van de plaat aan de rand van de agar te plaatsen om te voorkomen dat er gaten prikken. Controleer of er geen wormen (en alleen eieren/embryo's) op het bord liggen, vooral geen L1's; anders herhaalt u de wasbeurt.
    5. Plaats de plaat gedurende 1 uur op 25 °C en wacht tot er enkele L1's uitkomen.
    6. Verzamel nieuw uitgekomen L1's: laat voorzichtig 1 ml M9-buffer op de agar vallen. Draai de plaat om L1 los te maken, maar geen embryo's. Pipetbuffer en wormen voorzichtig in een centrifugebuis van 1 ml.
    7. Centrifugeer de buis gedurende 1 minuut bij ~18.000 × g. Verwijder het supernatant.
    8. Pipetteer L1 direct op het bacteriële gazon van een gezaaide plaat. Controleer onder de dissectiemicroscoop of er geen volwassen wormen of embryo's aanwezig zijn.
    9. Houd wormen bij 25 °C totdat ze zich hebben ontwikkeld tot het gewenste stadium.
      OPMERKING: Als de omstandigheden optimaal zijn, kunnen nog twee partijen L1 van dezelfde plaat worden verzameld. Inspecteer de eerste plaat om er zeker van te zijn dat er geen L1 aanwezig is. Was indien nodig opnieuw. Herhaal stap 1.2.5-1.2.9.
    10. Controleer de timing van de ontwikkeling. Voordat u doorgaat naar de downstream-toepassing, inspecteert u enkele wormen onder een samengestelde microscoop met een vergroting van 400x om te bevestigen dat ze het gewenste ontwikkelingsstadium hebben bereikt, hier L3.
      OPMERKING: Migratieafstand van distale tipcellen of linkercellen kan als leidraad worden gebruikt, naast de ontwikkeling van vulva. Voor de ontwikkeling van vulva bieden Mock et al.23 een nuttige leidraad, hoewel de timing in dat onderzoek werd bepaald bij 20 °C. Bij 25 °C ondergaan wild-type C. elegans 24 uur na het uitkomen de L3-L4 vervelling.

2. Het verzamelen van L4 mannetjes en hermafrodieten en fixatie

  1. Bereid RNAse-vrij, koud (-20 °C), 70% methanol voor fixatie.
  2. Begin onder een dissectiemicroscoop bij 30-50x vergroting mannetjes en hermafrodieten van de synchronisatieplaten op afzonderlijke ongeplaatste platen zodra de geslachten kunnen worden onderscheiden (~ 21 uur na het uitkomen, figuur 2), en blijf plukken gedurende 1-2 uur of totdat 200 dieren zijn verzameld.
  3. Houd de wormen op 25 °C totdat ze het gewenste stadium voor het experiment bereiken.
  4. Was de wormen van de plaat met 1-2 ml M9-buffer met behulp van een pipetpunt voorgewassen met M9-buffer met 0,01% reinigingsmiddel (om te voorkomen dat wormen aan de punt blijven plakken).
  5. Breng de wormen over in een centrifugebuis van 1 ml.
  6. Draai gedurende 1 minuut op 21.000 × g om de wormen te pelleteren. Verwijder het supernatant.
  7. Voeg 1 ml M9-buffer toe en meng om de pellet te breken.
  8. Draai gedurende 1 minuut op 21.000 × g om de wormen te pelleteren. Verwijder het supernatant.
  9. Herhaal de wasbeurt.
  10. Voeg 1 ml ijskoude 70% methanol toe en meng goed.
  11. Draai gedurende 1 minuut op 21.000 × g om de wormen te pelleteren. Verwijder het supernatant.
  12. Herhaal stap 2.10 en 2.11.
  13. Voeg 500 μL 70% methanol toe, meng en bewaar bij 4 °C gedurende 1 uur tot een nacht.

3. Laser microdissectie

OPMERKING: Gebruik vanaf hier RNase-vrije reagentia en verbruiksartikelen; gebruik filtertips.

  1. Als de CEL-Seq2-methode wordt gebruikt om de monsters te verwerken, bereidt u een hoofdmengsel voor elke CEL-Seq2-primer (aanvullende tabel S1): pipetteer 2 μL CEL-Seq2-primer, 1 μL van 10 mM dNTP en 9 μL van 1% β-Mercaptoethanol (in RNase-vrij water) in een gelabelde buis van 200 μL.
  2. Montage op schuif
    1. Pipetteer onder een dissectiemicroscoop 20 μL van de vaste wormen (20-40 wormen uit stap 2.13) op de matte kant van een polyethyleenntalaat (PEN)-membraanglasschuif (waar het membraan zich bevindt).
    2. Wacht tot de methanol is verdampt. Gebruik een schuifwarmer om de verdamping te versnellen.
      OPMERKING: Extra druppels methanol kunnen worden aangebracht en een pipetpunt wordt gebruikt om de wormen uit te spreiden als ze beginnen te klonteren terwijl ze drogen. Wanneer wormen in bosjes zitten, kunnen ze moeilijk te ontleden zijn.
  3. De microscoop instellen
    OPMERKING: Het volgende protocol is specifiek voor het instrument dat in de materiaaltabel wordt vermeld. Het moet worden aangepast als een andere LMD-microscoop wordt gebruikt.
    1. Plaats een desktop luchtbevochtiger achter het podium aan de zijkant van de LMD-microscoop. Zorg ervoor dat de damp direct op het podium blaast.
      OPMERKING: De luchtbevochtiger is nuttig om statische elektriciteit te verminderen, die anders kan voorkomen dat het kleine membraangedeelte in de buisdop valt.
    2. Draai de sleutel om voor laservermogen.
    3. Schakel de stage control in.
    4. Schakel de microscoopbedieningskast in.
    5. Open Laser Microdissection software.
    6. Verwijder het plastic schild over het podium.
    7. Klik op de knop Lossen met de pijl-omhoog voor het laden van de membraanglaasjes.
    8. Zorg ervoor dat de glijbaan volledig droog is, draai zodat het membraan naar beneden is gericht.
    9. Voeg de dia in en klik op Doorgaan in het venster voorbeeld wijzigen .
    10. Vervang het plastic schild.
    11. Kies onder aan het scherm welke diahouder de dia bevat.
    12. Om de buizen te laden, klikt u op de knop lossen met de neerwaartse pijl.
    13. Trek de lade eruit en verwijder het buisblok.
      OPMERKING: Het buisblok dat voor dit experiment wordt gebruikt, is voor PCR-buizen van 500 μL.
    14. Steek de buisdoppen van 500 μL PCR-buizen in de houder en vouw de buis eronder.
    15. Breng het blok terug naar de lade en schuif de lade terug in de microscoopfase.
    16. Selecteer in het pop-upvenster change collector device (wijziging collector device popup) de optie PCR tubes en klik op OK.
    17. Klik op de lege buislocatie linksonder in het scherm onder de buisdoppen van het collectorapparaat.
    18. Selecteer in het bedieningspaneel Microscoop TL-BF voor lichthelder veldverlichting.
  4. Stek
    OPMERKING: Dit protocol is specifiek voor het instrument dat in de materiaaltabel wordt vermeld.
    1. Gebruik de 2,5x lens om de focus aan te passen totdat de wormen en de structuur van het membraan zichtbaar zijn.
    2. Schakel over naar de 20x lens.
    3. Verplaats het werkgebied naar een gebied zonder wormen. Pas de focus zodanig aan dat de belachtige structuren in het membraan een gelige kleur hebben (figuur 3A, B) om de laser op het juiste brandpuntsvlak te richten.
    4. Stel de laserparameters in; voor staarttips, begin met Power 45, diafragma 30 en snelheid 20.
    5. Selecteer in het deelvenster Lasercontrole de optie Kalibreren. Volg de instructies.
      OPMERKING: Het instrument voert deze stap automatisch uit. Het zorgt ervoor dat een vorm die met de muis op het scherm is getekend identiek is aan de vorm die door de laser wordt uitgesneden.
    6. Klik onderaan het scherm bij de buisdoppen van het collectorapparaat op positie A.
    7. Selecteer aan de rechterkant van het scherm | Tekenen + knippen. Selecteer aan de linkerkant van het scherm PtoP.
    8. Trek een lijn.
    9. Klik op Start Cut zodat de laser door het membraan snijdt.
      OPMERKING: Het kan ook een lijn in het glas etsen.
    10. Als deze testsnede er goed uitziet (het membraan is gesneden, randen van de snede zien er glad uit), ga dan verder met de volgende stap. Pas anders de focus aan en knip een andere lijn.
    11. Zoek een worm. Schakel over naar Verplaatsen + Knippen en gebruik de muis om door de staart te snijden.
      OPMERKING: Als de laser niet door de staart snijdt, past u de focus aan en verhoogt u het laservermogen. Voor dikkere weefsels moet het laservermogen mogelijk worden ingesteld op 60.
    12. Sla de parameters op: | op het tabblad Bestand Toepassingsconfiguratie opslaan; voor later ophalen, Toepassingsconfiguratie herstellen.
    13. Als u het monster wilt verzamelen, schakelt u over naar de instelling Tekenen + Knippen met de functie PtoP en tekent u een vorm om de snede van een membraansectie te voltooien (figuur 3C).
      OPMERKING: Grotere membraansecties en secties in de vorm van rechthoeken of driehoeken in plaats van cirkels of ovalen zijn gemakkelijker te vinden in de collectorbuisdop.
    14. Selecteer de volgende buis bij Collector Device Tube Cap aan de onderkant van het scherm en knip de volgende staartpunt.
    15. Zodra vier staarten zijn gesneden, lost u het buisrek (klik op Lossen met neerwaartse pijl) en zoekt u de membraansecties onder een ontleedmicroscoop (figuur 3D).
      OPMERKING: De secties kunnen zich in het midden van de buisdop bevinden of aan de zijkant van de dop worden geplakt.
    16. Ga verder met de downstream-toepassing. Pipet voor CEL-Seq2 1,2 μL van een CEL-Seq2 primer master mix (vanaf stap 3.1) direct bovenop het monster.
    17. Sluit de buis, label met primernummer en plaats de buisdop onmiddellijk direct op een stuk droogijs om het monster te bevriezen en RNA-afbraak te voorkomen.
    18. Laad meer buizen, breng het buisblok terug naar het podium en snijd meer monsters. Voeg een andere CEL-Seq2 primer mix toe aan elke staartpunt.
    19. Bewaar alle buizen bij -70 °C.

4. Single-tail RNA-sequencing met CEL-Seq2

OPMERKING: Voor volledige details over het CEL-Seq2 protocol, zie Yanai en Hashimshony18.

  1. Reinig het gebied van de laboratoriumbank met de saneringsoplossing van RNase om RNA-afbraak te voorkomen.
  2. Bereid mastermixen en bewaar ze op ijs.
    1. Bereid de reverse-transcriptie mastermix voor: 0,4 μL eerstestrengbuffer, 0,1 μL 0,1 M DTT, 0,1 μL RNase-remmer en 0,1 μL reverse transcriptase per monster.
    2. Bereid de tweede strengreactiemastermix: 7 μL water, 2,31 μL tweede strengbuffer, 0,23 μL dNTP, 0,08 μL E. coli ligase, 0,3 μL E. coli DNA polymerase, 0,08 μL RNaseH per monster.
  3. Cellen openbreken en gloeien met primers (zie aanvullende tabel S1 voor de volledige lijst van primers):
    1. Programmeer de thermocycler en het deksel tot 65 °C.
    2. Haal de monsters op van -70 °C en incubeer ze gedurende 2,5 min in de thermocycler.
    3. Draai op 21.000 × g gedurende 30-40 s.
    4. Incubeer bij 65 °C gedurende 2,5 min.
    5. Verplaats ze onmiddellijk naar ijs.
    6. Draai op 21.000 × g gedurende 30-40 s en breng ze terug naar ijs.
  4. RNA converteren naar cDNA:
    1. Voeg 0,8 μL van de reverse transcriptiemix toe aan elke staartpunt.
    2. Incubeer bij 42 °C gedurende 1 uur.
    3. Warmte-inactiveer bij 70 °C Gedurende 10 min.
    4. Verplaats het onmiddellijk naar ijs.
    5. Voeg 10 μL van de tweede strengmix toe aan elke staartpunt.
    6. Veeg over de monsters.
    7. Draai op 21.000 × g gedurende 30-40 s.
    8. Incubeer bij 16 °C gedurende 2 uur.
  5. cDNA opschonen:
    1. Prewarm de DNA-opschoningskralen voor op kamertemperatuur.
    2. Pool tot 40 monsters in een centrifugebuis van 1,5 ml (tot 480 μL).
    3. Meng de kralen tot ze goed gedispergeerd zijn en voeg 20 μL kralen en 100 μL kraalbindingsbuffer toe voor elke 100 μL van het samengevoegde monster (voeg voor 480 μL monster 480 μL kraalbuffer en 96 μL kralen toe aan een eindvolume tot 1.056 μL). Meng goed door te pipetteren.
    4. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 min.
    5. Plaats op een magnetische standaard gedurende ten minste 5 minuten totdat de vloeistof helder lijkt.
    6. Verwijder en gooi alles behalve 20 μL van het supernatant weg.
    7. Voeg 200 μL vers bereide 80% ethanol toe.
    8. Incubeer minstens 30 s, verwijder het supernatant door het af te pipetteren zonder de kralen te storen. Gooi het supernatant weg.
    9. Herhaal stap 4.5.7 en 4.5.8 eenmaal.
    10. Droog de kralen aan de lucht gedurende 15 minuten of tot ze helemaal droog zijn.
    11. Resuspendeer de kralen (~6,4 μL) met 6,4 μL water. Meng grondig door het hele volume tien keer op en neer te pipetteren.
    12. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 min.
    13. Ga direct naar in vitro transcriptie (IVT).
  6. In vitro transcriptie en fragmentatie:
    1. Voeg aan de buis met 6,4 μL monster en de kralen het volgende mengsel toe (9,6 μL totaal): 1,6 μL 10x T7 Buffer, 1,6 μL ATP, 1,6 μL UTP, 1,6 μL CTP en 1,6 μL GTP (elke dNTP bij 75 mM concentratie) 1,6 μLof T7 enzym.
    2. Incubeer gedurende 13 uur bij 37 °C met een 4 °C hold.
    3. Voeg 6 μL exonucleaseoplossing toe (het uiteindelijke volume moet 22 μL zijn).
    4. Incubeer gedurende 15 min bij 37 °C.
    5. Plaats de buis terug op ijs en voeg 5,5 μL fragmentatiebuffer (0,25 × reactievolume) toe.
    6. Incubeer gedurende 3 min bij 94 °C.
    7. Verplaats de buis onmiddellijk naar ijs en voeg 2,75 μL fragmentatiestopbuffer toe (0,5 × volume fragmentatiebuffer toegevoegd).
    8. Verwijder de kralen door de buis minstens 5 minuten op de magnetische standaard te plaatsen totdat de vloeistof helder lijkt.
    9. Breng het supernatant over in een nieuwe buis.
  7. Amplified RNA (aRNA) opschonen:
    1. Prewarm de RNA-opruimkralen voor op kamertemperatuur.
    2. Meng de kralen tot ze goed verspreid zijn.
    3. Pipet 55 μL kralen (1,8 × reactievolume).
    4. Incubeer ze bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
    5. Plaats de buis minstens 5 minuten op de magnetische standaard totdat de vloeistof helder lijkt.
    6. Verwijder en gooi 80 μL van het supernatant weg.
    7. Voeg 200 μL vers bereide 70% ethanol toe.
    8. Incubeer gedurende ten minste 30 s, verwijder het supernatant door te pipetteren zonder de kralen te storen. Gooi het supernatant weg.
    9. Herhaal de ethanolwas nog twee keer.
    10. Droog de kralen aan de lucht gedurende 15 minuten of tot ze helemaal droog zijn.
    11. Resuspendeer de kralen met 7 μL water. Pipetteer het hele volume 10 keer op en neer om grondig te mengen.
    12. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 min.
    13. Plaats de buis met de kralen gedurende 5 minuten op de magnetische standaard totdat de vloeistof helder lijkt.
    14. Breng het supernatant over in een nieuwe buis.
      OPMERKING: Stopplaats: monsters kunnen bij -70 °C worden bewaard.
  8. Optioneel: Controleer de hoeveelheid en kwaliteit van het aRNA met een geautomatiseerd elektroforesesysteem volgens het protocol van de fabrikant.
  9. Bibliotheek voorbereiding:
    1. Voeg aan 5 μL RNA 1 μL 100 μM willekeurige hexameer RT primer toe (zie de Tabel met Materialen) en 0,5 μL van 10 mM dNTP.
    2. Incubeer bij 65 °C gedurende 5 min.
    3. Voeg 4 μL van het volgende mengsel toe bij kamertemperatuur: 2 μL First Strand-buffer, 1 μL 0,1 M DDT, 0,5 μL RNase-remmer, 0,5 μL reverse transcriptase.
    4. Incubeer bij 25 °C gedurende 10 min.
    5. Incubeer bij 42 °C gedurende 1 uur (in een hybridisatieoven of een voorverwarmde thermische cycler met het deksel ingesteld op 50 °C).
    6. Incubeer bij 70 °C gedurende 10 min.
    7. Breng 5 μL over naar een nieuwe buis (houd de rest van de reactie op -20 °C). Voeg 5,5 μL ultrapuur water, 1 μL RNA PCR Primer (RP1), 1 μL geïndexeerd RNA PCR Primer (RPIX) en 12,5 μL PCR-mix toe.
    8. Gebruik het volgende programma op de thermocycler: 30 s bij 98 °C, 11 cycli van: (10 s bij 98 °C, 30 s bij 60 °C, 30 s bij 72 °C), 10 minuten bij 72 °C, vasthouden bij 4 °C.
      OPMERKING: Stopplaats: monsters kunnen bij -20 °C worden bewaard.
  10. Bibliotheek opschonen:
    1. Prewarm de DNA-opschoningskralen voor op kamertemperatuur.
    2. Meng de kralen tot ze goed verspreid zijn.
    3. Voeg 25 μL van de kralen toe aan de PCR-reactie. Meng goed door te pipetteren.
    4. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 min.
    5. Plaats de buis minstens 5 minuten op de magnetische standaard totdat de vloeistof helder lijkt.
    6. Verwijder en gooi 45 μL van het supernatant weg.
    7. Voeg 200 μL vers bereide 80% ethanol toe.
    8. Incubeer gedurende ten minste 30 s, verwijder en gooi het supernatant weg zonder de kralen te verstoren.
    9. Herhaal de ethanolwas eenmaal.
    10. Droge kralen aan de lucht gedurende 15 minuten of totdat ze volledig droog zijn.
    11. Resuspendeer ze met 25 μL water. Meng goed door te pipetteren.
    12. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 min.
    13. Plaats de buis gedurende 5 minuten op de magnetische standaard totdat de vloeistof helder lijkt.
    14. Breng 25 μL supernatant over in een nieuwe buis.
    15. Herhaal stap 4.10.2-4.10.10 eenmaal.
    16. Resuspenderen met 10,5 μL water. Meng goed door te pipetteren.
    17. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 min.
    18. Plaats de buis gedurende 5 minuten op de magnetische standaard totdat de vloeistof helder lijkt.
    19. Breng 10 μL van het supernatant over in een nieuwe buis en bewaar bij -20 °C.
  11. Beoordeel de kwaliteit en kwantiteit van de bibliotheek volgens de vereisten van de sequencingfaciliteit.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Na laservangst microdissectie, individuele staartpunten van mannetjes en hermafrodieten op 4 tijdstippen (L3 22 h na het uitkomen; L4 24, 26 en 28 uur na het uitkomen) werden voorbereid voor RNA-sequencing met behulp van het CEL-Seq2-protocol. CEL-Seq2 primers bevatten unieke barcodes waarmee sequencing reads van een bepaald monster (in dit geval een individuele staartpunt) bioinformatisch kunnen worden geïdentificeerd. Sequencinggegevens werden met deze methode gegenereerd voor een totaal van 557 staartpunten (266 herma...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kritieke stappen van de methode
Indien correct uitgevoerd, zal de hier beschreven methode robuuste RNA-profielen verkrijgen met een relatief klein aantal laserontleden monsters (70 staartpunten in dit voorbeeld). Voor monsters van ontwikkelende dieren is nauwe synchronisatie echter van cruciaal belang om de variabiliteit tussen monsters te verminderen. Om deze reden beveelt het protocol de hatch-off-methode voor wormsynchronisatie aan. Hier kan de onderzoeker het leeftijdsverschil tussen individuen (1...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle auteurs verklaren dat ze geen belangenconflicten hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gefinancierd door NIH (R01GM141395) en NSF (1656736) subsidies aan DF en NIH fellowship (F32GM136170) aan AW. Figuur 1 is gemaakt met behulp van BioRender.com.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
 0.5 µM PEN membraan glazen platen RNase vrijLeica11600288voor LMD
500 µL PCR buizen (nuclease-vrij)Axygen732-0675om de staartpunten in te snijden
Samengestelde microscoop met 40x objectief en DICelkeom de leeftijd van wormen te controleren
Desktopbevochtigerelke
Dissectiemicroscoop met doorgelaten lichtbasiselkevoor al het wormwerk
glazen pasteur pipettenelkehandgreep van wormpick
glas slides en dekselselkeom de leeftijd van wormen te controleren
LMD6 microdissectie systeemLeicameerdereom staartpunten te snijden
LoBind buizen 0,5 mLEppendorf22431005
M9 BufferRecept in WormBook
Methanol 99,8%Sigma322415om wormen te fixeren
NGM groeimediumUS BiologicalN1000Buffers en zouten moeten worden toegevoegd: Recept in WormBook
P10 pipet variabel volumebijv. Gilson
P1000 pipet variabel volumebijv. Gilson
P2 pipet variabel volumebijv. Gilson
Pipet tips 1.000 µLelke
Pipet tips 1-10 µL gefilterdelke
platina iridium draadTritechPT-9010om wormpick te maken
steriele en nuclease-vrije 1 mL centrifuge buizenelke
Tween 20SigmaP9416Voeg een zeer kleine hoeveelheid toe aan M9 buffer om te voorkomen dat wormen aan de pipettips blijven plakken
geventileerde 6 mm plastic Petri schotelselke
Voor CEL-Seq2
4200 TapeStation Systeem met reagentia voor gevoelige RNA- en DNA-detectieAligentgeautomatiseerd elektroforesesysteem
AMPure XP kralenBeckman CoulterA63880DNA opruimingskralen
Kraalbinding buffer  20% PEG8000, 2,5 M NaCl
CEL-Seq2 primers (zie Tabel S1)Sigma Genosys Mastercycler Nexus GX2 Eppendorf6335000020Thermische cycler met programmeerbare deksel en blok voor 200 µl buizen.
DNA Polymerase I (E. coli)Invitrogen18052-025
dNTP mix 10 mMelke
E. coli DNA ligaseInvitrogen18052-019
Ethanol
ExoSAP-IT Voor PCR Product Clean-UpAffymetrix78200exonuclease oplossing
MEGAscript T7 Transcriptie KitAmbionAM1334Voor stap 4.6.1
Nuclease-vrij waterelke
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix met HF BufferNEBM0531PCR mix stap 4.9.7
willekeurige hexamer RT primer GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA
NNNNNN		IDTeen primer met 6 nucleotiden die willekeurig zijn
RNA Fragmentatie bufferNEBE6150S
RNA Fragmentatie stop bufferNEBE6150S
RNA PCR Index Primers (RPI1–RPI48)Illumina, NEB of IDTRPIX in protocol stap 4.9.7, sequenties verkrijgbaar bij Illumina
RNAClean XP kralenBeckman CoulterA63987
RNase AWAY Oppervlakte DecontaminantThermo Scientific7000TS1of een ander soortgelijk product
RNaseH (E. coli)Invitrogen18021-071
RNaseOUT Recombinant Ribonuclease InhibitorInvitrogen10777-019
Tweede streng bufferInvitrogen10812-014
Superscripit IIInvitrogen18064-014reverse transcriptase

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Haag, E. S., Fitch, D. H. A., Delattre, M. From "the worm" to "the worms" and back again: the evolutionary developmental biology of nematodes. Genetics. 210 (2), 397-433 (2018).
  2. Sommer, R. J., Bumbarger, D. J. Nematode model systems in evolution and development. Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. 1 (3), 389-400 (2012).
  3. WormBase. , Available from: https://wormbase.org/#012-3-6 (2022).
  4. WormAtlas. , Available from: https://wormatlas.org (2022).
  5. WormBook. , Available from: http://wormbook.org (2022).
  6. WormBook in Genetics. , Available from: https://academic.oup.com/genetics/pages/wormbook (2022).
  7. Cao, J., et al. Comprehensive single-cell transcriptional profiling of a multicellular organism. Science. 357 (6352), 661-667 (2017).
  8. Kaletsky, R., Murphy, C. T. Transcriptional profiling of C. elegans adult cells and tissues with age. Methods in Molecular Biology. 2144, 177-186 (2020).
  9. Kaletsky, R., et al. Transcriptome analysis of adult Caenorhabditis elegans cells reveals tissue-specific gene and isoform expression. PLoS Genetics. 14 (8), 1007559(2018).
  10. Packer, J. S., et al. A lineage-resolved molecular atlas of C. elegans embryogenesis at single-cell resolution. Science. 365 (6459), 1971(2019).
  11. Kulkarni, A., Anderson, A. G., Merullo, D. P., Konopka, G. Beyond bulk: a review of single cell transcriptomics methodologies and applications. Current Opinion in Biotechnology. 58, 129-136 (2019).
  12. Von Stetina, S. E., et al. Cell-specific microarray profiling experiments reveal a comprehensive picture of gene expression in the C. elegans nervous system. Genome Biology. 8 (7), 135(2007).
  13. Baugh, L. R., et al. The homeodomain protein PAL-1 specifies a lineage-specific regulatory network in the C. elegans embryo. Development. 132 (8), 1843-1854 (2005).
  14. Haenni, S., et al. Analysis of C. elegans intestinal gene expression and polyadenylation by fluorescence-activated nuclei sorting and 3'-end-seq. Nucleic Acids Research. 40 (13), 6304-6318 (2012).
  15. Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. Isolation and culture of larval cells from C. elegans. PLoS One. 6 (4), 19505(2011).
  16. Emmert-Buck, M. R., et al. Laser capture microdissection. Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).
  17. Hashimshony, T., et al. CEL-Seq2: sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biology. 17, 77(2016).
  18. Yanai, I., Hashimshony, T. CEL-Seq2-single-cell RNA sequencing by multiplexed linear amplification. Methods in Molecular Biology. 1979, 45-56 (2019).
  19. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e4019(2012).
  20. Baugh, L. R. To grow or not to grow: nutritional control of development during Caenorhabditis elegans L1 arrest. Genetics. 194 (3), 539-555 (2013).
  21. Baugh, L. R., Hu, P. J. Starvation responses throughout the Caenorhabditis elegans life cycle. Genetics. 216 (4), 837-878 (2020).
  22. Pepper, A. S., Killian, D. J., Hubbard, E. J. Genetic analysis of Caenorhabditis elegans glp-1 mutants suggests receptor interaction or competition. Genetics. 163 (1), 115-132 (2003).
  23. Mok, D. Z., Sternberg, P. W., Inoue, T. Morphologically defined sub-stages of C. elegans vulval development in the fourth larval stage. BMC Developmental Biology. 15, 26(2015).
  24. Lytal, N., Ran, D., An, L. Normalization methods on single-cell RNA-seq data: an empirical survey. Frontiers in Genetics. 11, 41(2020).
  25. Vieth, B., Ziegenhain, C., Parekh, S., Enard, W., Hellmann, I. powsimR: power analysis for bulk and single cell RNA-seq experiments. Bioinformatics. 33 (21), 3486-3488 (2017).
  26. Bolkova, J., Lanctot, C. Quantitative gene expression analysis in Caenorhabditis elegans using single molecule RNA FISH. Methods. 98, 42-49 (2016).
  27. Ji, N., van Oudenaarden, A. Single molecule fluorescent in situ hybridization (smFISH) of C. elegans worms and embryos. WormBook. , 1-16 (2012).
  28. Lee, C., et al. Single-molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH) in Caenorhabditis elegans. Bio-Protocol. 7 (12), 2357(2017).
  29. Baird, S. E., Chamberlin, H. M. Caenorhabditis briggsae methods. WormBook. , 1-9 (2006).
  30. Felix, M. A. Oscheius tipulae. WormBook. , 1-8 (2006).
  31. Han, Z., et al. Improving transgenesis efficiency and CRISPR-associated tools through codon optimization and native intron addition in Pristionchus nematodes. Genetics. 216 (4), 947-956 (2020).
  32. Fernandes Povoa, E. E., Ebbing, A. L. P., Betist, M. C., vander Veen, C., Korswagen, H. C. An optimized dissociation protocol for FACS-based isolation of rare cell types from Caenorhabditis elegans L1 larvae. MethodsX. 7, 100922(2020).
  33. Han, M., Wei, G., McManus, C. E., Hillier, L. W., Reinke, V. Isolated C. elegans germ nuclei exhibit distinct genomic profiles of histone modification and gene expression. BMC Genomics. 20 (1), 500(2019).
  34. Steiner, F. A., Henikoff, S. Cell type-specific affinity purification of nuclei for chromatin profiling in whole animals. Methods in Molecular Biology. 1228, 3-14 (2015).
  35. Ebbing, A. Spatial transcriptomics of C. elegans males and hermaphrodites identifies sex-specific differences in gene expression patterns. Developmental Cell. 47 (6), 801-813 (2018).
  36. Rödelsperger, C., et al. Spatial transcriptomics of nematodes identifies sperm cells as a source of genomic novelty and rapid evolution. Molecular Biology and Evolution. 38 (1), 229-243 (2021).
  37. Amini, P., et al. An optimised protocol for isolation of RNA from small sections of laser-capture microdissected FFPE tissue amenable for next-generation sequencing. BMC Molecular Biology. 18 (1), 22(2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Single cell RNAsoortonafhankelijk protocolweefselisolatiestaartpunten van nematodenCEL Seq2genexpressieanalysedissectiemicroscoopPEN membraanplaatjemonster synchronisatie

Gerelateerde artikelen