Onderzoek naar ruimtelijke interactie tussen astrocyten en neuronen in vrijgemaakte hersenen

Samenvatting

Het combineren van virale vectortransductie en hersenzuivering met behulp van de CLARITY-methode maakt het mogelijk om tegelijkertijd een groot aantal neuronen en astrocyten te onderzoeken.

Samenvatting

Het combineren van virale vectortransductie en weefselzuivering met behulp van de CLARITY-methode maakt het mogelijk om tegelijkertijd verschillende soorten hersencellen en hun interacties te onderzoeken. Virale vectortransductie maakt het mogelijk om verschillende celtypen in verschillende fluorescentiekleuren binnen hetzelfde weefsel te markeren. Cellen kunnen genetisch worden geïdentificeerd door activiteit of projectie. Met behulp van een aangepast CLARITY-protocol is de potentiële steekproefomvang van astrocyten en neuronen met 2-3 ordes van grootte gegroeid. Het gebruik van CLARITY maakt het mogelijk om volledige astrocyten, die te groot zijn om in hun geheel in plakjes te passen, en het onderzoek van de somata met al hun processen mogelijk. Daarnaast biedt het de mogelijkheid om de ruimtelijke interactie tussen astrocyten en verschillende neuronale celtypen te onderzoeken, namelijk het aantal piramidale neuronen in elk astrocytisch domein of de nabijheid tussen astrocyten en specifieke remmende neuronpopulaties. Dit artikel beschrijft in detail hoe deze methoden moeten worden toegepast.

Inleiding

In de afgelopen jaren is de kennis van astrocytenfunctie en hoe ze interageren met neuronale circuits dramatisch toegenomen. Astrocyten kunnen de plasticiteit^{beïnvloeden 1,2}, helpen bij neuronaal postinjuryherstel ^3,4 en zelfs de novo neuronale potentiëring induceren, waarbij recente studies het belang van astrocyten in geheugenverwerving en beloning aantonen, voorheen beschouwd als puur neuronale functies ^5,6,7 . Een kenmerk van bijzonder belang in astrocytenonderzoek is de ruimtelijke ordening van de cellen, die unieke ruimtelijke organisaties in de hippocampus en andere hersenstructuren behouden ^8,9,10. In tegenstelling tot de neuronale dendrieten die zich verstrengelen tussen cel somata, bewonen hippocampale astrocyten visueel te onderscheiden gebieden met lichte overlap tussen hun processen, waardoor verschillende domeinen^ontstaan 8,11,12,13. Het bewijs dat de deelname van astrocyten aan neuronale circuits ondersteunt niet het gebrek aan gedetailleerde anatomische beschrijving van dergelijke populaties en de neuronen in hun domeinen¹⁴.

Virale vectortransductieprocedures, samen met transgene dieren (TG), zijn gepopulariseerd als een toolset om hersenstructuren, functies en celinteracties te onderzoeken^15,16. Het gebruik van verschillende promotors maakt het mogelijk om specifieke cellen te richten op basis van hun genetische eigenschappen, activeringsniveaus^17,18 of projectiedoelen. Verschillende virussen kunnen verschillende gekleurde fluoroforen uitdrukken in verschillende populaties. Een virus kan worden gecombineerd met de endogene expressie van fluoroforen in TG, of TG-dieren kunnen worden gebruikt zonder dat er virussen nodig zijn. Deze technieken worden veel gebruikt voor neuronale markering en sommige laboratoria zijn ze gaan gebruiken met modificaties die gespecialiseerd zijn voor het richten op andere celtypen, zoals astrocyten ^5,9,19.

De CLARITY-techniek, voor het eerst beschreven in 2013^20,21, maakt de studie van dikke hersenplakken mogelijk door de hele hersenen transparant te maken terwijl de microscopische structuren intact blijven. Door de combinatie van de twee methoden - virale vectortransductie en weefselverwijdering - is nu de mogelijkheid beschikbaar om de ruimtelijke interacties tussen verschillende celtypepopulaties te onderzoeken. De meeste astrocyten-neuron interactiestudies werden uitgevoerd op dunne hersenplakken, wat resulteerde in afbeeldingen van onvolledige astrocyten vanwege hun grote domeinen, waardoor het aantal geanalyseerde cellen radicaal werd beperkt. Het gebruik van de CLARITY-techniek maakt eencellige resolutiekarakterisering van celpopulaties in grootschalige volumes tegelijkertijd mogelijk. Het afbeelden van fluorescerend gelabelde celpopulaties in heldere hersenen levert geen synaptische resolutie op, maar maakt een grondige karakterisering van de ruimtelijke interacties tussen astrocyten en een verscheidenheid aan neuronale celtypen mogelijk.

Om die reden hebben we deze state-of-the-art technieken gebruikt om de eigenschappen van astrocyten in de dorsale CA1 te onderzoeken, waarbij we alle lamina (Stratum Radiatum, piramidale laag en Stratum Oriens) in beeld brengen. We hebben tienduizenden astrocyten gemeten (met virale penetrantie van >96%⁵), waarbij we de informatie van de hele astrocytische populatie rond CA1 hebben geanalyseerd. Met efficiënte penetrantie van de neuronale markers konden we de interacties registreren tussen de hele populatie van CA1-astrocyten en de vier soorten neuronale cellen- parvalbumine (PV), somatostatine (SST), VIP-remmende neuronen en exciterende piramidale cellen⁹.

Verschillende experimenten werden uitgevoerd met behulp van een combinatie van fluorescentie van TG-dieren en verschillend gekleurde virale vectoren (alle remmende cellen), terwijl anderen (exciterend) twee virale vectoren gebruikten die verschillende fluoroforen onder verschillende promotors tot expressie brachten⁹. Dit artikel presenteert een gedetailleerd protocol, inclusief het taggen van de gewenste cellen in de hersenen, het transparant maken van de hersenen met behulp van een aangepaste CLARITY-procedure, evenals beeldvorming en analyse van volledige hersenstructuren, met behulp van verschillende procedures en software.

Protocol

Experimentele protocollen werden goedgekeurd door de Hebrew University Animal Care and Use Committee en voldeden aan de richtlijnen van het National Institute of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.

1. Virale vectortransductie

OPMERKING: Virale vectortransductie wordt gebruikt om fluoroforen in de hersenen tot expressie te brengen.

1. Gebruik een atlas (bijv. Allen Brain Atlas) om de relevante coördinatie van het doelgebied te lokaliseren.
   OPMERKING: 3D-atlassen zijn online te vinden (bijv. http://connectivity.brain-map.org/3d-viewer).
2. Injecteer met behulp van stereotactische chirurgie de virale vectoren in de relevante hersenstructuur. Zie⁹ voor een gedetailleerd protocol.
3. Wacht 3-6 weken op fluorofoorexpressie.
   OPMERKING: Een korte periode is voldoende als alleen cellichamen moeten worden gemarkeerd. Een lange periode van tijd zal nodig zijn als de axonale projecties relevant zijn voor de vraag, omdat het langer duurt voordat de fluoroforen zich uitdrukken in axonen, die enkele millimeters lang kunnen zijn.
4. Valideer vooraf de specificiteit en penetrantie van fluorofoorexpressie (zowel van virale expressie als van TG-dieren) (figuur 1A). Voordat u doorgaat met de CLARITY-procedure, wijst u ten minste één brein aan voor dunne plakjes en zorgt u ervoor dat de fluorofoorexpressie zowel sterk als specifiek is voor het doelcelkenmerk.

2. DUIDELIJKHEID

OPMERKING: Deze methode maakt de hersenen binnen 2-6 weken transparant.

1. Voer transcraniële perfusie uit op dieren met behulp van koude fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS), gevolgd door 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS. Verwijder de hersenen en bewaar het in PFA 's nachts bij 4 ° C in een buis van 50 ml of een vergelijkbare container.
   OPMERKING: Voordat transcraniële perfusie wordt uitgevoerd, moet het dier diep worden verdoofd. In de voorbeelden in dit protocol werden alle dieren verdoofd met Ketamine en Xylazine (respectievelijk 90% en 10%).
2. Vervang PFA door Hydrogel Solution (HS; zie tabel 1) gedurende 48 uur bij 4 °C.
   OPMERKING: Laat de materialen in dit stadium niet warmer worden dan de koeltemperatuur (4-8 °C), anders zal de Hydrogel polymeriseren. Het GS dat in dit protocol wordt gebruikt, bevat 2% acrylamide, in tegenstelling tot eerdere protocollen die 4% ²² of 1% ¹⁷ suggereren. Het voordeel van 2% wordt gedetailleerd beschreven in de discussiesectie. Werk bij het voorbereiden van de HS op een ijskoud oppervlak. Bewaren bij -20 °C.
3. Ontgassing
   OPMERKING: Het doel van deze fase is om alle vrije zuurstof uit het weefsel te verwijderen, omdat O₂ het polymerisatieproces verstoort. Elk_{niet-O 2-gas} kan worden gebruikt (bijv. N₂, CO₂); N₂ wordt aanbevolen.
   1. Breng de N₂ uit de tank over via een 5 mm (interne) flexibele buis, aangesloten op een naald van 19 G aan het uiteinde (figuur 1B).
   2. Maak twee kleine gaatjes (naaldbreed) in de dop van de buis: een om het gas in te brengen en de andere om de lucht de buis te laten verlaten (figuur 1C).
   3. Bevestig de buis van het N_2-gas aan de buis en vervang de gassen gedurende ongeveer 30 minuten bij kamertemperatuur (RT).
   4. Verwijder de buis en sluit de gaten onmiddellijk af met modelleerklei op elke buis (figuur 1D).
4. Breng de ontgaste verzegelde buizen gedurende 3,5 uur over in een bad van 37 °C om het HS te polymeriseren, dat een gel wordt. Zorg ervoor dat u de buizen niet schudt (figuur 1E).
5. Haal de hersenen uit de buis en verwijder voorzichtig de gepolymeriseerde gel eromheen met behulp van laboratoriumdoekjes. Zorg ervoor dat er geen resterende gel aan het oppervlak van het weefsel vastzit, omdat deze in de volgende stappen met de oplossing kan reageren, waardoor het weefselverwijderingsproces wordt geremd (figuur 1F).
   OPMERKING: Omdat de gel PFA bevatte, moet de extractie onder een zuurkast worden gedaan.
6. Snijd de hersenen als de vraag bij de hand slechts een deel ervan vereist. Verdeel het in tweeën of in zeer dikke plakken die alle interessegebieden bevatten (figuur 1G).
7. Plaats de plakjes in de First Clearing Solution (CS1, zie tabel 2) in een nieuwe container en schud gedurende 24 uur bij 37 °C bij 70 tpm.
8. Volg de hieronder beschreven stappen om de hersenen over te brengen van CS1 naar de tweede Clearing Solution (CS2, zie tabel 2).
   1. Bereid van tevoren een geperforeerde buis voor de hersenen voor (figuur 1H).
   2. Verwarm CS2 voor op 40-45 °C in een bekerglas dat groot genoeg is om de buis te bevatten. Doe dit op een kookplaat met een roerstaaf. Zorg ervoor dat de temperatuur niet 55 °C bereikt om het bleken van de tot expressie gebrachte eiwitten te voorkomen.
   3. Plaats het met CS2 gevulde bekerglas en de geperforeerde buis op een roerinrichting (een bekerglas van 2 L in figuur 1I). Stel een gematigde roersnelheid in die ervoor zorgt dat de vloeistof stroomt zonder het weefsel te vervormen.
      OPMERKING: Binnen 2-6 weken wordt het weefsel transparant (het proces begint aan de periferie en beweegt naar binnen in de richting van de centrale hersenstructuren). De beslissing wanneer het weefsel "helder genoeg" is, is aan persoonlijk oordeel. De hersenen moeten voldoende transparant zijn voor beeldvorming onder de microscoop zonder interferentie (figuur 1J niet duidelijk genoeg; Figuur 1K duidelijk genoeg). Het overschrijden van het punt waarop het weefsel helder genoeg is, kan verlies van weefselstijfheid veroorzaken.
9. Overdracht van CS2 naar PBST (0,5% Triton X-100 in PBS, zie tabel 2) in een nieuwe container bij 37 °C met licht schudden (70 rpm) gedurende 24 uur.
   OPMERKING: In de PBST wordt het weefsel witachtig (figuur 1L). De helderheid zal terugkeren (en verbeteren) wanneer deze is ingebed in de refractieve indexvergelijkingsoplossing (RIMS, zie stap 2.14).
10. Vervang de PBST door de nieuwe PBST. Nog 24 uur onder dezelfde omstandigheden (37 °C met licht schudden) bewaren.
11. Vervang PBST opnieuw door nieuwe PBST en houd 24 uur op RT.
12. Transfer naar PBS bij RT gedurende 24 uur.
13. Vervang de PBS en vertrek bij RT voor nog eens 24 uur.
14. Verwijder de hersenen van PBS en breng het 's nachts over naar RIMS bij 37 °C.
    OPMERKING: Aanvankelijk kunnen rimpelingen in de RIMS de hersenen omringen. Dit protocol is ontworpen en gevalideerd met behulp van twee specifieke commerciële RIMS (zie tabel 3). Het protocol mag echter niet verschillen bij het gebruik van andere RIMS (commercieel of zelfgemaakt).
15. Houd het weefsel nog 24 uur op RT of totdat de oplossing volledig in evenwicht is, d.w.z. wanneer het weefsel transparant wordt en de oplossing geen zichtbare rimpelingen meer bevat (figuur 1M).
16. Als het weefsel transparant is, gaat u verder met de kamervoorbereiding. Als het weefsel op dit punt wit wordt in plaats van transparant (als gevolg van aggregaten van resterende SDS-moleculen), reinigt u het monster opnieuw door stap 2.9 en 2.10 te herhalen en brengt u het weefsel gedurende enkele dagen over naar CS2 (stap 2.8), gevolgd door alle stappen tot stap 2.15.

3. Kamervoorbereiding

OPMERKING: Elk monster vereist een dia met een beeldvormingskamer waarin het monster zal worden geplaatst.

1. Plaats het monster in het midden van de dia.
2. Maak met behulp van een heet lijmpistool muren aan de randen van de dia, bijna net zo hoog als het weefsel. Zorg ervoor dat u een kleine opening (ongeveer 5 mm) laat op een van de hoeken (figuur 2A,B).
3. Breng 1-2 druppels van de RIMS aan op het monster om het bovenoppervlak vochtig te houden en te voorkomen dat er bubbels ontstaan tussen de coverslip en het weefsel.
4. Voeg onmiddellijk na het aanbrengen van de RIMS-druppels de laatste laag hete lijm toe aan de wanden (zodat ze de hoogte van de hersenen / plak bereiken) en ga onmiddellijk (terwijl de hete lijm nog vloeibaar is) naar stap 3.5.
5. Sluit de bovenkant af met een afdekplaat en plaats deze zo gelijkmatig mogelijk op de bovenkant van de nog warme hete lijmlaag (figuur 2C).
6. Vul de kamer met de RIMS door de opening in de hete lijmwanden (figuur 2D,E).
7. Sluit de opening met hete lijm. Laat geen lucht binnen (figuur 2F).
8. Als de hete lijmwanden verder reiken dan de randen van de dia, snijdt u de uitschuivende randen (figuur 2G).
9. Als het doel dat wordt gebruikt voor beeldvorming is ondergedompeld, voegt u nog eens 2-3 mm lijm toe aan de wanden boven de afdekplaat, zodat de onderdompelingsoplossing langer meegaat (figuur 2H).

4. Beeldvorming (confocaal of twee-foton)

1. Controleer of het podium de kamer kan vasthouden, omdat de dikte van de kamer enkele millimeters kan bereiken.
   OPMERKING: De confocale microscoop (zie de tabel met materialen) die in dit protocol wordt gebruikt, is bijvoorbeeld uitgerust met verschillende fasen (bijvoorbeeld cirkelvormig, rechthoekig). Welke fase ook wordt gekozen om de kamer vast te houden, is niet relevant zolang de parameters overeenkomen met de kamergroottes.
2. Werk met een doel met een voldoende werkafstand, d.w.z. een minimale werkafstand ≥3 mm, omdat het hersengebied van belang een paar millimeter diep kan zijn en de coverslip mogelijk niet volledig recht is zoals deze handmatig is geplaatst.
   OPMERKING: Als demonstratie werden de resultaten in figuur 1, video 1 en video 2 verkregen onder een microscoop met twee fotonen met behulp van een wateronderdompelingsobjectief van 16x met een werkafstand van 3 mm en een vergroting van 2,4 om een gezichtsveld van 652 x 483 μm en een z-stack met intervallen van 0,937 μm tussen de vlakken te verkrijgen.
3. Voer beeldvorming met meerdere gebieden uit, wat enkele uren of zelfs dagen kan duren. Zorg ervoor dat er voldoende vrije opslagruimte op de computer is, omdat de grootte van elk beeld kan oplopen tot tientallen gigabits.
   OPMERKING: CLARITY-beeldvorming kan resulteren in aanzienlijk meer beeldsecties in de diepte. Daarom moeten de intensiteiten die worden gebruikt om de expressie vast te leggen relatief laag zijn om overexpressie tijdens de beeldsomming te voorkomen.
4. Voor onderdompelingsdoeleinden controleert u de vloeistof routinematig tijdens het afbeelden en vult u deze indien nodig aan met extra vloeistof.
   OPMERKING: Tijdens de beeldvorming van de gegevens in video 3 werd elke 6-8 uur water aan het oppervlak van de kamer toegevoegd om verdamping tegen te gaan.
5. Nadat het beeld is verkregen, bekijkt en analyseert u het met behulp van verschillende softwarepakketten.
   OPMERKING: Aanbevolen software omvat Imaris en SyGlass voor zowel visualisatie als analyse. De precieze pijplijn voor geoptimaliseerde reconstructie van astrocyten met behulp van Imaris-software is eerder beschreven⁹. Kortom, de Imaris-kenmerken die in deze studie werden gebruikt, waren filamenten om celstructuren volledig te reconstrueren en vlekken om de positie in de ruimte van alle somata te extraheren.

Resultaten

Succesvolle opruiming van dikke hersenweefselplakken resulteert in een nieuwe reeks vragen die kunnen worden gesteld met betrekking tot de eigenschappen van grote celpopulaties in tegenstelling tot de eigenschappen van afzonderlijke cellen of naburige groepen cellen. Om succesvolle resultaten te bereiken, moet men zich strikt houden aan het CLARITY-protocol, omdat er een breed scala aan parameters is waarmee rekening moet worden gehouden om de variantie tussen monsters te verminderen (bijv. Percentage van de helderheid, ...

Discussie

Weefselverwijderingsmethoden vormen een revolutionair hulpmiddel in hersenonderzoek en nodigen vragen uit die voorheen niet konden worden gesteld. Van het richten op de eigenschappen van een kleine groep cellen, een enkele cel of zelfs een enkele synaps, maakt CLARITY nu het richten van totale celpopulaties of connectiviteitsfuncties op lange afstand mogelijk door relevante fluoroforen te gebruiken.

De uitkomst van de combinatie fluorofoorexpressie en CLARITY-procedure is niet binair; veel fac...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
AAV1-GFAP::TdTomato	ELSC Vector Core Facility (EVCF)		viraal vector gebruikt om astrocyten te detecteren
AAV5-CaMKII::eGFP	ELSC Vector Core Facility (EVCF)		viraal vector gebruikt om neuronen te detecteren
AAV5-CaMKII::H2B-eGFP	ELSC Vector Core Facility (EVCF)		viraal vector gebruikt om neuronale kernen te detecteren
AAV5-CaMKII::TdTomato	ELSC Vector Core Facility (EVCF)		viraal vector gebruikt om neuronen te detecteren
Acryamide (40%)	Bio-rad	#161-0140
Bisacrylamide (2%)	Bio-rad	#161-0142
Borzuur	Sigma	#B7901	Moleculaire massa - 61,83 g/mol
Confocale microscoop, scannen, FV1000	Olympus		4x objectief (UPlanSApo, 0,16 NA)
Imaris software	Bitplane, UK		Een software die 3D-analyse van beelden mogelijk maakt
NaOH	Sigma	#S5881
PBS
PFA 4%	EMS	#15710
RapiClear	SunJin lab	#RC147002
RapiClear CS	SunJin lab	#RCCS002
SDS	Sigma	#L3771
SyGlass software			Een software die 3D-analyse van beelden mogelijk maakt met behulp van virtual reality
Tris base 1 M	Bio-rad	#002009239100	Moleculaire massa - 121,14 g/mol
Triton X-100	ChemCruz	#sc-29112A
Twee foton microscoop	Neurolabware		Ti:saffier laser (Chameleon Discovery TPC, Coherent), GaAsP foto-multiplier tubes (Hamamatsu, H10770-40), bandpass filter (Semrock), water immersie 16x objectief (Nikon, 0,8 NA)
VA-044 Initiator	Wako	#011-19365