Het combineren van virale vectortransductie en hersenzuivering met behulp van de CLARITY-methode maakt het mogelijk om tegelijkertijd een groot aantal neuronen en astrocyten te onderzoeken.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Onderzoek naar ruimtelijke interactie tussen astrocyten en neuronen in vrijgemaakte hersenen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het combineren van virale vectortransductie en weefselzuivering met behulp van de CLARITY-methode maakt het mogelijk om tegelijkertijd verschillende soorten hersencellen en hun interacties te onderzoeken. Virale vectortransductie maakt het mogelijk om verschillende celtypen in verschillende fluorescentiekleuren binnen hetzelfde weefsel te markeren. Cellen kunnen genetisch worden geïdentificeerd door activiteit of projectie. Met behulp van een aangepast CLARITY-protocol is de potentiële steekproefomvang van astrocyten en neuronen met 2-3 ordes van grootte gegroeid. Het gebruik van CLARITY maakt het mogelijk om volledige astrocyten, die te groot zijn om in hun geheel in plakjes te passen, en het onderzoek van de somata met al hun processen mogelijk. Daarnaast biedt het de mogelijkheid om de ruimtelijke interactie tussen astrocyten en verschillende neuronale celtypen te onderzoeken, namelijk het aantal piramidale neuronen in elk astrocytisch domein of de nabijheid tussen astrocyten en specifieke remmende neuronpopulaties. Dit artikel beschrijft in detail hoe deze methoden moeten worden toegepast.
Inleiding
In de afgelopen jaren is de kennis van astrocytenfunctie en hoe ze interageren met neuronale circuits dramatisch toegenomen. Astrocyten kunnen de plasticiteitbeïnvloeden 1,2, helpen bij neuronaal postinjuryherstel 3,4 en zelfs de novo neuronale potentiëring induceren, waarbij recente studies het belang van astrocyten in geheugenverwerving en beloning aantonen, voorheen beschouwd als puur neuronale functies 5,6,7 . Een kenmerk van bijzonder belang in a....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Experimentele protocollen werden goedgekeurd door de Hebrew University Animal Care and Use Committee en voldeden aan de richtlijnen van het National Institute of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.
1. Virale vectortransductie
OPMERKING: Virale vectortransductie wordt gebruikt om fluoroforen in de hersenen tot expressie te brengen.
- Gebruik een atlas (bijv. Allen Brain Atlas) om de relevante coördinatie van het doelgebied te lokaliseren.
OPMERKING: 3D-atlassen zijn online te vinden (bijv. http://connectivity.brain-map.org/3d-viewer). - Injecteer met behulp ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Succesvolle opruiming van dikke hersenweefselplakken resulteert in een nieuwe reeks vragen die kunnen worden gesteld met betrekking tot de eigenschappen van grote celpopulaties in tegenstelling tot de eigenschappen van afzonderlijke cellen of naburige groepen cellen. Om succesvolle resultaten te bereiken, moet men zich strikt houden aan het CLARITY-protocol, omdat er een breed scala aan parameters is waarmee rekening moet worden gehouden om de variantie tussen monsters te verminderen (bijv. Percentage van de helderheid, .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Weefselverwijderingsmethoden vormen een revolutionair hulpmiddel in hersenonderzoek en nodigen vragen uit die voorheen niet konden worden gesteld. Van het richten op de eigenschappen van een kleine groep cellen, een enkele cel of zelfs een enkele synaps, maakt CLARITY nu het richten van totale celpopulaties of connectiviteitsfuncties op lange afstand mogelijk door relevante fluoroforen te gebruiken.
De uitkomst van de combinatie fluorofoorexpressie en CLARITY-procedure is niet binair; veel fac.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit project heeft financiering ontvangen van de European Research Council (ERC) in het kader van het Horizon 2020 onderzoeks- en innovatieprogramma van de Europese Unie (subsidieovereenkomst nr. 803589), de Israel Science Foundation (ISF-subsidie nr. 1815/18) en de Canada-Israël-subsidies (CIHR-ISF, subsidie nr. 2591/18). We bedanken Nechama Novick voor het becommentariëren van het hele manuscript.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| AAV1-GFAP::TdTomato | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viraal vector gebruikt om astrocyten te detecteren | |
| AAV5-CaMKII::eGFP | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viraal vector gebruikt om neuronen te detecteren | |
| AAV5-CaMKII::H2B-eGFP | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viraal vector gebruikt om neuronale kernen te detecteren | |
| AAV5-CaMKII::TdTomato | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viraal vector gebruikt om neuronen te detecteren | |
| Acryamide (40%) | Bio-rad | #161-0140 | |
| Bisacrylamide (2%) | Bio-rad | #161-0142 | |
| Borzuur | Sigma | #B7901 | Moleculaire massa - 61,83 g/mol |
| Confocale microscoop, scannen, FV1000 | Olympus | 4x objectief (UPlanSApo, 0,16 NA) | |
| Imaris software | Bitplane, UK | Een software die 3D-analyse van beelden mogelijk maakt | |
| NaOH | Sigma | #S5881 | |
| PBS | |||
| PFA 4% | EMS | #15710 | |
| RapiClear | SunJin lab | #RC147002 | |
| RapiClear CS | SunJin lab | #RCCS002 | |
| SDS | Sigma | #L3771 | |
| SyGlass software | Een software die 3D-analyse van beelden mogelijk maakt met behulp van virtual reality | ||
| Tris base 1 M | Bio-rad | #002009239100 | Moleculaire massa - 121,14 g/mol |
| Triton X-100 | ChemCruz | #sc-29112A | |
| Twee foton microscoop | Neurolabware | Ti:saffier laser (Chameleon Discovery TPC, Coherent), GaAsP foto-multiplier tubes (Hamamatsu, H10770-40), bandpass filter (Semrock), water immersie 16x objectief (Nikon, 0,8 NA) | |
| VA-044 Initiator | Wako | #011-19365 |
Referenties
- Perea, G., Navarrete, M., Araque, A. Tripartite synapses: astrocytes process and control synaptic information. Trends in Neurosciences. 32 (8), 421-431 (2009).
- Ciappelloni, S., et al. Aquaporin-4 sur....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
