Volledige versus subregionale kwantificering van amyloïde-bètabelasting op hersensecties van muizen

Samenvatting

Het huidige protocol beschrijft en vergelijkt de procedure om een volledige regio of subregio van belang analyse uit te voeren van sagittale muishersensecties om amyloïde-bètabelasting te kwantificeren in het APP / PS1 transgene muismodel van de ziekte van Alzheimer.

Samenvatting

Extracellulaire accumulatie van amyloïde-bèta (Aβ) plaques is een van de belangrijkste pathologische kenmerken van de ziekte van Alzheimer (AD) en is het doelwit van de enige door de FDA goedgekeurde ziektemodificerende behandeling voor AD. Dienovereenkomstig wordt het gebruik van transgene muismodellen die het amyloïde precursoreiwit overexpresseren en daardoor cerebrale Aβ-plaques accumuleren, veel gebruikt om menselijke AD bij muizen te modelleren. Daarom meten immunoassays, waaronder enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) en immunostaining, vaak de Aβ-belasting in hersenweefsels afgeleid van AD-transgene muizen. Hoewel de methoden voor Aβ-detectie en -kwantificering goed zijn vastgesteld en gedocumenteerd, is de impact van de grootte van het in het hersenweefsel geselecteerde interessegebied op Aβ-belastingsmetingen na immunostaining niet gemeld. Daarom was het huidige protocol gericht op het vergelijken van de Aβ-belastingsmetingen over de volledige en subregio's van belang met behulp van een beeldanalysesoftware. De stappen die betrokken zijn bij de voorbereiding van hersenweefsel, vrij zwevende hersensectie immunostaining, beeldvorming en kwantificering van Aβ-belasting in volledige versus subregio's van belang worden beschreven met behulp van hersensecties die zijn afgeleid van 13 maanden oude APP / PS1 dubbele transgene mannelijke muizen. Het huidige protocol en de resultaten bieden waardevolle informatie over de impact van de grootte van het interessegebied op de kwantificering van het Aβ-positieve gebied en tonen een sterke correlatie tussen het Aβ-positieve gebied dat is verkregen met behulp van de volledige en subregio's van belanganalyses voor hersensecties afgeleid van 13 maanden oude mannelijke APP / PS1-muizen die wijdverspreide Aβ-afzetting vertonen.

Inleiding

De ziekte van Alzheimer (AD), de zesde belangrijkste doodsoorzaak in de Verenigde Staten, blijft een bedreiging voor de volksgezondheid, met naar schatting 6,2 miljoen Amerikanen die leven met AD. Dit zal naar verwachting in 2060 13,8 miljoen bedragen¹. Tot op heden is symptomatische behandeling door middel van medicijnen zoals cholinesteraseremmers en memantine de primaire^{behandelingskuur 2}. AD wordt gekenmerkt door neuropathologische manifestaties zoals extracellulaire afzetting van amyloïde-bèta (Aβ) plaques en intracellulaire hyperfosforyleerde tau-accumulatie in de vorm van neurofibrillaire klitten ^3,4. Gevormd door een endoproteolytische splitsing van het amyloïde precursoreiwit (APP) via bèta- en gamma-secretase, aggregeert Aβ om oligomeren en fibrillen te vormen, wat leidt tot neurotoxische effecten⁵. Aβ is verondersteld een primaire pathologische rol te vervullen sinds de jaren 1980, en is het therapeutische doelwit van de enige door de FDA goedgekeurde ziektemodificerende therapie voor AD⁶. Als gevolg hiervan zijn transgene AD-muismodellen met mutaties in genen die resulteren in robuuste cerebrale Aβ-accumulatie op grote schaal gebruikt voor preklinisch AD-onderzoek sinds de vroege jaren 1990⁷.

Detectie van Aβ-soorten in deze AD-transgene muizenhersenen gebeurt over het algemeen met behulp van twee immunoassays: enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) en immunostaining. De eerste test maakt kwantitatieve bepaling van verschillende Aβ-soorten mogelijk en is minder tijdrovend in vergelijking met immunostaining, waarvoor verschillende sequentiële weefselverwerkings- en beeldvormingsstappen nodig zijn, waaronder weefselsectie, immunostaining, beeldvorming en kwantificering⁸. Verder zijn de resultaten verkregen na immunostaining semi-kwantitatief⁸. Het vermogen om Aβ ruimtelijk te lokaliseren maakt immunostaining echter een aantrekkelijke benadering voor Aβ-detectie in hersenweefsels⁸.

Tijdens het gebruik van Aβ-immunostaining zijn verschillende kwantificeringsparadigma's gebruikt door verschillende onderzoeksgroepen. Sommige onderzoeksgroepen kwantificeren bijvoorbeeld de Aβ-belasting in het hele interessegebied (cortex of hippocampus), terwijl anderen de Aβ-belasting kwantificeren in een bepaald subgebied van belang (een deel van de cortex of de hippocampus)^9,10,11. Hoewel de methoden voor Aβ-detectie en -kwantificering goed zijn vastgesteld en gedocumenteerd, is de impact van de omvang van het interessegebied op Aβ-belastingsmetingen na immunostaining niet gerapporteerd. Daarom was het huidige protocol gericht op het vergelijken van de Aβ-belastingsmetingen in de volledige en subregio's van belang met behulp van een beeldanalysesoftware, ImageJ.

De huidige studie gebruikte 13 maanden oude APP / PS1 dubbele transgene mannelijke muizen, die een chimere muis / menselijke APP en een gemuteerd preseniline 1 uitdrukken, om het vroege begin van AD¹² te modelleren. Aβ-afzettingen beginnen zich te ontwikkelen op de leeftijd van 6-7 maanden en overvloedige Aβ-accumulatie wordt waargenomen, zowel in de cortex als in de hippocampus van deze muizen op de leeftijd van 9-10 maanden^{op de leeftijd van 12}. De transgene amyloïde peptiden en holoproteïne kunnen worden gedetecteerd door 6E10-immunostaining¹³, waardoor het een wenselijk diermodel is voor het huidige protocol. De procedure die hierin wordt behandeld, omvat hersenweefselvoorbereiding, immunostaining van vrij zwevende secties, beeldvorming en kwantificering van Aβ-belasting in volledige versus subregio's van belang. De analyse toont een sterke correlatie tussen de volledige en subregionale kwantificering, wat wijst op een robuuste overeenkomst tussen deze twee methoden in de hersenweefselsecties afgeleid van 13 maanden oude APP / PS1 mannelijke muizen die overvloedige Aβ-afzettingen vertonen.

Protocol

Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de University Laboratory Animal Resources onder protocollen die zijn goedgekeurd door de University of California, Irvine, Institutional Animal Care and Use Committee. De experimenten werden uitgevoerd met mannelijke B6C3-Tg(APPswe, PSEN1dE9)85Dbo/Mmjax (APP/PS1) muizen (13 maanden oud, n = 35). De muizen werden verkregen uit commerciële bronnen (zie Tabel van Materialen).

1. Voorbereiding van hersenweefsel

1. Anesthetie de muizen met behulp van een dodelijke dosis van een op fenytoïne/pentobarbital gebaseerd anestheticum (150 mg/kg) dat intraperitoneaal wordt geïnjecteerd (zie materiaaltabel) volgens goedgekeurde dierprotocollen. Voer hartperfusie uit met ijskoude fosfaat-gebufferde zoutoplossing (1x PBS) gedurende 5 minuten met een snelheid van 5 ml / min om de hersenvaculatuur te zuiveren¹⁴.
2. Oogst hersenweefsel volgens het eerder gepubliceerde rapport¹⁵, scheid in de linker- en rechterhersenhelft en plaats de rechter hemi-hersenen van elke muis in een conische buis van 15 ml met 5 ml vers bereide 4% paraformaldehyde (PFA) -oplossing in 1x PBS gedurende 72 uur bij 4 °C.
   OPMERKING: De hersenen kunnen immersie-gefixeerd zijn van 24-72 uur, afhankelijk van het antigeen dat wordt bestudeerd. De linker hemi-hersenen, zonder het cerebellum, kunnen worden ingevroren in vloeibare stikstof en vervolgens worden bewaard bij -80 °C, gevolgd door verwerking voor biochemische testen zoals ELISA en biochemische Aβ-detectie¹⁶.
   LET OP: PFA is een waarschijnlijk carcinogeen en huidcontact met PFA kan leiden tot allergische huidsymptomen. Gebruik nitril- of butylhandschoenen, maskers en oogbescherming om ermee om te gaan en bereid voor onder een chemische zuurkast.
3. Na incubatie in 4% PFA, incubeer de hemi-hersenen achtereenvolgens in 5 ml van 10%, 20% en 30% sucrose-oplossingen bereid in 1x PBS gedurende 24 uur, elk bij 4 ° C totdat het hersenweefsel naar de bodem van de conische buis zakt.
4. Na incubatie in de 30% sucrose-oplossing, verwijder de hemi-hersenen, dep de hersenen voorzichtig op een filterpapier om de overtollige sucrose-oplossing te verwijderen en vries de vaste hemi-hersenen in poedervormig droogijs gedurende 30 minuten. Bewaar de bevroren hemi-hersenen in goed gelabelde aluminiumfolies bij -80 °C tot cryosectie.
   OPMERKING: In het huidige protocol werden de hemi-hersenen gedurende 6-8 maanden bewaard bij -80 °C.
5. Verdeel de bevroren hemi-hersenen in 20 μm dikke secties met behulp van een cryostaat (zie Materiaaltabel).
   OPMERKING: Voor het huidige protocol werden de hemi-hersenen gesegmenteerd in sagittale secties en indien nodig kunnen coronale secties ook worden voorbereid¹⁷. Stap 2 is voor Aβ immunofluorescente kleuring op vaste en cryobeschermde hersenweefselmonsters.

2. Immunofluorescentie

1. Plaats de sagittale hersenweefselsecties (stap 1.5) in een 24-well plaat (maximaal zes hersensecties van muizen per 300 μL per putje). Was gedurende 5 minuten met 1x PBS drie keer op kamertemperatuur (23 °C) door de plaat op een shaker met zachte werveling te plaatsen.
2. Incubeer de hersenweefselsecties met 70% mierenzuur in dH₂0 bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
   LET OP: Mierenzuur is corrosief, dus vermijd huid- en oogcontact.
3. Was de hersenweefselsecties gedurende 5 minuten met dH₂0 driemaal bij kamertemperatuur.
4. Blok niet-specifieke binding met 0,5% runderserumalbumine (BSA) en 0,3% TritonX 100 (zie Materiaaltabel) in 1x PBS bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
5. Incubeer de hersenweefselsecties met een fluorofoor-gelabeld primair antilichaam (6E10, zie Tabel van materialen) verdund (1:1000) in 1x PBS met 0,3% TritonX 100 bij 4 °C gedurende 24 uur.
   OPMERKING: Aangezien het primaire antilichaam fluorofoor-geconjugeerd is, moet de plaat vanaf deze stap worden bedekt of moet al het werk in een donkere kamer worden gedaan om de effectiviteit van fluorofoor te behouden.
6. Was de hersenweefselsecties gedurende 10 minuten met 1x PBS drie keer bij kamertemperatuur.
7. Monteer de hersenweefselsecties op positief geladen glazen dia's (zie Materiaaltabel) die goed zijn gelabeld (labelinformatie op de dia is gebaseerd op voorkeur), na een korte wasbeurt met dH₂0 om resterende zouten te verwijderen. Laat de dia's in het donker aan de lucht drogen.
   OPMERKING: De hersensecties moeten zorgvuldig worden gemonteerd om plooien en scheuren te voorkomen, wat van invloed is op de kwantificering van gegevens. In het geval van scheuren en/of plooien die in het interessegebied liggen en de kwantificering van gegevens kunnen verstoren, wordt herkleuring en hermontage aanbevolen.
8. Monteer de hersenweefselsecties met een waterig montagemedium (zie Materiaaltabel) en plaats de glazen afdekplaat over het weefsel. Sluit de uiteinden van de coverslip af met heldere nagellak en bewaar de dia's in een schuifdoos bij 4 °C totdat ze in beeld worden gebracht.
   OPMERKING: In het huidige protocol zijn de dia's binnen 1 maand na het kleuren in beeld gebracht.

3. Beeldvorming

1. Beeld de 6E10-gekleurde hersensecties af met behulp van een fluorescentie (epifluorescentie of confocale) microscoop (zie Tabel van Materialen), die een 2x doel heeft om de volledige hersenweefselsectie in één beeld vast te leggen en is uitgerust met het juiste filter (GFP in dit werk).
   OPMERKING: Beeldinstellingen moeten consistent zijn voor verschillende dia's.
2. Sla de vastgelegde afbeeldingen op als een TIFF-bestand of zoals vereist en open ze in de beeldanalysesoftware (zie Materiaaltabel) zoals beschreven in stap 4.2 hieronder voor 6E10-kwantificering.
   OPMERKING: Neem een schaalbalk op voordat u de afbeelding vastlegt om te kwantificeren in de beeldanalysesoftware ImageJ.

4. Analyse van de volledige interesseregio

OPMERKING: De twee interessegebieden van het huidige werk zijn de hippocampus en de iso-cortex. Full-region of interest analyse vertegenwoordigt de analyse van de gehele iso-cortex (aangeduid als de cortex in de toekomst) of de hippocampus in het afgebeelde hersenweefselgedeelte.

1. Download de beeldanalysesoftware (zie Materiaaltabel) en start de software na installatie.
2. Zodra de software is uitgevoerd, klikt u op Bestand | Open | Kies de afbeelding die u wilt analyseren.
3. Klik op | analyseren Schaal instellen| Klik hierop om de schaal te verwijderen. Selecteer het gereedschap Recht in de softwarewerkbalk en teken een rechte lijn over de lengte van de schaalbalk. Klik op | analyseren Meten. Noteer de lengte of afstand van de schaalbalk in pixels. Klik op | analyseren Weegschaal instellen.
   1. Voer in het pop-upvenster de afstand in pixels, de bekende afstand van de schaalbalk (in dit geval in μm) en de lengte-eenheid in als μm. Schakel Algemeen in om de nieuwe schaalinstelling toe te passen op alle volgende afbeeldingen als er meerdere afbeeldingen worden verwerkt. Klik op OK om de instellingen toe te passen.
      OPMERKING: Het wordt altijd aanbevolen om te controleren of de juiste schaal op de afbeelding wordt toegepast voor verdere analyse.
4. Als u de gewenste meting wilt instellen op het gebied van de sectie, gaat u naar Analyseren | Metingen instellen | Selecteer de vakken Gebied en Label weergeven. Controleer of de afbeelding die wordt geanalyseerd is geselecteerd onder Omleiden naar.
5. Voor het gemak van hippocampus- of cortexvisualisatie, ga naar Afbeelding | | aanpassen Helderheid/contrast. Sleep de schuifbalk Maximum geleidelijk naar links om de helderheid van het weefsel te vergroten totdat de hersengebieden van belang identificeerbaar zijn.
   OPMERKING: Pas deze instelling niet toe om valse metingen tijdens de analyse te voorkomen, maar ga verder met de volgende stap.
6. Gebruik het gereedschap Polygoonselectie of Vrije hand om het hippocampusgebied te schetsen. Klik op de resetoptie van de helderheids- / contrastinstellingen zodra de hippocampus is geschetst om terug te keren naar de oorspronkelijke helderheid.
   OPMERKING: De stappen moeten afzonderlijk worden herhaald voor het corticale gebied.
7. Om het totale weefseloppervlak van het geselecteerde gebied te meten, klikt u op | bewerken Helder buiten. Zodra het geselecteerde gebied de enige afbeelding op het scherm is, klikt u op Analyseren | Meet om het totale weefseloppervlak te verkrijgen dat in een pop-upvenster is geanalyseerd. Sla de gegevens op in een Excel-bestand voor later gebruik.
8. Als u het 6E10-positieve gebied wilt meten, gaat u naar Afbeelding | | aanpassen Kleurdrempel. Een vooraf gemaakt filter onder de thresholding-methode levert meestal de gewenste resultaten op die de sterkste signalen in rood markeren.
   OPMERKING: De optimale drempelselectie is afhankelijk van de achtergrond van de afbeelding en de kleurintensiteit. Selecteer een drempelinstelling die de vlek oppikt en niet de achtergrond.
9. Nadat u de juiste drempel hebt geselecteerd, vinkt u Donkere achtergrond aan. Dit markeert de Aβ-vlekken (de vlek van belang) op een zwarte achtergrond. Klik op Selecteer | Originele | Selecteer en geef de donkere signalen (de Aβ-afzettingen) op een witte achtergrond. Klik op | analyseren Analyseer deeltjes en klik op OK wanneer het pop-upvenster wordt gegenereerd.
10. Kopieer de samenvattingsuitvoer die door de software is gegenereerd door op Bewerken | Kopiëren. Plak in het eerder gestarte Excel-bestand met de respectievelijke labels. Dit is het 6E10-positieve gebied in de geselecteerde interessegebieden (hippocampus of cortex).
    OPMERKING: In Excel is er een kolom voor het totale 6E10-positieve gebied (stap 4.10) en het totale weefseloppervlak (stap 4.7).
11. Bereken het 6E10-positieve gebied (%) als volgt¹⁶: (Totaal 6E10-positief gebied/Totaal weefseloppervlak geanalyseerd) x 100.

5. Analyse van de subregio van belang

OPMERKING: Subregio van belang analyse vertegenwoordigt de analyse van een deel van de cortex of de hippocampus in het afgebeelde hersenweefselgedeelte.

1. Download de beeldanalysesoftware en start de software na installatie.
2. Zodra de software is uitgevoerd, klikt u op | Open | Kies de afbeelding die u wilt analyseren.
3. Klik op | analyseren Schaal instellen| Klik hierop om de schaal te verwijderen. Selecteer het gereedschap Recht op de softwarewerkbalk en teken een rechte lijn over de lengte van de schaalbalk. Klik op | analyseren Meten. Noteer de lengte of afstand van de schaalbalk in pixels. Klik op | analyseren Weegschaal instellen.
   1. Voer in het pop-upvenster de afstand in pixels in, de bekende afstand van de schaalbalk (in dit geval in μm) en voer de lengte-eenheid in als μm. Schakel Algemeen in om de nieuwe schaalinstelling toe te passen op alle volgende afbeeldingen als er meerdere afbeeldingen worden verwerkt. Klik op OK om de instellingen toe te passen.
      OPMERKING: Het wordt altijd aanbevolen om te controleren of de juiste schaal op de afbeelding wordt toegepast voor verdere analyse.
4. Als u de gewenste meting wilt instellen op het gebied van de sectie, gaat u naar Analyseren | Metingen instellen | selecteer de vakken Gebied en Label weergeven. Controleer of de afbeelding die wordt geanalyseerd is geselecteerd onder Omleiden naar.
5. Pas de helderheid en het contrast aan als het beeld te zwak is en de hersengebieden (bijvoorbeeld de hippocampus of de cortex in dit geval) niet gemakkelijk kunnen worden geïdentificeerd. Gebruik de softwarewerkbalk en klik op Image | | aanpassen Helderheid/contrast en sleep de schuifregelaars Maximaal naar links om de zichtbaarheid van het weefsel te vergroten.
   OPMERKING: Pas deze instelling niet toe om valse metingen tijdens de analyse te voorkomen, maar ga verder met de volgende stap.
6. Selecteer met het gereedschap Rechthoek het interessegebied in de cortex of de hippocampus. Gebruik de werkbalk en klik op Bewerken | Selectie | Geef op en wijzig de hoogte en breedte in een vooraf gedefinieerde waarde. Pas de doos aan, zodat deze volledig bedekt is met weefsel. Stel de helderheid/het contrast opnieuw in om terug te keren naar de oorspronkelijke helderheid.
   OPMERKING: De grootte van het vak dat wordt gebruikt om de interessegebieden te selecteren, moet consistent zijn voor alle afbeeldingen. Voor de huidige analyse was de doosgrootte ofwel 300 pixels x 300 pixels (equivalent aan 1177 μm x 1177 μm) of 400 pixels x 200 pixels (equivalent aan 1569 μm x 784 μm).
7. Dupliceer de geselecteerde interesseregio door met de rechtermuisknop op het vak te klikken en op Dupliceren te klikken. Er wordt een nieuw venster geopend met de geselecteerde regio. Wijzig de naam van de gedupliceerde afbeelding om het gebied weer te geven waarin deze zich bevindt (bijvoorbeeld cortex of hippocampus).
8. Pas het gedupliceerde afbeeldingstype aan door de werkbalk te gebruiken en op Afbeelding | Type | 8-bits om de gedupliceerde RGB-afbeelding naar 8-bits te converteren om de plaques zo goed mogelijk te analyseren. Keer de afbeelding om door op Bewerken | te klikken Omkeren.
9. Als u het 6E10-positieve gebied wilt meten, gaat u naar Afbeelding | | aanpassen Drempel. Een vooraf gedefinieerd filter onder de thresholding-methode levert meestal de gewenste resultaten door de sterkste signalen in rood te markeren.
   OPMERKING: De optimale drempelselectie is afhankelijk van de achtergrond van de afbeelding en de kleurintensiteit. Selecteer een drempelinstelling die de vlek oppikt en niet de achtergrond.
10. Nadat u de juiste drempelwaarde hebt geselecteerd, selecteert u Toepassen.
11. Als u het 6E10-positieve gebied wilt analyseren, gebruikt u de werkbalk en klikt u op | Analyseer deeltjes en zorg ervoor dat de "Resultaten samenvatten" wordt gecontroleerd.
12. Kopieer de samenvattingsuitvoer met het %Gebied gegenereerd door de software door te klikken op Bewerken | Kopiëren. Plak in het eerder gestarte Excel-bestand met de respectievelijke labels.
13. Herhaal stap 5.3-5.12 voor de verschillende gebieden in het weefsel. Zorg ervoor dat de plaatsing van elk vak om het interessegebied te schetsen consistent is tussen elke afbeelding.
    OPMERKING: Het rotatiegereedschap kan worden gebruikt als de afmetingen van de rechthoekige gereedschapskist niet in het opgegeven gebied passen vanwege weefselkromming.
14. Om de rechthoek te roteren, gebruikt u de werkbalk en klikt u op Bewerken | Selectie | Roteer en pas de rotatiegraad indien nodig aan. Dupliceer de afbeelding zoals vermeld in stap 5.7 en wis de buitenkant door de werkbalk te gebruiken en op bewerken | Helder van buiten, waardoor de 6E10-vlekken buiten de opgegeven rechthoek worden verwijderd. Ga verder met stap 5.8 zoals hierboven beschreven.

Resultaten

Hier worden twee verschillende methoden vergeleken om het 6E10-positieve gebied in de hippocampus en de cortex van hersenweefsels van muizen te kwantificeren. De twee methoden zijn de analyses van de volledige regio en subregio van belang (figuur 1). De volledige interessegebiedanalyse omvat, zoals de naam al doet vermoeden, het schetsen van het hele interessegebied (in dit geval de iso-cortex of de hippocampus) om het 6E10-positieve gebied te bepalen (figuur 1A, B). De subregio van interesseanalyse omvat het selecteren van een vooraf gedefinieerde regio binnen de interesseregio om het 6E10-positieve gebied te bepalen (figuur 1C, D). Het stapsgewijze ImageJ-protocol voor de twee methoden wordt weergegeven in figuur 2, figuur 3 en figuur 4.

Deze studie gebruikte drie lezers; twee onafhankelijke lezers voerden de subregio van interesseanalyse uit en de derde lezer voerde de volledige interessegebiedanalyse uit. Zoals te zien is in figuur 5A, B, was er een sterke significante positieve correlatie (p < 0,0001) tussen het 6E10-positieve gebied gerapporteerd door de twee lezers die de subregio van interesseanalyse uitvoerden (Pearson-correlatiecoëfficiënt r = 0,97 voor de cortex en r = 0,96 voor de hippocampus). De 6E10-positieve gebieden gerapporteerd door de twee lezers voor de subregio van interesseanalyse werden gemiddeld, en de gemiddelde subregio van belang 6E10-positief gebied deelde een sterke significante positieve correlatie (p < 0,0001) met het 6E10-positieve gebied verkregen met behulp van de volledige regio van interesseanalyse voor zowel de cortex (Pearson-correlatiecoëfficiënt r = 0,96; Figuur 5C) en de hippocampus (Pearson correlatiecoëfficiënt r = 0,95; Figuur 5D). Het gemiddelde corticale- en hippocampus-6E10-positieve gebied verkregen door de volledige regio- en subregio van belanganalyses was vergelijkbaar zonder significant verschil, wat de overeenkomst tussen de twee methoden bevestigt (figuur 5E). Verder werd de onoplosbare Aβ1-42 gemeten in homogenen van de hele hersenen in een subset van muizen en het corticale (figuur 5F) en hippocampus (figuur 5G) 6E10-positieve gebied bepaald door de analyse van het volledige interessegebied was significant (p < 0,01) gecorreleerd met onoplosbare Aβ1-42-belasting met behulp van ELISA (zie Tabel van materialen).

Figuur 1: Volledige versus subregio's van belangselectie. Representatieve beelden van de volledige iso-cortex (cortex) en hippocampus geschetst voor de volledige regio van belang analyse in respectievelijk (A) en (B). Representatieve beelden tonen de selectie van subregio('s) van de cortex en hippocampus voor de subregio van belanganalyse in respectievelijk (C) en (D). Schaalbalk = 200 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 2: Protocol voor de volledige interesseregio 6E10-positieve gebiedskwantificering. Stappen voor beeldanalyse met de oorspronkelijke afbeelding (A), de afbeelding na aanpassing van de helderheid/het contrast (B), selectie van het interessegebied (C), clearing (D), drempelaanpassing (E) en de uiteindelijke afbeelding die klaar is voor analyse (F). De nummers in de afbeelding geven de stapnummers in het protocol aan. Schaalbalk = 200 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 3: Protocol voor de subregio van belang 6E10-positieve gebiedskwantificering. Stappen voor beeldanalyse met de oorspronkelijke afbeelding (A), de afbeelding na aanpassing van de helderheid/het contrast (B), selectie van het interessegebied (C), duplicatie van de afbeelding van het interessegebied (D), het wijzigen van de afbeelding in 8-bits en het omkeren van de afbeelding (E), drempelaanpassing (F) en de uiteindelijke afbeelding die klaar is voor analyse (G). De nummers in de afbeelding geven de stapnummers in het protocol aan. Schaalbalk = 200 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 4: Protocol voor de regio van belangrotatie. Beeldanalysestappen die de selectie van het interessegebied en de rotatie van het selectievak weergeven om te passen bij de weefselkromming (A), de afbeelding van het interessegebied na duplicatie (B) en de afbeelding na het wissen van het buitengebied (niet-interessegebied) (C). De getallen in de figuur geven het stapnummer in het protocol aan. Schaalbalk = 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Correlatie tussen de volledige en subregio's van belang analyses. Scatterplots tonen de correlatie tussen het 6E10-positieve gebied door de twee onafhankelijke lezers die de subregio van belanganalyse voor de cortex (A) en de hippocampus (B) uitvoeren. Er wordt een sterke positieve correlatie waargenomen tussen het 6E10-positieve gebied dat het resultaat is van de subregio van interesseanalyse en de volledige interessegebiedanalyse voor zowel de cortex (C) als de hippocampus (D). Er is geen statistisch significant verschil in het gemiddelde 6E10-positieve gebied door de volledige interesseregio en de subregio van interesseanalyses in de cortex en de hippocampus (E). Er wordt een significante correlatie waargenomen tussen homogene onoplosbare Aβ1-42-metingen van de hele hersenen met behulp van ELISA en de analyse van het volledige interessegebied voor zowel de cortex (F) als de hippocampus (G). Gegevens werden geanalyseerd met behulp van de Pearson-correlatiecoëfficiënt, r, in (A-D) en (F-G), en met behulp van tweeweg herhaalde metingen ANOVA in (E) met behulp van een grafiek- en statistieksoftware. De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (SEM) van n = 35 muizen in (E), en een tweezijdige p < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Het hierin beschreven protocol schetst de procedure voor hemi-hersenvoorbereiding voor sagittale secties, immunofluorescente kleuring van Aβ-afzettingen met behulp van het 6E10-antilichaam op vrij zwevende secties, beeldvorming van de Aβ-gekleurde hersensecties gevolgd door kwantificering van de Aβ-afzettingen in de cortex en de hippocampus van hersenweefsel van muizen met behulp van een beeldanalysesoftware. Hoewel er gepubliceerde protocollen zijn om Aβ-belasting te kwantificeren in hersenweefselsecties ^8,10, beschrijft dit protocol de stappen die betrokken zijn bij de kwantificering van Aβ-belasting in de gehele iso-cortex (aangeduid als cortex) en hippocampus in vergelijking met de Aβ-belasting in een subregio van belang in de cortex en de hippocampus, wanneer dit gewenst kan zijn. De correlatie tussen de volledige versus subregio's van belanganalyses wordt ook gegeven.

Er zijn verschillende kritieke stappen in het protocol. Ten eerste is het beschreven protocol voor 20 μm dikke hersenweefselsecties onderworpen aan vrij zwevende immunostaining, wat resulteert in optimale antilichaampenetratie in de weefselsectie¹⁸. De vrij zwevende techniek kan vereisen dat de weefselsecties handmatig worden overgedragen tussen de verschillende oplossingen tijdens de immunofluorescente kleuring en zorgvuldige behandeling van de weefselsecties gedurende de hele procedure. Dit is vooral cruciaal wanneer de weefselsecties worden ondergedompeld in de 70% mierenzuuroplossing voor het ophalen van antigeen in het huidige protocol, waardoor de kwetsbaarheid van het weefsel voor dunne secties toeneemt. Alternatieve benaderingen van het beschreven protocol omvatten het gebruik van dikkere weefselsecties (bijv. 30-40 μm) of het gebruik van weefselsecties die direct op positief geladen dia's zijn gemonteerd vóór de immunofluorescente kleuring. Ten tweede maakt het hierin beschreven protocol gebruik van een fluorescerend gelabeld 6E10-antilichaam. Naast het gebruik van het fluorescerend gelabelde 6E10-antilichaam, kunnen niet-fluorescerende 6E10-antilichamen (bijv. Mierikswortelperoxidase-geconjugeerd 6E10-antilichaam) ook worden gebruikt om Aβ-belasting in hersenweefselsecties te detecteren, en het huidige protocol kan worden aangepast om Aβ-positieve immunochemische vlekken in de hersenweefselsecties te kwantificeren zoals eerder beschreven⁸ . Ten derde zal de nauwkeurigheid van de resultaten voor Aβ-belastingkwantificering afhangen van de juiste drempelselectie in de analysesoftware, die afhankelijk is van de weefselachtergrond en signaalintensiteit. De drempelwaarde moet door de eindgebruiker zodanig worden geselecteerd dat alleen Aβ-positieve vlekken worden geselecteerd voor kwantificering. Tussenkomst van de eindgebruiker is vereist om de specifieke drempel te optimaliseren die op alle afbeeldingen kan worden toegepast om de nauwkeurigheid van de drempelinstelling te garanderen. Ten vierde, aangezien de subregio van interesseanalyse vereist dat een klein gebied van belang in de weefselsectie wordt geselecteerd, werden twee onafhankelijke lezers gebruikt voor deze analyse. Om de onafhankelijkheid en verblinding tijdens het verzamelen van gegevens te behouden, werden alle afbeeldingen gecodeerd met een nummer; de beeldanalysevolgorde werd gerandomiseerd tussen de lezers, zodat de verschillende lezers op elk moment verschillende afbeeldingen analyseerden en de gegevens aan het einde van elke week werden ingediend. Vanwege de verhoogde kans op inter-reader variabiliteit in het gebied van interesseselectie in de subregio van interesseanalyse, werden de lezers getraind met behulp van verschillende voorbeeldafbeeldingen om de regioselectie in de cortex en de hippocampus te optimaliseren voordat ze met de gegevensverzameling begonnen. Deze training is cruciaal om de variabiliteit tussen lezers te verminderen, en zoals te zien is (figuur 5A, B), vertoont het 6E10-positieve gebied dat door beide lezers wordt gerapporteerd een sterke relatieve overeenstemming in de huidige studie.

Het huidige protocol en de resultaten bieden waardevolle informatie over de impact van de regio van belang op de kwantificering van Aβ-positieve gebieden. Van een groter interessegebied wordt verwacht dat het het weefsel meer vertegenwoordigt dan een kleiner interessegebied. Daarom is het bemonsteren van een groter weefsel wenselijk om de Aβ-belasting in weefsels nauwkeurig te kwantificeren. In het geval van homogene Aβ-belastingsverdeling in het weefsel wordt een kleiner bemonsteringsgebied echter over het algemeen beschouwd als een goede weergave van het grotere weefsel dat wordt geanalyseerd. De huidige studieresultaten bevestigen dit, en de Aβ-belasting in de gehele cortex en de hippocampus was een sterke correlatie van Aβ-belasting in een geselecteerd subgebied van de cortex en de hippocampus (figuur 5C,D). Om de overeenkomst tussen de volledige en subregio's van belanganalyses verder te bevestigen, werd het gemiddelde 6E10-positieve gebied in de cortex en de hippocampus vergeleken en werd geen verschil tussen de twee methoden (figuur 5E) gevonden. Dit bevestigt dat een van deze methoden (volledige of subregio-analyse) vergelijkbare Aβ-belastingsmetingen oplevert.

Het huidige protocol heeft enkele beperkingen. De twee methoden (volledige regio versus subregioanalyse) worden mogelijk niet altijd door elkaar gebruikt. De keuze om de volledige of subregio-analyse te gebruiken, hangt af van de regionale verdeling van Aβ in het weefsel, die wordt beïnvloed door de leeftijd, het geslacht en de stam van het AD-muismodel. Na 13 maanden wordt de Aβ-belasting verdeeld over de cortex en hippocampus van de APP/PS1-muizen. Na 6 maanden zijn Aβ-afzettingen echter beperkt tot de cortex en worden minimale afzettingen waargenomen in de hippocampus¹². Onder dergelijke omstandigheden kan de analyse van het volledige interessegebied de gewenste aanpak zijn om het weefselbemonsteringsgebied en daarmee het Aβ-signaal te vergroten. Aan de andere kant kan subregio-analyse de voorkeursmethode zijn wanneer Aβ-belasting in een specifiek hersengebied van belang is (bijvoorbeeld de somatosensorische cortex). Bovendien vertonen de APP/PS1-mannetjesmuizen na 13 maanden intense 6E10-positieve vlekken en resulteert de immunofluorescente kleuring in een uitstekend signaal met een zeer lage achtergrond, waardoor het huidige protocol zeer geschikt is voor kwantificering onder de gegeven omstandigheden. Het is onduidelijk of deze kwantificeringsmethode met succes kan worden toegepast op minder intense kleuring, en toekomstig werk zal nodig zijn om deze vraag te beantwoorden. De hierin gepresenteerde immunofluorescentie- en beeldkwantificeringsmethode detecteert alle vormen van Aβ, inclusief de voorlopervorm¹³. Als gevolg hiervan, als er interesse is in de detectie van een specifieke Aβ-specie (bijvoorbeeld Aβ1-40 of Aβ1-42), kunnen antilichamen worden gebruikt die specifiek zijn voor deze Aβ-isovormen. Hoewel de 6E10 immunofluorescente kleurings- en detectiemethode correleerde met de metingen van Aβ1-42-metingen in homogenen van de hele hersenen met behulp van ELISA (figuur 5F, G), was de correlatie daarom slechts bescheiden. Dit kan worden toegeschreven aan de meting van alleen Aβ1-42 met behulp van de ELISA en detectie van alle Aβ-soorten met behulp van de 6E10 immunostaining. De huidige studie gebruikt drie lezers om de overeenkomst en correlatie tussen de volledige en subregionale analyses te beoordelen. Het hebben van extra lezers kan de robuustheid van de studie verbeteren en kan de overeenkomsten tussen de twee hier gepresenteerde methoden verder valideren. Verder gebruiken we de Pearson-correlatie als een maat voor overeenstemming, die veel wordt gebruikt naast andere methoden om de overeenkomst tussen continue variabelen te beschrijven¹⁹. Een beperking van het gebruik van de Pearson-correlatie om overeenstemming te bepalen, is echter dat de twee methoden die hierin worden gebruikt, gerelateerde resultaten kunnen opleveren, maar dat de ene methode kan resulteren in over het algemeen hogere waarden dan de andere als gevolg van systematische vertekening. Daarom is Pearson-correlatie een goede maat voor relatieve overeenstemming¹⁹. Om de robuustheid van het protocol te vergroten, kunnen aanvullende methoden^{worden gebruikt om} de absolute overeenkomst te bevestigen, zoals het vergelijken van het gemiddelde 6E10-positieve gebied met de twee methoden (figuur 5E). Alles bij elkaar vergelijkt het huidige protocol de Aβ-belasting gedetecteerd door immunofluorescente kleuring en analyseert het de volledige en subregio's van belang in hersenweefselsecties. De resultaten tonen een sterke correlatie tussen deze twee methoden voor hersenweefselsecties afgeleid van 13 maanden oude APP / PS1 mannelijke muizen die overvloedige Aβ-afzettingen vertonen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
15 mL conische buizen	ThermoFisher Scientific, MA, VS	339650
24-well platen	Fisher Scientific, NH, VS	FB012929
Amyloid beta 42 menselijke ELISA-kit	ThermoFisher Scientific, MA, VS	KHB3441
Waterige montage media	Vector laboratories, CA, VS	H-5501-60
Rundserumalbumine	Sigmaaldrich, MO, VS	A2153-50G
BZ-X710 Keyence all-in-one fluorescentiemicroscoop	Keyence, IL, VS	BZ-X710
Klare nagellak	Gebruikersvoorkeur	NA
Cryostat	Leica Biosystems, IL, VS	Leica CM1860 Cryostat
Mierenzuur	Sigmaaldrich, MO, VS	F0507-500ML
Glazen dekvlakken	VWR, PA, VS	48393-081
GraphPad Prism	GraphPad Software, CA, VS	Versie 8
ImageJ 1.51k	National Institutes of Health, MD, VS	Versie 1.53e
Muizen	Jackson Laboratories, ME, VS	034829-JAX
Paraformaldehyde	Sigmaaldrich, MO, VS	P6148-500G
Fenytoine/pentobarbital gebaseerd anestheticum (Euthasol)	Patterson Veterinary, MA, VS	07-805-9296
Fosfaat-gebufferde zoutoplossing	Fisher Scientific,  NH, VS	BP661-50
Plus (+) microscoopglaasjes	Ted Pella, Inc., CA, VS	260100
Primaire antistof (6E10)	Biolegend, CA, VS	803013
Sucrose	Sigmaaldrich, MO, VS	47289
Triton X 100	Sigmaaldrich, MO, VS	T8787-100ML