Onderzoek naar ruimtelijke interactie tussen astrocyten en neuronen in vrijgemaakte hersenen

Summary

Het combineren van virale vectortransductie en hersenzuivering met behulp van de CLARITY-methode maakt het mogelijk om tegelijkertijd een groot aantal neuronen en astrocyten te onderzoeken.

Abstract

Het combineren van virale vectortransductie en weefselzuivering met behulp van de CLARITY-methode maakt het mogelijk om tegelijkertijd verschillende soorten hersencellen en hun interacties te onderzoeken. Virale vectortransductie maakt het mogelijk om verschillende celtypen in verschillende fluorescentiekleuren binnen hetzelfde weefsel te markeren. Cellen kunnen genetisch worden geïdentificeerd door activiteit of projectie. Met behulp van een aangepast CLARITY-protocol is de potentiële steekproefomvang van astrocyten en neuronen met 2-3 ordes van grootte gegroeid. Het gebruik van CLARITY maakt het mogelijk om volledige astrocyten, die te groot zijn om in hun geheel in plakjes te passen, en het onderzoek van de somata met al hun processen mogelijk. Daarnaast biedt het de mogelijkheid om de ruimtelijke interactie tussen astrocyten en verschillende neuronale celtypen te onderzoeken, namelijk het aantal piramidale neuronen in elk astrocytisch domein of de nabijheid tussen astrocyten en specifieke remmende neuronpopulaties. Dit artikel beschrijft in detail hoe deze methoden moeten worden toegepast.

Introduction

In de afgelopen jaren is de kennis van astrocytenfunctie en hoe ze interageren met neuronale circuits dramatisch toegenomen. Astrocyten kunnen de plasticiteit^{beïnvloeden 1,2}, helpen bij neuronaal postinjuryherstel ^3,4 en zelfs de novo neuronale potentiëring induceren, waarbij recente studies het belang van astrocyten in geheugenverwerving en beloning aantonen, voorheen beschouwd als puur neuronale functies ^5,6,7 . Een kenmerk van bijzonder belang in a....

Protocol

Experimentele protocollen werden goedgekeurd door de Hebrew University Animal Care and Use Committee en voldeden aan de richtlijnen van het National Institute of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.

1. Virale vectortransductie

OPMERKING: Virale vectortransductie wordt gebruikt om fluoroforen in de hersenen tot expressie te brengen.

1. Gebruik een atlas (bijv. Allen Brain Atlas) om de relevante coördinatie van het doelgebied te lokaliseren.
   OPMERKING: 3D-atlassen zijn online te vinden (bijv. http://connectivity.brain-map.org/3d-viewer).
2. Injecteer met behulp ....

Results

Succesvolle opruiming van dikke hersenweefselplakken resulteert in een nieuwe reeks vragen die kunnen worden gesteld met betrekking tot de eigenschappen van grote celpopulaties in tegenstelling tot de eigenschappen van afzonderlijke cellen of naburige groepen cellen. Om succesvolle resultaten te bereiken, moet men zich strikt houden aan het CLARITY-protocol, omdat er een breed scala aan parameters is waarmee rekening moet worden gehouden om de variantie tussen monsters te verminderen (bijv. Percentage van de helderheid, .......

Discussion

Weefselverwijderingsmethoden vormen een revolutionair hulpmiddel in hersenonderzoek en nodigen vragen uit die voorheen niet konden worden gesteld. Van het richten op de eigenschappen van een kleine groep cellen, een enkele cel of zelfs een enkele synaps, maakt CLARITY nu het richten van totale celpopulaties of connectiviteitsfuncties op lange afstand mogelijk door relevante fluoroforen te gebruiken.

De uitkomst van de combinatie fluorofoorexpressie en CLARITY-procedure is niet binair; veel fac.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
AAV1-GFAP::TdTomato	ELSC Vector Core Facility (EVCF)		viral vector used to detect astrocytes
AAV5-CaMKII::eGFP	ELSC Vector Core Facility (EVCF)		viral vector used to detect neurons
AAV5-CaMKII::H2B-eGFP	ELSC Vector Core Facility (EVCF)		viral vector used to detect neuronal nuclei
AAV5-CaMKII::TdTomato	ELSC Vector Core Facility (EVCF)		viral vector used to detect neurons
Acrylamide (40%)	Bio-rad	#161-0140
Bisacrylamide (2%)	Bio-rad	#161-0142
Boric acid	Sigma	#B7901	Molecular weight - 61.83 g/mol
Confocal microscope, scanning, FV1000	Olympus		4x objective (UPlanSApo, 0.16 NA)
Imaris software	Bitplane, UK		A software that allows 3D analysis of images
NaOH	Sigma	#S5881
PBS
PFA 4%	EMS	#15710
RapiClear	SunJin lab	#RC147002
RapiClear CS	SunJin lab	#RCCS002
SDS	Sigma	#L3771
SyGlass software			A software that allows 3D analysis of images using virtual reality
Tris base 1 M	Bio-rad	#002009239100	Molecular weight - 121.14 g/mol
Triton X-100	ChemCruz	#sc-29112A
Two photon microscope	Neurolabware		Ti:sapphire laser (Chameleon Discovery TPC, Coherent), GaAsP photo-multiplier tubes (Hamamatsu, H10770-40) , bandpass filter (Semrock), water immersion 16x objective (Nikon, 0.8 NA)
VA-044 Initiator	Wako	#011-19365