Method Article

Beoordeling van mitochondriale functie in heupzenuw door middel van hoge resolutie respirometrie

DOI:

10.3791/63690

⸱

May 5th, 2022

 , 
1Instituto de Bioquímica Médica Leopoldo de Meis, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Rio de Janeiro

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hoge resolutie respirometrie gekoppeld aan fluorescentiesensoren bepaalt mitochondriaal zuurstofverbruik en reactieve zuurstofsoorten (ROS) generatie. Het huidige protocol beschrijft een techniek om mitochondriale ademhalingssnelheden en ROS-productie in de gepermeabiliseerde heupzenuw te beoordelen.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitochondriale disfunctie in perifere zenuwen gaat gepaard met verschillende ziekten geassocieerd met perifere neuropathie, die kan worden veroorzaakt door meerdere oorzaken, waaronder auto-immuunziekten, diabetes, infecties, erfelijke aandoeningen en tumoren. Het beoordelen van de mitochondriale functie in perifere zenuwen van muizen kan een uitdaging zijn vanwege de kleine steekproefomvang, een beperkt aantal mitochondriën in het weefsel en de aanwezigheid van een myelineschede. De techniek die in dit werk wordt beschreven, minimaliseert deze uitdagingen door een uniek permeabilisatieprotocol te gebruiken dat is aangepast aan een protocol dat wordt gebruikt voor spiervezels, om de mitochondriale functie van de heupzenuw te beoordelen in plaats van de mitochondriën uit het weefsel te isoleren. Door de productie van fluorimetrische reactieve soorten te meten met Amplex Red / Peroxidase en verschillende mitochondriale substraten en remmers in saponine-permeabilized zenuwen te vergelijken, was het mogelijk om mitochondriale ademhalingstoestanden, reactieve zuurstofsoorten (ROS) en de activiteit van mitochondriale complexen tegelijkertijd te detecteren. Daarom biedt de hier gepresenteerde methode voordelen in vergelijking met de beoordeling van de mitochondriale functie door andere technieken.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitochondriën zijn essentieel voor het behoud van de levensvatbaarheid van cellen en voeren tal van celfuncties uit, zoals energiemetabolisme (glucose-, aminozuur-, lipide- en nucleotidemetabolismeroutes). Als de primaire plaats van productie van reactieve zuurstofsoorten (ROS), staan mitochondriën centraal in verschillende celsignaleringsprocessen zoals apoptose en nemen ze deel aan de synthese van ijzer-zwavel (Fe-S) clusters, mitochondriale eiwitimport en -rijping, en onderhoud van hun genoom en ribosomen 1,2,3. Het mitochondriale membraandynamicanetwerk wordt gecontroleerd door fusie- en splijtingsprocessen en ze hebben ook machines voor kwaliteitscontrole en mitofagie 4,5,6.

Mitochondriale disfunctie wordt geassocieerd met het verschijnen van verschillende pathologische aandoeningen zoals kanker, diabetes en obesitas7. Verstoringen in de mitochondriale functie worden gedetecteerd bij neurodegeneratieve aandoeningen die het centrale zenuwstelsel aantasten, zoals bij de ziekte van Alzheimer 8,9, de ziekte van Parkinson10,11, amyotrofische laterale sclerose12,13 en de ziekte van Huntington14,15 . In het perifere zenuwstelsel wordt verlies van mitochondriale functie in axonen waargenomen bij immuunneuropathieën, zoals Guillain-Barré-syndroom16,17, en in combinatie met een hoge mitochondriale ROS-productie in axonen leiden deze gebeurtenissen tot MAP Kinase-activering in Schwann-cellen18. Dit toont aan dat mitochondriale fysiologie niet alleen essentieel kan zijn voor een plaatsspecifieke cel, maar voor een heel weefsel. Bij HIV-geassocieerde distale sensorische polyneuropathie (HIV-DSP) spelen mitochondriën een rol in het mechanisme waarmee het trans-activator van transcriptie (HIV-TAT) eiwit HIV in staat stelt zich efficiënt te repliceren, evenals verschillende andere rollen in hiv-infectie pathogenese19,20.

Evaluatie van de mitochondriale fysiologie van de heupzenuw is naar voren gekomen als een essentieel doelwit voor het onderzoeken van neuropathie 7,21,22. Bij diabetische neuropathie suggereren proteomische en metabolomische analyses dat de meeste moleculaire veranderingen in diabetes de mitochondriale oxidatieve fosforylering van de heupzenuw en het lipidenmetabolisme beïnvloeden7. Deze veranderingen lijken ook vroege tekenen te zijn van door obesitas veroorzaakte diabetes21. In een muismodel van door chemotherapie geïnduceerde pijnlijke neuropathie wordt mitochondriale stoornissen in de heupzenuw gedetecteerd als een afname van oxidatieve fosforylering22 en een vermindering van mitochondriale complexenactiviteiten, membraanpotentiaal en ATP-gehalte23. Hoewel verschillende groepen mitochondriale disfunctie in neuropathieën hebben aangehaald, zijn deze studies beperkt tot de metingen van activiteit in mitochondriale complexen zonder behoud van de mitochondriale membranen, zonder evaluatie van mitochondriale integriteit of metingen van ATP-inhoud als parameter voor mitochondriale ATP-productie. Over het algemeen vereist een goede beoordeling van mitochondriaal zuurstofverbruik en ROS-productie de isolatie van mitochondriën door differentiële centrifugatie in een percoll / sucrosegradiënt. Isolatie van mitochondriën kan ook een beperkende factor zijn voor ischiaszenuwweefsel vanwege de grote hoeveelheid weefsel die nodig is en mitochondriaal verlies en verstoring.

De huidige studie heeft tot doel een protocol te bieden om mitochondriale fysiologie te meten als mitochondriaal zuurstofverbruik en ROS-productie in de heupzenuw, met behoud van mitochondriale membranen en zonder de noodzaak van isolerende mitochondriën. Dit protocol is aangepast van zuurstofverbruiksmetingen in gepermeabiliseerde spiervezels24 door middel van hoge resolutie respirometrie (HRR). De voordelen van deze procedure zijn de mogelijkheid om mitochondriën in kleine hoeveelheden weefsel zoals de heupzenuw te evalueren en mitochondriale parameters in situ te evalueren, waardoor de mitochondriale omgeving, structuur en bio-energetisch profiel behouden blijven, om een fysiologisch betrouwbaar resultaat te verkrijgen. De mitochondriale ademhalingstoestanden werden bepaald met substraten en remmers na ischiaszenuwpermeabilisatie om mitochondriale bio-energetica en cytochroom c-coëfficiënt voor mitochondriale membraanintegriteit goed te beoordelen, wat een gids biedt voor stappen van de mitochondriale elektronentransportsysteem (ETS) evaluatie en berekening van essentiële parameters. Deze studie kan hulpmiddelen bieden voor het beantwoorden van vragen in pathofysiologische mechanismen waarbij het metabolisme van de heupzenuw betrokken is, zoals perifere neuropathieën.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol is goedgekeurd door de Ethische Commissie voor het gebruik van dieren in onderzoek, CCS/UFRJ (CEUA-101/19) en de richtlijnen van de National Institutes of Health voor de verzorging en het gebruik van proefdieren. De heupzenuw wordt geïsoleerd van vier maanden oude mannelijke C57BL / 6-muizen, geëuthanaseerd door cervicale dislocatie volgens de institutionele richtlijnen. De protocolstappen zijn geoptimaliseerd om mitochondriale achteruitgang te voorkomen. Daarom werd in dit protocol kalibratie van polarografische zuurstofsensoren uitgevoerd voorafgaand aan de dissectie en permeabilisatie van heupzenuwweefsel bij muizen.

1. Bereiding van reagentia

  1. Bereid de Tissue Preservation Buffer (TP Buffer) voor.
    1. Bereid de volgende reagentia in ultraruur wateroplossing: 10 mM Ca-EGTA-buffer met 0,1 μM vrij calcium, 20 mM imidazol, 20 mM taurine, 50 mM K-MES, 0,5 mM DTT, 6,56 mM MgCl2, 5,77 mM ATP, 15 mM fosfocreatine (zie Materiaaltabel), pH 7,1. Bewaren bij -20°C.
  2. Bereid de mitochondriale ademhalingsbuffer (MR-buffer) voor.
    1. Bereid de volgende reagentia in ultrapuur wateroplossing: 0,5 mM K2EGTA, 3 mM MgCl2, 60 mM MES, 20 mM taurine, 10 mM KH2PO4, 20 mM HEPES, 110 mM D-sucrose, 1 mg/ml BSA (vetzuurvrij) (zie Materiaaltabel), pH 7,4. Bewaren bij -20 °C.
  3. Bereid saponine stockoplossing door 5 mg saponine (zie tabel met materialen) op te lossen in 1 ml TP-buffer (stap 1.1) en houd het op ijs. Saponine wordt vers bereid.
  4. Bereid Amplex Red door het poeder (zie materiaaltabel) te resuspenderen met DMSO om een voorraadconcentratie van 2 mM te verkrijgen en bewaar het bij -20 °C in een injectieflacon beschermd tegen licht.
    OPMERKING: Om te voorkomen dat de sonde verslijt door invriezen en ontdooien, maakt u kleine aliquots voor opslag niet langer dan 6 maanden25.

2. Kalibratie van polarografische zuurstofsensoren voor hoge resolutie respirometrie (HRR)

  1. Reinig de HRR-kamers van het instrument en de spuiten (zie materiaaltabel).
    1. Open HRR-kamers, vul met gedestilleerd water tot aan de bovenkant en roer gedurende 5 minuten 3x. Herhaal met ethanol en dan nogmaals met water. Wasstoppers en spuiten met water/ethanol/water 3x per stuk.
  2. Pas de volgende kalibratie-instellingen toe in de HRR-software (zie Materiaaltabel).
    1. Voeg in HRR-softwarebesturing de experimentele temperatuur (37 °C), de parameters voor zuurstofsensor (versterking, 2; polarisatiespanning, 800 mV) en voor amperometrische sensor (versterking, 1000; polarisatiespanning, 100 mV) toe.
  3. Kalibreer de zuurstofsensoren.
    1. Pipetteer 2,1 ml MR-buffer (stap 1.2) in elke kamer. Sluit met de stoppen en zuig lucht in de kamer totdat er een bel is gevormd. Roer bij 37 °C gedurende 1 uur in de kalibratiemodus totdat de zuurstofflux per massa stabiel is.
    2. Voer een luchtkalibratie uit van de polarografische zuurstofsensoren in de software volgens het protocol van de fabrikant24.
      OPMERKING: De kalibratiestap wordt slechts één keer vóór een experiment uitgevoerd. Aanvullende experimenten in hetzelfde ademhalingsmedium en dezelfde temperatuur kunnen worden uitgevoerd na alleen het wassen van kamers (stap 2.1).

3. Dissectie en permeabilisatie van de heupzenuw

  1. Verwijder de heupzenuw volgens de onderstaande stappen.
    1. Euthanaseer het dier door cervicale dislocatie na verwijdering uit zijn kooi en voorzichtig vastgehouden om op de bank te rusten.
    2. Maak bij het geëuthanaseerde dier een incisie met een schaar in de onderrug, beginnend bij de wervelkolom en langs de dij naar de voet. Verwijder huid en spieren die aan de zenuw zijn bevestigd en snijd en verwijder vervolgens de hele heupzenuw.
    3. Weeg het weefsel onmiddellijk en plaats het in een injectieflacon gevuld met koude TB-buffer (4 °C). Voer stap 3.2-3.3 uit op ijs.
      OPMERKING: Het gewicht van het natte weefsel wordt gebruikt om het zuurstofverbruik en de ROS-productiestroom in de volgende stappen te normaliseren. Als het weefsel niet onmiddellijk kan worden gewogen, bewaar het dan in koude TB Buffer. De procedure wordt uitgevoerd in vers weefsel en mag niet worden ingevroren om mitochondriale schade te voorkomen.
  2. Plaats voor de weefselvoorbereiding de heupzenuw in een petrischaaltje met voldoende TP-buffer om het te bedekken. Houd het ene uiteinde van de zenuw vast met een tang en trek met een ander paar tangen de zenuwbundels horizontaal uit.
    OPMERKING: Deze procedure moet in minder dan 10 minuten worden uitgevoerd om weefselverslechtering te voorkomen. Het weefsel zal klaar zijn wanneer het kan worden gevisualiseerd als transparante mistige lagen, tegenover het vorige witte ondoorzichtige weefsel (figuur 1).
  3. Breng eerst het gespreide weefsel over in een kleine schaal met 1 ml TP-buffer voor weefselpermeabilisatie. Om de permeabilisatie te starten, brengt u het weefsel met een tang over naar een schaal met 1 ml TP-buffer en 10 μl saponine (uit voorraadoplossing, stap 1.3).
    1. Schud in een microplate shaker voorzichtig gedurende 30 minuten, breng het weefsel vervolgens met een tang over naar een verse schaal met MR Buffer (1 ml) en schud voorzichtig gedurende 10 minuten. Breng het weefsel met een tang over naar een gekalibreerde HRR-kamer.

4. Bepaling van het zuurstofverbruik en de ROS-productie

  1. Vul de HRR-kamers met 2,1 ml MR-buffer, voeg Amplex Red (stap 1.4) toe aan een eindconcentratie van 5 μM en peroxidase tot 2 U/ml en voeg de permeabiliseerde heupzenuw toe (stap 3).
    1. Bevestig de fluorescentiesensoren van het instrument, schakel de lichten uit in het besturingsgedeelte van de software en druk op Verbinden met oxygraph. In "bewerkingsprotocollen" in de software voegt u het weefselgewicht in dat is gemeten in stap 3.1.3.
  2. Ga naar "lay-out", kies de optie "specifieke flux per eenheid monster" en selecteer Plots om tegelijkertijd toegang te krijgen tot de uitlezing van het zuurstofverbruik en, indien gewenst, de H2O2-productie . Wacht ~10 min.
    OPMERKING: Deze tijd is nodig om de basale stroom van zuurstofverbruik te stabiliseren zonder toegevoegd substraat (basaal). Zorg er voordat u verder injectiet voor dat de zuurstofstroom is gestabiliseerd.
  3. Injecteer twee pulsen van H2O2, elk tot een eindconcentratie van 260 μM, voor latere kalibratie in de kamer.
  4. Injecteer 20 μL succinaat (zie Tabel van Materialen), een mitochondriaal complex II substraat, om het mitochondriale elektronentransportsysteem te activeren.
    OPMERKING: Verschillende mitochondriale substraten kunnen op dit punt worden toegevoegd om de mitochondriale functie door verschillende complexen te evalueren. Representatieve resultaten met verschillende substraten voor mitochondriale complexen I en II zijn weergegeven in figuur 2 en figuur 3. Op dit punt wordt tegelijkertijd een toename van het O2-verbruik en de productievan H2 O 2 waargenomen in figuur 3.
  5. Voeg 20 μL adenosinedifosfaat (ADP) toe om de synthese van adenosinetrifosfaat (ATP) te activeren.
    OPMERKING: ADP stimuleert de ATP-synthese en vermindert het membraanpotentiaal. Een toename van het O2-verbruik en een afname van de productie van H2O2 zullen naar verwachting worden waargenomen26,27.
  6. Voeg achtereenvolgens 5 μL cytochroom c toe (zie Tabel met materialen) als indicator voor de membraanintegriteit.
    OPMERKING: Als het weefsel goed is voorbereid en doorlaatbaar, mag cytochroom c het zuurstofverbruik niet met meer dan 15% verhogen. Als dit gebeurt, raadpleegt u het gedeelte probleemoplossing voor aanbevelingen.
  7. Titreer met aliquots van 0,2 μg/ml oligomycine (zie materiaaltabel) totdat er geen verdere afname van het O2-verbruik wordt waargenomen.
    OPMERKING: Oligomycine werkt door atp-synthese te remmen, wat leidt tot een afname van de O2-stroom en een verbetering van de H2O2-formatie die de voorkeur geniet van het hoge membraanpotentiaal26,27.
  8. Titreer met aliquots van 0,5 μmol/L carbonylcyanide 4-(trifluoromethoxy)fenylhydrazon (FCCP) (zie Materiaaltabel), de mitochondriale ontkoppelaar, totdat het mogelijk is om geen verdere toename van het O2-verbruik waar te nemen. Om het experiment te voltooien, injecteert u 2 μl antimycine A tot een eindconcentratie van 5 μM en wacht u op stroomstabilisatie.
    OPMERKING: Een afname van de productie van H2O2 wordt waargenomen als gevolg van de potentiële dissipatie van het membraan na het injecteren van FCCP. Antimycine A remt complex III, waardoor de stroom van elektronen wordt voorkomen. Daarom is het mitochondriale afhankelijke O2-verbruik verminderd, waardoor de zuurstofflux per massa afneemt en elektronenlekkage wordt gestimuleerd, waardoor de productie van H2O2 26,27 toeneemt.
  9. Ga naar de opdrachtbalk, zoek naar "multisensorisch" in de software, klik op Control > Save file en Disconnect.
    OPMERKING: De toevoeging van andere substraten en remmers kan worden uitgevoerd volgens de vraag die wordt bestudeerd. Een voorbeeld wordt beschreven in de representatieve resultaten. H2O2 kalibratie wordt uitgevoerd na het beëindigen van het experiment, volgens het protocol van de fabrikant28.
  10. Open het opgeslagen bestand en selecteer het traceren van de "Zuurstofflux per massa" om de resultaten van het experimentele zuurstofverbruik te verkrijgen. Selecteer handmatig het venster tussen injecties door op Shift + Linkermuisknop te drukken.
    1. Ga naar Marks > Statistics om de resultaten voor elke injectie van substraat/remmers/ontkoppeld protocol te visualiseren. Voer voor H2O2-productie dezelfde procedure uit met het traceer "Amp-Slope".
      OPMERKING: Vermijd bij het selecteren van het venster artefacten van volume-injecties door een venster te kiezen waar zuurstof (of H2O2) stabieler en constanter is. Voorbeelden van geselecteerde vensters worden weergegeven door zwarte accolades in de representatieve resultaten (figuur 2 en figuur 3).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het mitochondriale zuurstofverbruik door de gepermeabiliseerde heupzenuw is weergegeven in figuur 2. Het rode spoor vertegenwoordigt de O2 flux per massa-eenheid in pmol/s.mg. Na het registreren van een basaal zuurstofverbruik met endogene substraten (routinematige ademhaling), wordt succinaat (SUCC) geïnjecteerd om complexe II (succinaatdehydrogenase) aangedreven ademhaling te registreren, wat resulteert in een toename van het zuurstofverbruik. In volgorde wordt een verzadigingsc...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Verschillende ziekten of aandoeningen die gepaard gaan met neuropathieën hebben mitochondriale disfunctie als risicofactor. De evaluatie van de mitochondriale functie in perifere zenuwen is essentieel om op te helderen hoe de mitochondriën werken in deze neurodegeneratieve aandoeningen. De beoordeling van de mitochondriale functie is bewerkelijk vanwege de moeilijkheid van de isolatiemethode en de schaarste aan materiaal. De ontwikkeling van weefselpermeabilisatietechnieken die geen isolatie van mitochondriën vereisen, i...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd gefinancierd door Instituto Serrapilheira, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) en Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES). We zijn Dr. Antonio Galina Filho, Dr. Monica Montero Lomeli en Dr. Claudio Masuda dankbaar voor de ondersteuning met laboratoriumfaciliteiten, en Dr. Martha Sorenson voor vriendelijke en waardevolle opmerkingen bij het verbeteren van het artikel.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Adenosine 5' trifosfaat dinatriumzouthydraatSigma-AldrichA26209
Adenosine 5′-difosfaat natriumzoutSigma-AldrichA2754
Amplex Red ReagensThermo Fisher scientificA12222Amplex Red is bereid in DMSO volgens het productdatasheet
Antimycine A (van Streptomyces sp.)Sigma-AldrichA8674
RundserumalbumineSigma-AldrichA7030heat shock fractie, proteasevrij, vetzuurvrij, vrij van globuline, pH 7, ≥98%
CalciumcarbonaatSigma-AldrichC6763
Carbonylcyanide 4-(trifluormethoxy)fenylhydrazon (FCCP)Sigma-AldrichC2920
Cytochroom cSigma-AldrichC7752(van paardenhart; klein heme-eiwit)
DataLab versie 5.1.1.91OROBOROS INSTRUMENTS, OostenrijkCopyright (c) 2002 - 13 door Dr. Erich Gnaiger
Digitale orbitale microplaatshaker 120VThermo Fisher scientific88882005
DL-DithiothreitolSigma-Aldrich43819
EGTA natriumzoutSigma-AldrichE8145
Hamilton-seringpompSigma-AldrichHAM8007510 uL, 25 uL en 50 uL
HEPESSigma-AldrichH3375
Waterstofperoxideoplossing 30% W/WMerckH1009
ImidazoolSigma-AldrichI2399
L-(−)-AppelzuurSigma-AldrichM7397
Magnesiumchloride hexahydraatSigma-AldrichM2393
MES natriumzoutSigma-AldrichM3885
Microdissectiepincet, gebogenSigma-AldrichF4142
Microdissectiepincet, rechtSigma-AldrichF4017
O2K - Filterset Amplex RedOROBOROS INSTRUMENTS, Oostenrijk44321-01Fasching M, Sumbalova Z, Gnaiger E (2013) O2k-Fluorometrie: HRR en H2O2 productie in muizenhersenmitochondria. Mitochondr Physiol Network 17.17.
O2K - Fluorescerende LED2 - modulecomponent Fluorscence-Sensor GroenOROBOROS INSTRUMENTS, Oostenrijk44210-01
OligomycineSigma-AldrichO4876(van Streptomyces diastatochromogenes; mengsel van oligomycines A, B en C
OROBOROS Oxygraph-2kOROBOROS INSTRUMENTS, Oostenrijkhttp://www.oroboros.at
Palmitoylcarnitine (Palmitoyl-DL-carnitine-HCl)Sigma-AldrichP4509
Peroxidase van mierikswortelSigma-AldrichP8375
Petrischalen, polystyreenMERCKP5606
Fosfocreatine dinatriumzouthydraatSigma-AldrichP7936
Kaliumdiwaterstoffosfaat monobasicumSigma-AldrichPHR1330
KaliumhydroxideSigma-Aldrich221473
RotenonSigma-AldrichR8875
SaponineSigma-AldrichSAE0073
NatriumpyrovacinaatSigma-AldrichP5280
Natriumsuccinaat dibasicum hexahydraatSigma-AldrichS2378
SucroseSigma-AldrichS9378
TaurineSigma-AldrichT0625

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pfanner, N., Warscheid, B., Wiedemann, N. Mitochondrial protein organization: from biogenesis to networks and function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (5), 267-284 (2019).
  2. Sena, L. A., Chandel, N. S. Physiological roles of mitochondrial reactive oxygen species. Molecular Cell. 48 (2), 158-167 (2012).
  3. Van Der Bliek, A. M., Sedensky, M. M., Morgan, P. G. Cell biology of the mitochondrion. Genetics. 207 (3), 843-871 (2017).
  4. Rugarli, E. I., Langer, T. Mitochondrial quality control: A matter of life and death for neurons. EMBO Journal. 31 (6), 1336-1349 (2012).
  5. Westermann, B. Mitochondrial fusion and fission in cell life and death. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 872-884 (2010).
  6. Pickles, S., Vigié, P., Youle, R. J. Mitophagy and quality control mechanisms in mitochondrial maintenance. Current Biology. 28 (4), 170-185 (2018).
  7. Freeman, O. J., et al. Metabolic dysfunction is restricted to the sciatic nerve in experimental diabetic neuropathy. Diabetes. 65 (1), 228-238 (2016).
  8. Sheng, B., et al. Impaired mitochondrial biogenesis contributes to mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease. Journal of Neurochemistry. 120 (3), 419-429 (2012).
  9. Wang, X., et al. Oxidative stress and mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1842 (8), 1240-1247 (2014).
  10. Li, W., Fu, Y. H., Halliday, G. M., Sue, C. M. PARK genes link mitochondrial dysfunction and alpha-synuclein pathology in sporadic Parkinson's disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 1-11 (2021).
  11. Winklhofer, K. F., Haass, C. Mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1802 (1), 29-44 (2010).
  12. Harley, J., Clarke, B. E., Patani, R. The interplay of rna binding proteins, oxidative stress and mitochondrial dysfunction in ALS. Antioxidants. 10 (4), 552(2021).
  13. Nakagawa, Y., Yamada, S. A novel hypothesis on metal dyshomeostasis and mitochondrial dysfunction in amyotrophic lateral sclerosis: Potential pathogenetic mechanism and therapeutic implications. European Journal of Pharmacology. 892, 173737(2021).
  14. Franco-Iborra, S., et al. Mutant HTT (huntingtin) impairs mitophagy in a cellular model of Huntington disease. Autophagy. 17 (3), 672-689 (2021).
  15. Wang, Y., Guo, X., Ye, K., Orth, M., Gu, Z. Accelerated expansion of pathogenic mitochondrial DNA heteroplasmies in Huntington's disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (30), 2014610118(2021).
  16. Sajic, M., et al. Mitochondrial damage and 'plugging' of transport selectively in myelinated, small-diameter axons are major early events in peripheral neuroinflammation. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 61(2018).
  17. Muke, I., et al. Ultrastructural characterization of mitochondrial damage in experimental autoimmune neuritis. Journal of Neuroinflammation. 343, 577218(2020).
  18. Rodella, U., et al. An animal model of Miller Fisher Syndrome: mitochondrial hydrogen peroxide is produced by the autoimmune attack of nerve terminals and activates Schwann cells. Neurobiology of Disease. 96, 95-104 (2016).
  19. Han, M. M., Frizzi, K. E., Ellis, R. J., Calcutt, N. A., Fields, J. A. Prevention of HIV-1 TAT protein-induced Ppripheral neuropathy and mitochondrial disruption by the antimuscarinic pirenzepine. Frontiers in Neurology. 12, 663373(2021).
  20. Roda, R. H., Hoke, A. Mitochondrial dysfunction in HIV-induced peripheral neuropathy. International Review of Neurobiology. 145, Elsevier Inc. (2019).
  21. Palavicini, J. P., et al. Early disruption of nerve mitochondrial and myelin lipid homeostasis in obesity-induced diabetes. JCI Insight. 5 (21), 137286(2020).
  22. Zheng, H., Xiao, W. H., Bennett, G. J. Functional deficits in peripheral nerve mitochondria in rats with paclitaxel- and oxaliplatin-evoked painful peripheral neuropathy. Experimental Neurology. 232 (2), 154-161 (2011).
  23. Lim, T. K. Y., Rone, M. B., Lee, S., Antel, J. P., Zhang, J. Mitochondrial and bioenergetic dysfunction in trauma-induced painful peripheral neuropathy. Molecular Pain. 11, 58(2015).
  24. Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Mitochondrial Bioenergetics: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology. 810, 25-58 (2012).
  25. Komlódi, T., et al. Comparison of mitochondrial incubation media for measurement of respiration and hydrogen peroxide production. Methods in Molecular Biology. 1782, 137-155 (2018).
  26. Chance, B., Williams, G. R. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. III. The steady state. Journal of Biological Chemistry. 217 (1), 409-427 (1955).
  27. Korshunov, S. S., Skulachev, V. P., Starkov, A. A. High protonic potential actuates a mechanism of production of reactive oxygen species in mitochondria. FEBS Letters. 416 (1), 15-18 (1997).
  28. Gnaiger, E. Mitochondr Physiol Network. Mitochondrial Pathways and Respiratory Control. An Introduction to OXPHOS Analysis. 4th ed. , OROBOROS MiPNet Publications. Innsbruck, Austria. 80(2014).
  29. Kuznetsov, A. V., et al. Mitochondrial defects and heterogeneous cytochrome c release after cardiac cold ischemia and reperfusion. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (5), 1633-1641 (2004).
  30. Ruas, J. S., et al. Underestimation of the maximal capacity of the mitochondrial electron transport system in oligomycin-treated cells. PLoS One. 11 (3), 0150967(2016).
  31. Boveris, A., Chance, B. The mitochondrial generation of hydrogen peroxide. General properties and effect of hyperbaric oxygen. Biochemical Journal. 134 (3), 707-716 (1973).
  32. Skulachev, V. P. Membrane-linked systems preventing superoxide formation. Bioscience Reports. 17 (3), 347-366 (1997).
  33. Majava, V., et al. Structural and functional characterization of human peripheral nervous system myelin protein P2. PLoS One. 5, 10300(2010).
  34. Greenfield, S., Brostoff, S., Eylar, E. H., Morell, P. Protein composition of myelin of the peripheral nervous system. Journal of Neurochemistry. 20 (4), 1207-1216 (1973).
  35. Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nature Protocols. 3, 965-976 (2008).
  36. Saks, V. A., et al. Permeabilized cell and skinned fiber techniques in studies of mitochondrial function in vivo. Molecular and Cellular Biochemistry. 184 (1-2), 81-100 (1998).
  37. Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle. New perspectives of mitochondrial physiology. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 41 (10), 1837-1845 (2009).
  38. Porter, C., et al. Mitochondrial respiratory capacity and coupling control decline with age in human skeletal muscle. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 309 (3), 224-232 (2015).
  39. Martins, E. L., et al. Rapid regulation of substrate use for oxidative phosphorylation during a single session of high intensity interval or aerobic exercises in different rat skeletal muscles. Comparative Biochemistry and Physiology B. 217, 40-50 (2018).
  40. Areti, A., Komirishetty, P., Kumar, A. Carvedilol prevents functional deficits in peripheral nerve mitochondria of rats with oxaliplatin-evoked painful peripheral neuropathy. Toxicology and Applied Pharmacology. 322, 97-103 (2017).
  41. Cooper, M. A., et al. Reduced mitochondrial reactive oxygen species production in peripheral nerves of mice fed a ketogenic diet. Experimental Physiology. 103 (9), 1206-1212 (2018).
  42. Jia, M., et al. Activation of NLRP3 inflammasome in peripheral nerve contributes to paclitaxel-induced neuropathic pain. Molecular Pain. 13, 1744806917719804(2017).
  43. Muller, F. L., et al. Denervation-induced skeletal muscle atrophy is associated with increased mitochondrial ROS production. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 293 (3), 1159-1168 (2007).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mitochondrial FunctionSciatic NerveHigh Resolution RespirometryOxygen ConsumptionReactive Oxygen SpeciesSaponin PermeabilizationElectron Transport SystemMitochondrial Complex ActivityATP SynthesisPeripheral Neuropathy

Related Articles