Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Intravitale subcellulaire microscopie van de borstklier

1.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/63674

⸱

24 juni 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Cellular and Molecular Biology, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 2Charles Perkins Centre, Central Clinical School, Faculty of Medicine and Health, The University of Sydney, 3Department of Molecular Physiology and Biological Physics, School of Medicine, University of Virginia

Corresponderende auteurs: Ian H. Mather <imather@umd.edu>

In dit artikel

Samenvatting

Het huidige protocol beschrijft een eenvoudige techniek voor de intravitale beeldvorming van de borstklier van de zogende muis door middel van laserscanning, confocale en multifotonenmicroscopie.

Samenvatting

De borstklier vormt bij uitstek een model voor het onderzoeken van epitheelfuncties, waaronder weefselremodellering, celpolariteit en secretoire mechanismen. Tijdens de zwangerschap breidt de klier zich uit van een primitieve ductale boom ingebed in een vetkussen tot een sterk vertakt alveolair netwerk dat klaar is voor de vorming en afscheiding van colostrum en melk. Na de bevalling levert de klier alle voedingsstoffen die nodig zijn voor neonatale overleving, inclusief membraangecoate lipidedruppeltjes (LD's), eiwitten, koolhydraten, ionen en water. Verschillende melkcomponenten, waaronder lactose, caseïnemicellen en magere melkeiwitten, worden gesynthetiseerd in de alveolaire cellen en uitgescheiden uit blaasjes door exocytose aan het apicale oppervlak. LD's worden getransporteerd van syntheseplaatsen in het ruwe endoplasmatisch reticulum naar de celtop, bedekt met celmembranen en uitgescheiden door een uniek apocrien mechanisme. Andere voorgevormde bestanddelen, waaronder antilichamen en hormonen, worden door transcytose van de serosale zijde van het epitheel naar melk getransporteerd. Deze processen zijn vatbaar voor intravitale microscopie omdat de borstklier een huidklier is en daarom direct toegankelijk is voor experimentele manipulatie. In dit artikel wordt een eenvoudige procedure beschreven om de kinetiek van LD-secretie in situ, in real-time, te onderzoeken bij levend verdoofde muizen. Boor-dipyrromethene (BODIPY)665/676 of monodansylpentaan worden gebruikt om de neutrale lipidefractie van transgene muizen te labelen, die ofwel oplosbaar EGFP (versterkt groen fluorescerend eiwit) tot expressie brengen in het cytoplasma, ofwel een membraangericht peptide dat is gefuseerd met EGFP of tdTomato. De membraan-gelabelde fusie-eiwitten dienen als markers van celoppervlakken en de lipidekleurstoffen lossen LD's ≥ 0,7 μm op. Time-lapse-beelden kunnen worden opgenomen met standaard confocale laserscanmicroscopie tot een diepte van 15-25 μm of met multifotonenmicroscopie voor beeldvorming dieper in het weefsel. De borstklier kan tijdens de operatie worden gebaad met farmacologische middelen of fluorescerende kleurstoffen, waardoor een platform wordt geboden voor acute experimentele manipulaties indien nodig.

Inleiding

Intravitale microscopie van de borstklier van muizen krijgt steeds meer aandacht als een krachtige methode voor het analyseren van een hele reeks biologische verschijnselen, waaronder de oorsprong en differentiatie van stamcellen 1,2, de progressie van uitgezaaide tumoren 3,4,5 en de rol van ductale macrofagen tijdens de ontwikkeling en involutie van de borst6. Door de ontwikkeling van Intravitale Subcellulaire Microscopie (ISMic)7 is het onderzoek uitgebreid naar membraanverkeer en secretoire mechanismen tijdens lactatie 8,9, en oxytocine-gemedieerde contractie van myoepitheelcellen 9,10. Er zijn twee hoofdmethoden ontwikkeld die gebruik maken van de toegankelijkheid van de klier tussen de huid en de lichaamswand.

Bij de eerste benadering wordt een raam van acryl of glas in de huid gestoken en vastgezet met een metalen borgring 1,3,11. De muizen verdragen de operatie goed en verschillende verschijnselen kunnen met tussenpozen gedurende meerdere weken bij hetzelfde dier worden geanalyseerd. Deze methode is vooral nuttig gebleken voorhet traceren van de afstamming 1,12 en het monitoren van de invasie en progressie van borsttumoren in situ 3,11. Resolutie onder het niveau van de hele cel is echter moeilijk gebleken omdat de klier nog steeds aan de lichaamswand is bevestigd en dus onderhevig is aan bewegingsartefacten veroorzaakt door ademhaling en hartslag.

Bij de tweede benadering wordt de klier chirurgisch blootgesteld op een huidflap met intact vaatstelsel en gestabiliseerd op de microscooptafel met afstandhouders 4,9,13. Een deel van de klier wordt zo effectief gescheiden van de buikwand en bewegingsartefacten worden geminimaliseerd. In de meeste gevallen wordt het blootgestelde parenchym direct op het dekglaasje geplaatst met de buikzijde van de muis naar beneden op een omgekeerde microscoop. In een recente wijziging werd de muis op zijn rug op een rechtopstaande microscoop geplaatst en werd de blootgestelde klier beschermd in een met vloeistof gevulde cel die was verzegeld met een dekglaasje2. Deze laatste configuratie geeft toegang tot het parenchymale oppervlak voor experimentele manipulatie tijdens beeldvorming. Resolutie tot <1 μm maakt in beide gevallen analyse van intracellulaire processen mogelijk, zoals geïllustreerd door het volgen van lipidedruppeltjes (LD's) in borstepitheelcellen9.

Het huidige protocol beschrijft een eenvoudige methode voor de intravitale beeldvorming van borstepitheelcellen op subcellulair niveau, met behulp van de biogenese, het transport en de secretie van LD's tijdens borstvoeding als voorbeeld. Deze benadering is breed toepasbaar op vele andere processen, waaronder het transport en de afscheiding van melkeiwitten14, de transcytose van eiwitten van de serosale zijde van het epitheel naar het alveolaire lumen15,16 en de hermodellering van de klier tijdens involutie17,18.

Muizen die een fluorescerend eiwit tot expressie brengen, hebben de voorkeur voor de meeste intravitale experimenten om de selectie van geschikte gebieden voor beeldvorming te vergemakkelijken en als morfologische referentiemarker. Er is een breed scala aan geschikte transgene en knock-in-muizen beschikbaar, die fluorescerende eiwitmarkers tot expressie brengen in cellulaire compartimenten, cytoskeletelementen, membranen en organellen19. In de gegeven voorbeelden werd de EGFPcyto FvB-muis gebruikt, waarin versterkt groen fluorescerend eiwit (EGFP) is gericht op het cytoplasma in de meeste cellen20 (aangeduid als EGFP-cyto), en de C57BL/6J Tomaat (mT/mG) muis21, een dubbele fluorescerende Cre-lijn die codeert voor tdTomato- en EGFP-genen. EGFP-expressie wordt mogelijk gemaakt door Cre-gemedieerde excisie van het tdTomato-gen. Beide fluoroforen zijn in de meeste cellen gericht op het plasmamembraan via een sequon die is afgeleid van het MARCKS-eiwit21. In dit werk worden muizen die de rode tdTomato-fluorofoor tot expressie brengen, aangeduid met tdTomato-membr (mT), en muizen die EGFP tot expressie brengen, na excisie van het tdTomato-gen worden aangeduid met EGFP-membr (mG).

Muizen hebben vijf paar borstklieren aan weerszijden van de ventrale middellijn, drie in het thoracale gebied (genummerd 1-3) en twee in het liesgebied (genummerd 4-5) (Figuur 1A). Voor ISMic zijn de liesklieren het meest toegankelijk en het gemakkelijkst te stabiliseren, omdat ze het verst verwijderd zijn van wereldwijde bewegingen die verband houden met ademhaling en hartslag in de thorax.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dierproeven zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van het Center for Cancer Research, het National Cancer Institute, de National Institutes of Health in overeenstemming met de gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren van de Amerikaanse National Research Council, het beleid van de Amerikaanse volksgezondheidsdienst inzake humane zorg en het gebruik van proefdieren, en de Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren. Voor dit werk werden de klieren nummer 4 van vrouwelijke primipare muizen (leeftijd 4-5 maanden, dag 10 van de lactatie) chirurgisch geprepareerd in de rechterrugligging (Figuur 1A).

1. Voorbereiding van dieren

  1. Weeg de muis op een bovenlader om de benodigde hoeveelheid verdoving te berekenen.
  2. Houd tijdens en na het aanbrengen van anesthetica de lichaamstemperatuur op peil door de muis op een opwarmkussen te plaatsen.
  3. Verdoof de muis door korte blootstelling aan isofluraan (3,0%-3,5%) in een met zuurstof verzadigde ademhalingskamer (zie Materiaaltabel) gedurende 1-2 minuten, gevolgd door een intraperitoneale injectie van een mengsel van 100 mg/kg ketamine en 10 mg/kg xylazine.
  4. Houd de dieren onder een diepe anesthesie tijdens zowel de operatie als de beeldvorming door verder getitreerde doses xylazine en ketamine (de helft tot een kwart van de aanvangsdosis zoals beschreven in stap 1.3) via een verblijfskatheter (zie stap 3.4) om de 45 minuten of zo aan te brengen, indien nodig.
    OPMERKING: Een optimaal anesthesievlak wordt het gemakkelijkst gehandhaafd door elke 10-20 minuten te controleren op ooglid- en teenknijpreflexen. De temperatuur van bewuste muizen is 36,5-38 °C, die onder narcose daalt tot 34,5 °C.
  5. Kruisbestuiving van de pups22 als er donormuizen in een vergelijkbaar stadium van de lactatie beschikbaar zijn; euthanaseer anders het nest.
    OPMERKING: Pups <10 dagen oud moeten worden geëuthanaseerd door blootstelling aan 3,0% isofluraan gevolgd door onthoofding. Pups ≥10 dagen oud moeten worden geëuthanaseerd via CO2 -inhalatie, gevolgd door cervicale dislocatie.

2. Chirurgische ingreep

  1. Houd de muis tijdens de operatie warm op een warmhoudkussen. Scheer de vacht van de huid rond de borstklieren nummer 4 en 5 (rugligging, rechterkant) met een elektrisch handscheerapparaat. Reinig het geschoren gebied met drie afwisselende betadine- en alcoholscrubs.
  2. Veeg alle chirurgische instrumenten af met 70% alcohol. Maak een incisie in de middellijn van ~1 cm dicht bij de vierde tepel door met een pincet in de huid te knijpen en de opstaande huid met een scherpe schaar af te knippen. Maak cirkelvormige incisies rond de klier in zowel craniale als caudale richting en pel de huid voorzichtig weg van de buik. Houd de blootgestelde huid vochtig met fysiologische zoutoplossing.
  3. Om bloedverlies tot een minimum te beperken, sluit u eventuele prominente bloedvaten af met een draagbare cauterizer (zie Materiaaltabel) voordat u ze doorsnijdt. Exogeen bloed moet onmiddellijk worden verwijderd met fysiologische zoutoplossing om later verlies van optische resolutie te voorkomen.
  4. Verwijder oppervlakkig bind- en vetweefsel door de oppervlaktelaag voorzichtig te plagen met een fijne pincet.
  5. Houd de blootgestelde klier vochtig met fysiologische zoutoplossing en bescherm de buikwand met gel en semi-transparante, flexibele, thermoplastische film (zie Materiaaltabel).
    OPMERKING: Stappen 2.2-2.5 creëren een huidflap met een deel van de klier en het bijbehorende vaatstelsel gescheiden van de buikwand (Figuur 1Bi-iv).
  6. Behandel de klier indien nodig met exogene middelen, bijv. farmacologische middelen of organelspecifieke kleurstoffen, door de blootgestelde klier tijdens de operatie te baden.
    OPMERKING: In de gegeven voorbeelden werden LD's in een EGFPcyto- of EGFPmembr (mG) muis gelabeld met 1,0 ml boor-dipyrromethene (BODIPY)665/676 (10 mM stockoplossing in dimethylsulfoxide verdund 1 tot 1,000 keer in zoutoplossing en aangebracht gedurende <1 uur) en in de tdTomato-membr (mT) of EGFP membr (mG) muis, met 0,5 ml monodansylpentaan23 (0,1 M stockoplossing in dimethylsulfoxide verdund 1 tot 1.000 keer in zoutoplossing en gedurende 5 minuten aangebracht).

3. Voorbereiding van de beeldvorming

  1. Plaats de muis voorzichtig met de buik naar beneden op een verwarmde (37 °C) omgekeerde microscooptafel, zodat de huidflap zich uitstrekt tot op het centrale dekglas (30 mm) (Figuur 1Biv). Bescherm de blootgestelde delen met een dun laagje gel.
  2. Stabiliseer de huidflap met op maat gemaakte afstandhouders om de klier te beschermen tegen bewegingsartefacten veroorzaakt door ademhaling en hartslag. Om dit te bereiken, plaatst u een inkeping afstandhouder gemaakt van drie getapete katoenen stokken (Figuur 1Ci) tussen de huidflap en de lichaamswand en plakt u de achterpoot en staart vast aan de tafel achter de afstandhouder (Figuur 1Bv).
  3. Voorkom dat de huidflap verschuift tijdens de beeldvorming door een plastic afdekking (Figuur 1Cii) aan beide uiteinden stevig vast te plakken op de opening van de objecttafel (Figuur 1Bv).
  4. Breng een subcutane verblijfskatheter in onder de dorsale huid die is bevestigd aan een slange, spuit en pomp (zie Materiaaltabel).
  5. Bevestig dat de huidflap stabiel is met voldoende bloedstroom door middel van conventionele fluorescentiemicroscopie (Figuur 1Bvi).
  6. Bedek de muis met sponsgaas (zie Materiaaltabel) om warm te blijven tijdens de beeldvorming,
    OPMERKING: Stappen 3.1-3.5 zijn het meest cruciaal om ervoor te zorgen dat video's met een hoge resolutie worden gemaakt die geschikt zijn voor kwantitatieve analyse. Het heeft geen zin om verder te gaan dan dit stadium, tenzij de stabiliteit van het weefsel is bevestigd.

4. Microscopie

  1. Voor conventionele confocale microscopie van de EGFPcyto of EGFPmembr (mG) muis gelabeld met BODIPY665/676 (Figuur 2, Video 1 en Video 2), gebruikt u een omgekeerde microscoop die is uitgerust met een voorverwarmd 60x olie-onderdompelingsobjectief, gehouden op 37 °C (zie Tabel met materialen).
    1. Detecteer EGFP en BODIPY665/676 afzonderlijk met respectievelijk 488 en 633 lasers; voor EGFP, excitatie 488 nm en emissie 560 nm, met banddoorlaatfilter BA 505-605; voor BODIPY665/676, excitatie 633 nm en emissie 668 nm, met banddoorlaatfilter BA 655-755.
    2. Verzamel afbeeldingen door middel van een lijnscan met een snelheid van 4 of 8 μs/pixel (512 x 512 pixels; 12 bits per pixel) om de 5 s of 10 s gedurende 1-2 uur en sla ze op als TIFF-bestanden. Onderhoud gescande gebieden handmatig in het frame door te corrigeren voor x/y-afwijking tijdens de beeldvormingscyclus. Maak 3D-beelden van z-scans met behulp van software die aan de microscoop is gekoppeld (zie Tabel met materialen).
  2. Gebruik voor twee-fotonmicroscopie van de EGFP-membr (mG) muis gelabeld met monodansylpentaan (Figuur 3, Video 3), een omgekeerde microscoop uitgerust met een afstembare laser en een 37 °C voorverwarmd 30x objectief (zie Tabel met materialen).
    1. Prikkel de klier bij 910 nm en detecteer monodansylpentaan en EGFP met twee GaAs-detectoren, met behulp van 410-460 nm en 495-540 nm banddoorlaatfilters voor respectievelijk blauwe en groene emissies.
    2. Verzamel afbeeldingen door middel van een lijnscan met een snelheid van 2 μs/pixel (320 x 320 pixels; 16 bits per pixel) en sla ze op als OIR-bestanden. Gescande gebieden in het frame handmatig onderhouden door x/y-drift tijdens de beeldvormingscyclus te corrigeren. Maak 3D-beelden van z-scans met behulp van software die aan de microscoop is gekoppeld.
  3. Voor twee-fotonmicroscopie van de tdTomatomembr (mT) muis gelabeld met monodansylpentaan (Figuur 4, Video 4), gebruikt u een omgekeerde microscoop met afstembare lasers en een 37 °C voorverwarmd 63x objectief (zie Tabel met materialen).
    1. Exciteer monsters op 800 nm en 1.060 nm tegelijkertijd en detecteer monodansylpentaan met een HyD hybride detector ingesteld op emissie 418-471 nm en TdTomato met een andere HyD hybride detector ingesteld op emissie 595-667 nm.
    2. Verzamel de afbeeldingen door middel van een lijnscan met vier lijnen van gemiddeld 200 Hz (512 x 512 pixels; 12 bits per pixel) en sla ze op als LIF-bestanden. Gescande gebieden in het frame handmatig onderhouden door x/y-drift tijdens de beeldvormingscyclus te corrigeren. Construeer 3D-beelden van z-scans met behulp van software die aan de microscoop is gekoppeld.

5. Euthanasie

  1. Euthanaseer de muizen aan het einde van de beeldvorming via CO2 -inhalatie volgens institutioneel goedgekeurde protocollen.

6. Creatie van real-time video's

  1. Converteer tijdsequenties naar TIFF-bestanden en vervolgens naar video's met behulp van de juiste software (zie Materiaaltabel).
    OPMERKING: Kwantitatieve analyse van specifieke video's valt buiten het bestek van dit document en vereist specifieke methoden voor de oplossing van specifieke problemen. Zie bijvoorbeeld Ebrahim et al.24 voor de rol van actinomyosinecomplexen bij exocytose van speeksel uit de speekselklier, Meyer et al.25 voor de dynamiek van galsecretie uit de lever, en Masedunskas et al.9 voor analyse van LD-secretie uit borstepitheelcellen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Melk wordt uitgescheiden door gepolariseerde alveolaire epitheelcellen, die zich tijdens de zwangerschap onderscheiden van de knoppen van een uitgebreide ductulaire boom26 (Figuur 2A). Voorlopers voor melksynthese worden geassimileerd via basale/laterale membranen en voltooide producten worden uitgescheiden over het apicale oppervlak in een centrale "melkruimte". De basale zijde van elke alveolus is bedekt met een stellate reeks myoep...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Of een een- of multifotonenmicroscoop moet worden gebruikt, hangt af van de vragen die worden gesteld, de aard en locatie van het af te beelden weefsel en de vereiste resolutie. Multifotonmicroscopen zijn gebaseerd op het genereren van twee of meer laagenergetische fotonen in het nabij-infrarood, die weefsels tot een grotere diepte kunnen doordringen met minder fototoxiciteit dan microscopen met één foton29,30. Bovendien wordt de...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Geen van de auteurs heeft tegenstrijdige belangen te verklaren.

Dankbetuigingen

De auteurs bedanken Sherry Rausch en Samri Gebre (National Cancer Institute, NIH) voor het beheer en de verzorging van dieren en James Mather voor hun hulp bij het produceren van een reeks plastic afstandhouders. Dit onderzoek werd [deels] ondersteund door het Intramural Research Program van de NIH.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
488 laserMelles-Griot-CW  laser 50 mW
60x PLAPON oil immersion objective (NA 1.42)Olympus1-U2B933Lens Confocal microscope
633 laserMelles-Griot-CW He-Ne laser 12 mW
63x objective (NA 1.40, HC PL APO CS2)Leica11506350Lens Two-photon microscope
BA 410-460 nmChroma-Band-pass filter
BA 495-540 nmChroma-Band-pass filter
BA 505-605 nmChroma-Band-pass filter
BA 655-755 nmChroma-Band-pass filter
Boron-dipyrromethane (BODIPY) 665/676Thermo Fisher ScientificB3932Lipid peroxiation sensor
Carbomer-940Snowdrift Farm739601480651Gel
CatheterTerumoSV27ELWinged infusion sets 
Cauterizer Braintree Scientific, IncGEM 5917Cautery system
CMV-Cre mouse Jackson lab006054Mouse line
CoverslipBioptechs-30mm diameter coverlip for inverted microscope
Curity 4x4 inch all purpose sponge gauzeCovidien9024Sponge
EGFPcyto mouseJackson lab003291Mouse line
Fiji/ImageJ softwareOpen source-Free software tool
Fine forcepsBraintree Scientific, IncFC003 8Tissue forceps
Fluoview 1000 microscopeOlympusFV1000Confocal microscope
FluoView softwareOlympus-Confocal microscope and Two-photon microscope
Hand-held electric razorBraintree Scientific, IncCLP-8786-451ACordless clipper
Heat padBraintree Scientific, IncDPIPHeat pad for animals
HyD detectorsLeica-Leica 4Tune spectral detector
Imaris softwareBitplane / Oxford instruments-Commercial software tool
Ingisht X3 tunable laserSpectra PhysicsInsight X3Tunable Pulse-Laser
IsofluraneVetOne13985-046-40Anesthetic
Ketamine VetOne13985-702-10Anesthetic
LAS X SoftwareLeica-Two-photon microscope software tool
Mai-Tai tunable laserSpectra PhysicsMai-TaiLaser
MetaMorphMolecular Devices-Commercial software tool
Monodansylpentane AUTODOTAbceptaSm1000aLipid droplet dye
MPE-RS microscopeOlympusIX70Two-photon microscope
mT/mG mouseJackson lab007676Mouse line
Objective heaterBioptechs150819Objective heater for both confocal and two-photon microscopes
Oxygen-saturated respiration chamberPatterson Scientific78933385, SAS3 and EVAC4Gas Anesthesia and evacuation system 
ParafilmHeathrow ScientificHS234526BSemi-transparent, flexible, thermoplastic film
PMT detectorOlympus-Descanned   detectors
PMT detectorLSM-TechnologyCustom builtNon-Descanned Detectors
PumpHarvard Apparatus703602, 704402Nanomite injector and controller
SalineQuality Biological114-055-721EANormal saline
Sharp blunt-ended scissorsBraintree Scientific, IncSCT-S 508Surgical scissors
SyringeCovidien22-257-1501mL tuberculin syringe
TCS SP8 Dive Spectral microscopeLeicaSP8Two-photon microscope
Tweezers Braintree Scientific, IncFC032Tissue forceps
Xylazine VetOne13985-704-10Anesthetic

Referenties

  1. Scheele, C. L. G. J., et al. Identity and dynamics of mammary stem cells during branching morphogenesis. Nature. 542 (7641), 313-317 (2017).
  2. Dawson, C. A., Mueller, S. N., Lindeman, G. J., Rios, A. C., Visvader, J. E. Intravital microscopy of dynamic single-cell behavior in mouse mammary tissue. Nature Protocols. 16 (4), 1907-1935 (2021).
  3. Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
  4. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Dynamic, long-term in vivo imaging of tumor-stroma interactions in mouse models of breast cancer using spinning-disk confocal microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. (2), (2011).
  5. Ellenbroek, S. I. J., van Rheenen, J. Imaging hallmarks of cancer in living mice. Nature Reviews Cancer. 14 (6), 406-418 (2014).
  6. Dawson, C. A., et al. Tissue-resident ductal macrophages survey the mammary epithelium and facilitate tissue remodelling. Nature Cell Biology. 22 (5), 546-558 (2020).
  7. Ebrahim, S., Weigert, R. Intravital microscopy in mammalian multicellular organisms. Current Opinion in Cell Biology. 59, 97-103 (2019).
  8. Masedunskas, A., Weigert, R., Mather, I. H. Advances in Intravital Microscopy. Weigert, R. , Weigert) Springer-Verlag. Netherlands. 187-204 (2014).
  9. Masedunskas, A., Chen, Y., Stussman, R., Weigert, R., Mather, I. H. Kinetics of milk lipid droplet transport, growth, and secretion revealed by intravital imaging: lipid droplet release is intermittently stimulated by oxytocin. Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 935-946 (2017).
  10. Stevenson, A. J., et al. Multiscale imaging of basal cell dynamics in the functionally-mature mammary gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (43), 26822-26832 (2020).
  11. Shan, S., Sorg, B., Dewhirst, M. W. A novel rodent mammary window of orthotopic breast cancer for intravital microscopy. Microvascular Research. 65 (2), 109-117 (2003).
  12. Zomer, A., et al. Brief report: Intravital imaging of cancer stem cell plasticity in mammary tumors. Stem Cells. 31 (3), 602-606 (2013).
  13. Harper, K. L., et al. Mechanism of early dissemination and metastasis in Her2+ mammary cancer. Nature. 540 (7634), 588-592 (2016).
  14. Burgoyne, R. D., Duncan, J. S. Secretion of milk proteins. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 3 (3), 275-286 (1998).
  15. Monks, J., Neville, M. C. Albumin transcytosis across the epithelium of the lactating mouse mammary gland. Journal of Physiology London. 560, 267-280 (2004).
  16. Boisgard, R., Chanat, E., Lavialle, F., Pauloin, A., Ollivier-Bousquet, M. Roads taken by milk proteins in mammary epithelial cells. Livestock Production Science. 70 (1-2), 49-61 (2001).
  17. Green, K. A., Lund, L. R. ECM degrading proteases and tissue remodelling in the mammary gland. Bioessays. 27 (9), 894-903 (2005).
  18. Lund, L. R., et al. Two distinct phases of apoptosis in mammary gland involution: proteinase-independent and -dependent pathways. Development. 122 (1), 181-193 (1996).
  19. Abe, T., Fujimori, T. Reporter mouse lines for fluorescence imaging. Develoment Growth and Differentiation. 55 (4), 390-405 (2013).
  20. Hadjantonakis, A. K., Gertsenstein, M., Ikawa, M., Okabe, M., Nagy, A. Generating green fluorescent mice by germline transmission of green fluorescent ES cells. Mechanisms of Development. 76 (1-2), 79-90 (1998).
  21. Mazumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
  22. Fostering litters. The Jackson Laboratory. , Available from: https://www.jax.org/jax-mice-and-services/customer-support/technical-support/breeding-and-husbandry-support/general-husbandry-tips# (2022).
  23. Yang, H. -J., Hsu, C. -L., Yang, J. -Y., Yang, W. -Y. Monodansylpentane as a blue-fluorescent lipid-droplet marker for multi-color live-cell imaging. PloS One. 7 (3), 32693(2012).
  24. Ebrahim, S., et al. Dynamic polyhedral actomyosin lattices remodel micron-scale curved membranes during exocytosis in live mice. Nature Cell Biology. 21 (8), 933-939 (2019).
  25. Meyer, K., et al. A predictive 3D multi-scale model of biliary fluid dynamics in the liver lobule. Cell Systems. 4 (3), 277-290 (2017).
  26. Macias, H., Hinck, L. Mammary gland development. Wiley Interdisciplinary Reviews Developmental Biology. 1 (4), 533-557 (2012).
  27. Mather, I. H., Masedunskas, A., Chen, Y., Weigert, R. Symposium review: Intravital imaging of the lactating mammary gland in live mice reveals novel aspects of milk-lipid secretion. Journal of Dairy Science. 102 (3), 2760-2782 (2019).
  28. Caspi, A., Granek, R., Elbaum, M. Enhanced diffusion in active intracellular transport. Physical Review Letters. 85, 5655-5658 (2000).
  29. Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature Biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
  30. Weigert, R., Porat-Shliom, N., Amornphimoltham, P. Imaging cell biology in live animals: Ready for prime time. Journal of Cell Biology. 201 (7), 969-979 (2013).
  31. So, P. T. C. Two-photon fluorescence light microscopy. Encyclopedia of Life Sciences. , 1-5 (2002).
  32. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5563(2011).
  33. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Preparation of mice for long-term intravital imaging of the mammary gland. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5562(2011).
  34. Nishinakagawa, H., Mochizuki, K., Nishida, S. On the blood supply to the mammary glands of the mouse, rat, hamster and guinea-pig. Japanese Journal of Zoological Science. 39 (7), 283-291 (1968).
  35. Parslow, A., Cardona, A., Bryson-Richardson, R. J. Sample drift correction following 4D confocal time-lapse imaging. Journal of Visualized Experiments. (86), e51086(2014).
  36. Palade, G. Intracellular aspects of the process of protein synthesis. Science. 189 (4200), 347-358 (1975).
  37. Heald, C. W., Saacke, R. G. Cytological comparison of milk protein synthesis of rat mammary tissue in vivo and in vitro. Journal of Dairy Science. 55 (5), 621-628 (1972).
  38. Hunziker, W., Kraehenbuhl, J. P. Epithelial transcytosis of immunoglobulins. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 3 (3), 287-302 (1998).
  39. Messal, H. A., van Rheenen, J., Scheele, C. L. G. J. An intravital microscopy toolbox to study mammary gland dynamics from cellular level to organ scale. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 26 (1), 9-27 (2021).
  40. Teter, B. B., Sampugna, J., Keeney, M. Milk fat depression in C57Bl/6J mice consuming partially hydrogenated fat. Journal of Nutrition. 120 (8), 818-824 (1990).
  41. Russell, T. D., et al. Transduction of the mammary epithelium with adenovirus vectors in vivo. Journal of Virology. 77 (10), 5801-5809 (2003).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Intravitale microscopiesubcellulaire beeldvormingsecretie van lipidedruppelsconfocale microscopietweefotonmicroscopiesecretoire epitheelcellenEGFP-muizenapocriene secretietime-lapse beeldvorming
Intravitale subcellulaire microscopie van de borstklier
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.