Beoordeling van mitochondriale functie in heupzenuw door middel van hoge resolutie respirometrie

Summary

Hoge resolutie respirometrie gekoppeld aan fluorescentiesensoren bepaalt mitochondriaal zuurstofverbruik en reactieve zuurstofsoorten (ROS) generatie. Het huidige protocol beschrijft een techniek om mitochondriale ademhalingssnelheden en ROS-productie in de gepermeabiliseerde heupzenuw te beoordelen.

Abstract

Mitochondriale disfunctie in perifere zenuwen gaat gepaard met verschillende ziekten geassocieerd met perifere neuropathie, die kan worden veroorzaakt door meerdere oorzaken, waaronder auto-immuunziekten, diabetes, infecties, erfelijke aandoeningen en tumoren. Het beoordelen van de mitochondriale functie in perifere zenuwen van muizen kan een uitdaging zijn vanwege de kleine steekproefomvang, een beperkt aantal mitochondriën in het weefsel en de aanwezigheid van een myelineschede. De techniek die in dit werk wordt beschreven, minimaliseert deze uitdagingen door een uniek permeabilisatieprotocol te gebruiken dat is aangepast aan een protocol dat wordt gebruikt voor spiervezels, om de mitochondriale functie van de heupzenuw te beoordelen in plaats van de mitochondriën uit het weefsel te isoleren. Door de productie van fluorimetrische reactieve soorten te meten met Amplex Red / Peroxidase en verschillende mitochondriale substraten en remmers in saponine-permeabilized zenuwen te vergelijken, was het mogelijk om mitochondriale ademhalingstoestanden, reactieve zuurstofsoorten (ROS) en de activiteit van mitochondriale complexen tegelijkertijd te detecteren. Daarom biedt de hier gepresenteerde methode voordelen in vergelijking met de beoordeling van de mitochondriale functie door andere technieken.

Introduction

Mitochondriën zijn essentieel voor het behoud van de levensvatbaarheid van cellen en voeren tal van celfuncties uit, zoals energiemetabolisme (glucose-, aminozuur-, lipide- en nucleotidemetabolismeroutes). Als de primaire plaats van productie van reactieve zuurstofsoorten (ROS), staan mitochondriën centraal in verschillende celsignaleringsprocessen zoals apoptose en nemen ze deel aan de synthese van ijzer-zwavel (Fe-S) clusters, mitochondriale eiwitimport en -rijping, en onderhoud van hun genoom en ribosomen ^1,2,3. Het mitochondriale membraandynamicanetwerk wordt gecontroleer....

Protocol

Dit protocol is goedgekeurd door de Ethische Commissie voor het gebruik van dieren in onderzoek, CCS/UFRJ (CEUA-101/19) en de richtlijnen van de National Institutes of Health voor de verzorging en het gebruik van proefdieren. De heupzenuw wordt geïsoleerd van vier maanden oude mannelijke C57BL / 6-muizen, geëuthanaseerd door cervicale dislocatie volgens de institutionele richtlijnen. De protocolstappen zijn geoptimaliseerd om mitochondriale achteruitgang te voorkomen. Daarom werd in dit protocol kalibratie van polarografische zuurstofsensoren uitgevoerd voorafgaand aan de dissectie en permeabilisatie van heupzenuwweefsel bij muizen.

1....

Results

Het mitochondriale zuurstofverbruik door de gepermeabiliseerde heupzenuw is weergegeven in figuur 2. Het rode spoor vertegenwoordigt de O₂ flux per massa-eenheid in pmol/s.mg. Na het registreren van een basaal zuurstofverbruik met endogene substraten (routinematige ademhaling), wordt succinaat (SUCC) geïnjecteerd om complexe II (succinaatdehydrogenase) aangedreven ademhaling te registreren, wat resulteert in een toename van het zuurstofverbruik. In volgorde wordt een verzadigingsc.......

Discussion

Verschillende ziekten of aandoeningen die gepaard gaan met neuropathieën hebben mitochondriale disfunctie als risicofactor. De evaluatie van de mitochondriale functie in perifere zenuwen is essentieel om op te helderen hoe de mitochondriën werken in deze neurodegeneratieve aandoeningen. De beoordeling van de mitochondriale functie is bewerkelijk vanwege de moeilijkheid van de isolatiemethode en de schaarste aan materiaal. De ontwikkeling van weefselpermeabilisatietechnieken die geen isolatie van mitochondriën vereisen, i.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosine 5' triphosphate dissodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	A26209
Adenosine 5′-diphosphate sodium salt	Sigma-Aldrich	A2754
Amplex Red Reagent	Thermo Fisher scientific	A12222	Amplex Red is prepared in DMSO accordindly with product datasheet
Antimycin A (from Streptomyces sp.)	Sigma-Aldrich	A8674
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7030	heat shock fraction, protease free, fatty acid free, essentially globulin free, pH 7, ≥98%
Calcium carbonate	Sigma-Aldrich	C6763
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920
Cytochrome c	Sigma-Aldrich	C7752	(from equine heart; small hemeprotein)
DataLab version 5.1.1.91	OROBOROS INSTRUMENTS, Austria		Copyright (c) 2002 - 13 by Dr. Erich Gnaiger
Digital orbital microplate shaker 120V	Thermo Fisher scientific	88882005
DL-Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	43819
EGTA sodium salt	Sigma-Aldrich	E8145
Hamilton syringe	Sigma-Aldrich	HAM80075	10 uL, 25 uL and 50 uL
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Hydrogen peroxide solution 30% W/W	Merck	H1009
Imidazole	Sigma-Aldrich	I2399
L-(−)-Malic acid	Sigma-Aldrich	M7397
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	M2393
MES sodium salt	Sigma-Aldrich	M3885
Micro-dissecting forceps, curved	Sigma-Aldrich	F4142
Micro-dissecting forceps, straight	Sigma-Aldrich	F4017
O2K - Filter set Amplex Red	OROBOROS INSTRUMENTS, Austria	44321-01	Fasching M, Sumbalova Z, Gnaiger E (2013) O2k-Fluorometry: HRR and H2O2 production in mouse brain mitochondria. Mitochondr Physiol Network 17.17.
O2K - Fluorescence LED2 - module component Fluorscence-Sensor Green	OROBOROS INSTRUMENTS, Austria	44210-01
Oligomycin	Sigma-Aldrich	O4876	(from Streptomyces diastatochromogenes; mixture of oligomycins A, B, and C
OROBOROS Oxygraph-2k	OROBOROS INSTRUMENTS, Austria	http://www.oroboros.at
Palmitoylcarnitine (Palmitoyl-DL-carnitine-HCl)	Sigma-Aldrich	P4509
Peroxidase from horseradish	Sigma-Aldrich	P8375
Petri dishes, polystyrene	MERCK	P5606
Phosphocreatine disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	P7936
Potassium dihydrogen phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	PHR1330
Potassium hydroxide	Sigma-Aldrich	221473
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875
Saponin	Sigma-Aldrich	SAE0073
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P5280
Sodium succinate dibasic hexahydrate	Sigma-Aldrich	S2378
Sucrose	Sigma-Aldrich	S9378
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625