Methodenartikel

Methodologie om controlemiddelen en insecticiden te testen tegen de koffiebesboorder Hypothenemus hampei

1.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/63694

⸱

23 maart 2022

 ,  ,  , 
1Department of Entomology, National Coffee Research Center

In dit artikel

Samenvatting

Een methode met behulp van groene koffievruchten (GFs) werd ontwikkeld om de toxiciteit van insecticiden tegen de koffiebessenboorder (CBB) te testen. Insecticiden of giftige stoffen werden aangebracht op gedesinfecteerde GFs voor of na CBB-besmetting. Insectensterfte, afstotendheid en voortplantingsvermogen, naast andere parameters, werden geëvalueerd.

Samenvatting

Voorafgaand aan het aanbevelen van insecticiden om de koffiebessenboorder (CBB) Hypothenemus hampei te behandelen, is het waardevol om de mortaliteit en afstotendheid van deze insecticiden tegen volwassen insecten of hun impact op de reproductieve output te kennen. Momenteel beschikbare methoden beoordelen echter alleen de sterfte bij volwassenen, waardoor de selectie van nieuwe insecticiden met een ander werkingsmechanisme wordt beperkt. In dit werk werden verschillende experimentele methoden onderzocht om de verschillende effecten op het CBB onder laboratoriumomstandigheden te identificeren. Hiervoor werden groene koffievruchten (GFs) verzameld en gedesinfecteerd door onderdompeling in natriumhypochlorietoplossing gevolgd door UV-lichtbestraling. Tegelijkertijd werden CBB-volwassenen uit een kolonie gedesinfecteerd door onderdompeling in natriumhypochlorietoplossing. Om de bescherming van fruit (pre-besmetting) te beoordelen, werden de vruchten in plastic dozen geplaatst en werden de insecticiden aangebracht. Vervolgens werden de CBB-volwassenen vrijgelaten met een snelheid van twee CBB's per GF. De GF's werden onder gecontroleerde omstandigheden achtergelaten om CBB-besmetting en overleving na 1, 7, 15 en 21 dagen te evalueren. Om de werkzaamheid van insecticiden na CBB-besmetting (postinfestatie) te evalueren, werden CBB-volwassenen vrijgegeven aan de GFs in een verhouding van 2: 1 gedurende 3 uur bij 21 ° C. Aangetaste vruchten met CBB-volwassenen met hun buik gedeeltelijk blootgesteld werden geselecteerd en in 96-well racks geplaatst, en de CBB's die in de vruchten boren, werden direct behandeld. Na 20 dagen werden de vruchten ontleed en werden de biologische CBB-stadia in elke vrucht geregistreerd. De GFs dienden als substraten die natuurlijke omstandigheden nabootsen om toxische, chemische en biologische insecticiden tegen de CBB te evalueren.

Inleiding

De koffiebessenboorder (CBB), Hypothenemus hampei, werd voor het eerst gedetecteerd in 1988 in Colombia en is sindsdien uitgegroeid tot de belangrijkste plaagsoort van het koffiegewas. CBB-vrouwtjes laten de geboortevrucht al bevrucht achter, op zoek naar nieuwe vruchten geleid door de vluchtige chemicaliën die ze 1,2 uitstoten. Een volledige cyclus wordt binnen 23 dagen3 bij een temperatuur van 25 °C voltooid. De cyclus begint met het stichtende vrouwtje dat het zaad penetreert en eieren legt in het fruitendosperm. De afgesloten larven eten het zaad op. Als de vruchten op dit punt worden ontleed, zou het mogelijk zijn om zowel het stichtervrouwtje als haar nakomelingen te observeren. Na 14 dagen worden de larven poppen - over het algemeen duurt het poppenstadium 5 dagen. In het volwassen stadium copuleren de vrouwtjes met hun broers en zussen en de nieuw bevruchte vrouwtjes vliegen weg van de beschadigde vruchten op zoek naar nieuwe koffievruchten om een nieuwe cyclus te starten4.

Zowel het penetratieproces als het resultaat van larvale voeding beschadigen het koffiezaad, waardoor de kwaliteit van de koffiedrank afneemt en de inkomsten aanzienlijk worden verminderd; meer dan 5% besmetting in koffieplantages wordt over het algemeen beschouwd als de economische drempel.

CBB-bestrijding is gebaseerd op een geïntegreerde plaagbestrijdingsstrategie (IPM), inclusief culturele bestrijding en agronomische praktijken, natuurlijke biologische agentia en het gebruik van chemische insecticiden, waarvoor veiligheidsvoorwaarden en tijdige toepassing vereistzijn 4.

Om nieuwe insecticiden voor de bestrijding van de CBB te evalueren, zijn goedkope methodologieën nodig die het mogelijk maken om snelle resultaten te verkrijgen. Zowel laboratorium- als veldprocedures zijn momenteel in gebruik, waaronder kunstmatige diëten met koffie waarin de insecticiden 5,6 zijn verwerkt, of het spuiten van de insecticiden op droge perkamentkoffie 7,8,9. Daarnaast zijn experimenten in het veld met koffieboomtakken bedekt met entomologische mouwen gemeld10,11; deze methoden vereisen echter intensieve arbeid en lange evaluatieperioden.

Een aandoening die lijkt op natuurlijke veldomstandigheden, die ook snel en goedkoop is, is het gebruik van groene of rijpe koffievruchten. Deze vruchten moeten echter worden onderhouden onder omstandigheden die geschikt zijn voor het ontwikkelen van de CBB, waarbij veranderingen en verontreinigingen door micro-organismen worden vermeden om hun kwaliteit en eigenschappen te behouden. Hiertoe zijn verschillende ontsmettingsmiddelen gebruikt, evenals procedures met betrekking tot warmte en straling 7,9,12,13,14,15,16.

Bovendien vereisen de methoden voor insecticide-evaluatie tegen de CBB simulaties van volwassen vrouwtjes die vliegen op zoek naar fruit of die vruchten binnendringen17,18. Hiervoor zijn kunstmatige fruitbesmettingen uitgevoerd in het veld 8,11,19, hoewel dit proces arbeidsintensief is en afhankelijk is van de omgevingsomstandigheden.

Hier beschrijven we een gestandaardiseerde methodologie voor de evaluatie van producten die verschillende effecten op de CBB kunnen hebben onder gecontroleerde omgevingsomstandigheden die lijken op veldomstandigheden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

OPMERKING: Dit protocol behandelt verschillende methoden om verschillende effecten op de CBB onder laboratoriumomstandigheden te identificeren.

1. Fruitwinning

  1. Pluk GF's met een ontwikkelingsleeftijd van ~ 120-150 dagen na de bloei van bomen in een koffieplantage vroeg in de ochtend.

2. Fruitdesinfectie20

  1. Breng ongeveer 300 BV's naar het laboratorium. Selecteer uniform grote en gezonde GF's en trek de steeltjes terug.
  2. Dompel de GF's in een zeepoplossing (2 ml vloeibare afwaszeep in 998 ml kraanwater), gevolgd door wrijven om de GF's te wassen. Spoel vervolgens de vruchten met water en ververs het water drie keer.
  3. Dompel GFs onder in 0,5% natriumhypochlorietoplossing (100 ml in 900 ml kraanwater) en roer gedurende 15 minuten in een shaker bij 110 tpm. Spoel vervolgens de GF's met water door in een shaker te roeren en het water drie keer te verversen, elke 10 minuten.
  4. Droog de GF's met steriele papieren handdoekjes.
  5. Plaats de GF's in trays (33 cm x 25 cm x 2 cm) en bestraal ze gedurende 15 minuten, waarbij u de GF's op een afstand van 55 cm van de UV-bron in een horizontaal laminair stroomstation met UV-functionaliteit plaatst.
  6. Beweeg tijdens de periode van 15 minuten, elke 5 minuten, de GF's om bestraling van de hele vrucht te garanderen.

3. Insectendesinfectie21

  1. Gebruik nieuw ontstane (same-day) CBB-insecten om de bioassays op te zetten.
  2. Dompel de CBB's onder in 0,5% natriumhypochlorietoplossing en roer ze langzaam met een borstel gedurende 10 minuten.
  3. Filter de CBBs door een mousseline doek en was ze drie keer met steriel gedestilleerd water.
  4. Verwijder overtollig water met steriele papieren handdoeken.

4. Evaluatie van een product met een beschermend effect op de vruchten (pre-besmetting) (figuur 1)

  1. Gebruik een groep GF's per experimentele eenheid. Over het algemeen wordt een groep van 30 GF's per experimentele eenheid gebruikt.
  2. Plaats de GF's in plastic dozen (experimentele eenheid).
  3. Breng het testproduct aan in de verschillende concentraties voor evaluatie. Voer de toepassing uit met een draagbare spuiteenheid. Hier werd een alkaloïde emulsie bij 5% en 6% getest.
  4. Besproei als controle een groep GF's met water.
  5. Gebruik ten minste drie herhalingen (experimentele eenheid) per behandeling, waarbij de ene na de andere wordt gespoten.
  6. Laat in een steriele kap twee CBB-volwassenen per GFs los (in totaal worden 60 CBB's in de plastic dozen gebracht). Na 30 minuten dek je de dozen af.
  7. Laat de plastic dozen met de besmette GF's in een ruimte of incubator onder gecontroleerde omstandigheden (donker, 25 ± 2 °C en relatieve vochtigheid 71% ± 5%).
  8. Tel na 1, 7, 15 en 21 dagen het aantal boorvruchten en levende en dode insecten buiten de vruchten in elke doos.
  9. Ontleed 20 dagen na besmetting elke GF onder een stereomicroscoop, vergroting 10x.
  10. Tel het aantal gezonde zaden of zaden beschadigd door de insecten in elke vrucht.
  11. Tel de verschillende CBB biologische stadia22 waargenomen en tel het aantal dode insecten in elk zaadje om de insectensterfte per experimentele eenheid te bepalen.

5. Evaluatie van het effect van een product na CBB-besmetting (postinfestatie) (figuur 3)

  1. Gebruik groepen van 200 vruchten per behandeling.
  2. Laat in asteriele kap CBB-volwassenen (2:1-verhouding van CBB-volwassenen tot GFs) los op de eerder gedesinfecteerde GFs, waardoor de besmetting gedurende 3 uur bij 21 °C kan doorgaan.
  3. Bekijk de GF's. Na 3 uur moeten de meeste besmet zijn, waarbij de buik van de CBB's nog steeds wordt blootgesteld (positie A20), zoals weergegeven in figuur 2.
  4. Selecteer 46 besmette GF's (positie A) en plaats ze in 96-well plastic racks (experimentele eenheid). De vruchten moeten in deze positie blijven, zodat de behandeling direct op de CBB kan worden gespoten die de vrucht perforeert.
  5. Spuit minstens drie keer (drie rekken) per behandeling, de ene na de andere, en bedek de rekken na 30 minuten.
  6. Laat de rekken met de besmette GF's in een ruimte of incubator onder gecontroleerde omstandigheden (donker, 25 ± 2 °C en relatieve vochtigheid 71% ± 5%).
  7. Ontleed na 20 dagen de GF's onder een stereomicroscoop met 10x vergroting.
  8. Tel het aantal gezonde zaden of zaden beschadigd door de insecten in elke vrucht.
  9. Tel de verschillende CBB biologische stadia22 en het aantal dode insecten in elk zaadje om de insectensterfte per experimentele eenheid te bepalen.

6. Beoordeling van een product met een afschrikwekkend effect op de CBB

  1. Volg de stappen 4.1-4.6 voor het evalueren van een product met een beschermend effect op de vruchten.
  2. Nadat je de CBB-volwassenen in de plastic dozen hebt vrijgegeven, tel je het aantal CBB's dat wegvliegt van de dozen en het aantal dat de GF's besmet. Volg vervolgens de stappen 4.7-4.11.
  3. Volg de stappen 5.1-5.5 voor het evalueren van het product na de CBB-besmetting.
  4. Tel na het spuiten van elke behandeling op de insecten in positie A het aantal CBB's dat uit de GF is verhuisd en / of wegvloog van de GF. Volg vervolgens de stappen 5.6-5.9.

7. Statistische analyse

OPMERKING: De responsvariabelen zijn sterftepercentages in de loop van de tijd en het percentage gezonde ongesmesterde koffiezaden.

  1. Schat de gemiddelde en standaarddeviatie van elke responsvariabele voor elke behandeling.
  2. Voer een variantieanalyse uit voor elke responsvariabele met een model voor een volledig gerandomiseerd ontwerp.
    OPMERKING: Dunnett's 5% vergelijkingstest wordt uitgevoerd om de behandelingen te vergelijken met de absolute controle (watercontrole).
  3. Wanneer de behandelingen significant verschillen van de absolute controle, gebruik dan een 5% least significant difference (LSD) test om de behandelingen te vergelijken.
  4. Evalueer de kracht van de test; indien groter dan 85%, wordt voldaan aan de aannames van normaliteit en homogeniteit van de varianties.

figure-protocol-1
Figuur 1: Procedure voor de evaluatie van de pre-besmettingseffecten van insecticiden op de CBB. Stappen voor het evalueren van de pre-besmettingseffecten van insecticiden op Hypothenemus hampei (CBB) met behulp van groen fruit (GFs). (A) Fruitselectie. (B) Spuiten van de insecticiden op de koffievruchten. (C) CBB-plaag van koffievruchten in een verhouding van 2:1 CBB per GF. (D) Aangetaste vruchten. (E) Incubatie van de vruchten onder gecontroleerde omstandigheden. (F) Fruitdissectie. (G) Het tellen van de CBB-populatie in de zaden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-protocol-2
Figuur 2: Verwerk de CBB-plaag van koffievruchten. De aangetaste vruchten bevatten CBB-volwassenen met hun buik gedeeltelijk blootgesteld (positie A). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-protocol-3
Figuur 3: Procedure voor de evaluatie van de posinfestatie-effecten van insecticiden op de CBB. Stappen voor het evalueren van de postinfestatie-effecten van insecticiden op de CBB met behulp van GFs. (A) Fruitselectie. (B) Aantasting van de vruchten met CBB in een verhouding van 2:1 CBB per GF. (C) Selectie van aangetaste vruchten. (D) Spuiten van het insecticide op de vruchten. (E) Incubatie van de vruchten. (F) Fruitdissectie. (G) Het tellen van de CBB-populatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De resultaten toonden aan dat de CBB-vrouwtjes de vruchten herkenden, en afhankelijk van de kenmerken van het vruchtoppervlak en de uitgestoten geuren, begonnen de CBB-vrouwtjes de vruchten binnen 3 uur bij 21 °C te penetreren of te boren.

Het effect van een insecticide op de CBB bij toepassing op de koffievruchten (pre-besmettingsprocedure) na 24 uur en na verloop van tijd is weergegeven in figuur 4. De twee insecticiden (alkaloïde emulsie bij 5% en 6%) veroorzaa...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In dit protocol zijn desinfectie van de vruchten en de insecten kritieke stappen. Wanneer vruchten uit het veld in het laboratorium worden gebruikt, vertonen ze vaak een hoge besmetting en uitdroging, omdat micro-organismen en mijten aanwezig zijn in de opperhuid 7,15,16. Daarom zal het gebruik van fruit of insecten die niet zijn gedesinfecteerd insectensterfte veroorzaken als gevolg van besmetting veroorzaakt door micro-organis...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Geen van de auteurs heeft belangenconflicten te melden.

Dankbetuigingen

De auteurs spreken hun dank uit aan de Nationale Federatie van Koffietelers van Colombia, de assistenten van de afdeling Entomologie (Diana Marcela Giraldo, Gloria Patricia Naranjo), Experiment Station Naranjal en Jhon Félix Trejos.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Beaker with spout, low form 500 mLBRAND PPBR87826
Benchtop ShakerNew Brunswick Scientific Innova 4000 Incubator Shaker
Dishwashing liquid soap-AXIONColgate-PalmoliveAXION
Hood; Horizontal Laminar Flow StationTerra Universal Poedergecoat staal, 1930 mm B x 1118 mm D x 1619 mm H, 120 V (https://www.terrauniversal.com/hood-horizontal-laminar-flow-station-9620-64a.html)
Insects CBBBIOCAFE(http://avispitas.blogspot.com/p/biocafe.html).
Multi Fold White paper towelsFamilia73551
Preval Spray unit Preval MerckZ365556-1KThttps://www.sigmaaldrich.com/CO/es/product/sigma/z365556?gclid=Cj0KCQiAweaNBhDEARIsAJ
5hwbfZOy1TWGj6huatFtRQt
AzOyHe5-oBiKnOUK2T1exuuk
WwJLdvxkvsaAjoYEALw_wcB
Reversible Racks 96-WellheathrowscientificHEA2345Ahttps://www.heathrowscientific.com/reversible-racks-96-well-i-hea2345a
Scalpel blades N 11MerckS2771-100EA
Scalpel handles N3MerckS2896-1EA
Sodium HypochlorideThe clorox companyClorox
Stereo MicroscopeZeissStemi 508https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/stereo-zoom-microscopes/stemi-508.html

Referenties

  1. Mendesil, E., et al. Semiochemicals used in host location by the coffee berry borer, Hypothenemus hampei. Journal of Chemical Ecology. 35 (8), 944-950 (2009).
  2. Jaramillo, J., et al. Coffee berry borer joins bark beetles in coffee klatch. PLoS ONE. 8 (9), 74277(2013).
  3. Giraldo-Jaramillo, M., Garcia, A. G., Parra, J. R. Biology, thermal requirements, and estimation of the number of generations of Hypothenemus hampei (Ferrari, 1867) (Coleoptera: Curculionidae) in the state of São Paulo, Brazil. Journal of Economic Entomology. 111 (5), 2192-2200 (2018).
  4. Benavides, P., Góngora, C., Bustillo, A. IPM Program to Control Coffee Berry Borer Hypothenemus hampei, with Emphasis on Highly Pathogenic Mixed Strains of Beauveria bassiana, to Overcome Insecticide Resistance in Colombia. IntechOpen. , (2012).
  5. Martínez, C. P., Echeverri, C., Florez, J. C., Gaitan, A. L., Góngora, C. E. In vitro production of two chitinolytic proteins with an inhibiting effect on the insect coffee berry borer, Hypothenemus hampei (Ferrari) (Coleoptera: Curculionidae) and the fungus Hemileia vastatrix the most limiting pests of coffee crops. AMB Express. 2, 1-11 (2012).
  6. Padilla, B. E., Acuña, Z., Velásquez, C. S., Rubio, G. J. D. Inhibitors of [alpha]-amylases from the coffee berry borer Hypothenemus hampei in different plant species. Revista Colombiana de Entomología. 32 (2), 125-130 (2006).
  7. Alvarez, J. H., Cortina, H. A., Villegas, J. F. Methods to evaluate antibiosis to Hypothenemus hampei Ferrari in coffee under controlled conditions. Cenicafé. 52 (3), 205-214 (2001).
  8. Arcila, A., Duarte, A. F., Villalba, D. A., Benavides, P. New Product in the Integrated Management of the Coffee Berry Borer in Colombia. National Coffee Research Center (Cenicafé). , Available from: https://biblioteca.cenicafe.org/handle/10778/477 (2014).
  9. Jaramillo, J., Montoya, E., Benavides, P., Góngora, C. Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae for the control of coffee brocade in fruits on the ground. Revista Colombiana de Entomología. 41, 95-104 (2015).
  10. Bastidas, A., Velásquez, E., Benavides, P., Bustillo, A., Orozco, C. Evaluation of preformulated Beauveria bassiana (Bálsam) Vuillemin, for the control of the coffee berry borer. Agronomia. 17, 44-61 (2009).
  11. Villalba-Gault, D., Bustillo, A., Chaves Cordoba, B. Evaluation of insecticides for the control of the coffee berry borer in Colombia. Cenicafe. 46, 152-163 (1995).
  12. Bustillo, A. E., Orozco, J., Benavides, P., Portilla, M. Mass production and use of parasitoids for the control of the coffee berry borer in Colombia. Cenicafe. 47 (4), 215-230 (1996).
  13. Celestino, F. N., Pratissoli, D., Machado, L. C., Santos Junior, H. J. G. D., Mardgan, L., Ribeiro, L. V. Adaptation of breeding techniques of the coffee berry borer [Hypothenemus hampei (Ferrari). Coffee Science. 11 (2), 161-168 (2016).
  14. Domínguez, L., Parzanese, M. Ultraviolet light in food preservation. Argentine Foods. 52 (2), 70-76 (2012).
  15. Jaramillo, J., Chabi-Olaye, A., Poehling, H. M., Kamonjo, C., Borgemeister, C. Development of an improved laboratory production technique for the coffee berry borer Hypothenemus hampei, using fresh coffee berries. Entomologia Experimentalis et Applicata. 130 (3), 275-281 (2009).
  16. Pérez, J., Infante, F., Vega, F. E. Does the coffee berry borer (Coleoptera: Scolytidae) have mutualistic fungi. Annals of the Entomological Society of America. 98 (4), 483-490 (2005).
  17. Benavides, P., Gil, P., Góngora, C., Arcila, A. Integrated pest management. Cenicafe. Manual of the Colombian coffee grower: Research and technology for the sustainability of coffee growing. Manizales: FNC: Cenicafé. 3, 179-214 (2013).
  18. Bustillo, P. A review of the coffee berry borer, Hypothenemus hampei (Coleoptera: Curculionidae: Scolytinae), in Colombia. Revista Colombiana de Entomología. 32 (2), 101-116 (2006).
  19. Arcila, A., Benavides, P., Mejia, J. New Chemical Control Alternative for the Integrated Management of the Coffee Berry Borer. National Coffee Research Center (Cenicafé). , Available from: https://biblioteca.cenicafe.org/handle/10778/557 (2015).
  20. Tapias, L., Martinez, C., Benavides, P., Gongora, C. Laboratory method to evaluate the effect of insecticides on the coffee berry borer. Cenicafé. 68 (2), 76-89 (2017).
  21. Bustillo, A. E., Marín, P. How to reactivate the virulence of Beauveria bassiana to control the coffee berry borer. Manejo Integrado de Plagas. 63, (2002).
  22. Constantino, L. M., et al. morphological and genetic aspects of Hypothenemus obscurus and Hypothenemus hampei (Coleoptera: Curculionidae: Scolytinae). Revista Colombiana de Entomología. 37 (2), 173-182 (2011).
  23. Estrela, C., et al. Mechanism of action of sodium hypochlorite. Brazilian Dental Journal. 13 (2), 113-117 (2002).
  24. Diffey, B. L. Solar ultraviolet radiation effects on biological systems. Physics in Medicine and Biology. 36 (3), 299-328 (1991).
  25. BIOCAFE. , Available from: http://avispitas.blogspot.com/p/biocafe.html (2022).
  26. Bustillo, A. E., et al. Integrated Management of the Coffee Berry Borer: Hypothenemus hampei Ferrari in Colombia. , Available from: https://biblioteca.cenicafe.org/hangle/10778/848 (1998).
  27. Portilla, R. Development and evaluation of an artificial diet for the rearing of Hypothenemus hampei. Cenicafé. 50, 24-38 (1999).
  28. Portilla, R. M., Streett, D. A. New techniques for automated mass production of Hypothenemus hampei on the modified Cenibroca artificial diet. Cenicafé. 57, 37-50 (2006).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Insecticidewerkzaamheidgroene koffiebesinsectmortaliteitbioassay methodedesinfectie van vruchtenbehandeling na infestatieevaluatie van entomopathogenenbeoordeling van zaadbeschadiginginsectresistentie

Gerelateerde artikelen