Methodenartikel

Onderzoek naar de verlichtende effecten van toediening van Bacillus cereus op colitis door middel van darmmicrobiotamodulatie

DOI:

10.3791/63707

⸱

27 juli 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Life Sciences, Anhui University, 2Key Laboratory of Human Microenvironment and Precision Medicine of Anhui Higher Education Institutes, Anhui University, 3Anhui Key Laboratory of Modern Biomanufacturing, 4Institute of Physical Science and Information Technology, Anhui University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een protocol om het door antibiotica geïnduceerde pseudo-kiemvrije dextraansulfaat-natrium-geïnduceerde colitis-muismodel op te stellen om de rol van darmmicrobiota bij het reguleren van de positieve effecten van Bacillus cereus op colitis te onderzoeken.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aangenomen wordt dat dysbiose van de darmmicrobiota een rol speelt bij de progressie van colitis. De precieze normen voor de toediening van probiotica bij het verlichten van colitis blijven echter ongedefinieerd. De meeste analysemethoden zijn gebaseerd op een beperkte diversiteit en overvloed aan darmmicro-organismen. Daarom kunnen observationele studies geen oorzakelijk verband vaststellen. In deze studie hebben we antibiotica-geïnduceerde pseudo-kiemvrije muizen toegepast om de rol van darmmicrobiota te onderzoeken bij het reguleren van de probiotische effecten van Bacillus cereus (B. cereus) op dextraansulfaat-natrium (DSS)-geïnduceerde colitis bij muizen. Dit proces maakt het mogelijk om het bidirectionele regulerende effect van B . cereus-suppletie op de gezondheid te evalueren en levert stabiele en reproduceerbare resultaten op. Hier worden de gedetailleerde protocollen gegeven voor B. cereus-teelt , maagsondewerking, ontlasting en behandeling met antibioticaklaring bij colitismuizen. De optimalisatiemethoden zijn ook toepasbaar voor andere chronische inflammatoire aandoeningen. De resultaten toonden aan dat toediening van B. cereus het gewichtsverlies, de verkorting van de colonlengte, de ziekteactiviteitsindex en histopathologische scores verminderde. Behandeling met antibiotica onderdrukte echter het positieve effect van B. cereus op colitis. Deze resultaten geven aan dat darmmicrobiota nodig zijn voor de verlichtende effecten van B. cereus op colitis. Daarom is het onderzoeken van de gunstige effecten van probiotica in dit onderzoek een veelbelovende benadering voor het ontwikkelen van nieuwe behandelingsstrategieën voor het verlichten van de symptomen van chronische ontstekingsgerelateerde aandoeningen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Inflammatoire darmaandoeningen (IBD's) zijn veel voorkomende chronische gastro-intestinale ontstekingsaandoeningen, waaronder de ziekte van Crohn en colitis ulcerosa (UC)1. De huidige therapeutische mogelijkheden voor inflammatoire colitis zijn 5-aminosalicylaten, corticosteroïden, azathioprine en antibiotica2. Bovendien hebben deze medicijnen aanzienlijke bijwerkingen3. Daarom moeten we meer aandacht besteden aan het effect van probiotica op de behandeling van colitis.

Alternatieve therapeutische benaderingen omvatten probiotische toediening, die is gebruikt in diermodellen en klinische onderzoeken. Eerdere studies hebben aangetoond dat verschillende toedieningen van probiotica, zoals Bacillus cereus of Bifidobacterium infantis,colitis 4,5 kunnen verlichten. In preklinische studies moeten de effectiviteit en veiligheid van probiotica worden onderzocht in diermodellen.

Dextraalsulfaatnatrium (DSS) colitis muismodellen kunnen helpen bij het onderzoeken van de mechanismen van colitis en het evalueren van de positieve effecten van probiotica. De DSS-inducatie resulteert in erosies van het darmslijmvlies, disfunctie van de darmbarrière en een toename van de darmepitheliale permeabiliteit6. De meeste muismodellen voor probiotica hebben vooral biologische effecten benadrukt. Het mechanisme achter de toediening van dit probioticum is echter een uitdaging om te onderzoeken, gezien de beperking bij het verder verifiëren van het oorzakelijk verband tussen probiotica en de verlichting van colitis. Er is dus behoefte aan een gestandaardiseerde methode voor het onderzoeken van het mechanisme van probiotica.

Traditioneel vereisen deze onderzoeken het inoculeren van bepaalde probiotica in kiemvrije muizen7. Er zijn echter enkele laboratoriumbeperkingen bij het gebruik van kiemvrije muizen als receptoren voor probiotica, zoals de lage immuuncapaciteit en dure kiemvrije faciliteiten8. Om deze beperkingen te vermijden, werd een alternatief DSS-geïnduceerd colitismodel opgesteld met behulp van pseudo-kiemvrije muizen. Het pseudo-kiemvrije muismodel is tot stand gekomen door de toepassing van antibiotica zoals eerder beschreven 9,10.

In dit artikel stellen we pseudo-kiemvrije muizen vast met een antibioticacocktail. We beschrijven ook in detail de methodologie voor het opstellen en evalueren van colitismodellen bij muizen en onderzoeken de effecten van probiotica op het verlichten van colitissymptomen. Het onderstaande protocol biedt ook de methoden voor de afgifte van probiotica via een maagsonde.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen voor de zorg en het gebruik van proefdieren van de Anhui University, China, en alle procedures werden goedgekeurd door de Animal Ethics Committee van Anhui University, China (nr. IACUC(AHU)-2020-014).

1. Toediening van antibiotica

  1. Bereid een cocktail van antibiotica door ampicilline (1 g/l), neomycinesulfaat (1 g/l), metronidazol (0,5 g/l) en vancomycine (0,5 g/l) op te lossen in 1 l drinkwater5.
  2. Bewaar de oplossingen na volledige oplossing bij 4 °C.
  3. Doe de antibiotische cocktailoplossingen in een waterfles. Plaats de fles op de muizenkooi.
    NOTITIE: Zorg ervoor dat u bruine flessen gebruikt of wikkel de flessen in aluminiumfolie om de antibiotische oplossingen tegen licht te beschermen.
  4. Vervang de antibioticacocktail 2x per week door verse oplossingen.
  5. Laat de muizen de antibiotische cocktailoplossingen 4 weken vrij drinken.

2. Bereiding van DSS-drinkwater en inductie van colitis

  1. Om een 2,5% dextraansulfaat-natriumoplossing (DSS) te maken, lost u 2,5 g DSS op in 100 ml gedestilleerd water11.
  2. Vervang het drinkwater door de 2,5% DSS-oplossing in de muizengroep van het colitismodel. Zorg ervoor dat de muizen in de colitisgroep geen toegang hebben tot ander drinkwater. Behandel de controlemuizen ondertussen met gedestilleerd water zonder DSS.
  3. Eigen mannelijke C57BL/6J-muizen (gemiddeld lichaamsgewicht, 20 g ± 2 g; 7 weken oud) onder pathogeenvrije omstandigheden met vrije toegang tot standaard voedsel en water.
    OPMERKING: Huisvesting in totaal vijf muizen per kooi onder pathogeenvrije omstandigheden.
  4. Experimenteel ontwerp
    OPMERKING: De dierproeven zijn in twee fasen ontworpen. Voor elke groep werden vijf muizen geïncludeerd.
    1. Eerste fase: Om het positieve effect van B. cereus op het verlichten van colitis te beoordelen, worden de muizen willekeurig toegewezen aan de volgende drie groepen: controlegroep (controle), DSS-geïnduceerd colitismodel (DSS), probiotische B. cereus-suppletie voor DSS-geïnduceerde muizen (B. cereus).
    2. Tweede fase: Om de rol van de darmmicrobiota bij het reguleren van de probiotische effecten van B. cereus op door DSS geïnduceerde colitis te onderzoeken, worden de muizen willekeurig in de volgende drie groepen ingedeeld: ABX (controle), ABX (DSS) en ABX (B. cereus + DSS).
      1. Behandel de muizen in de ABX (controle) groep met fysiologische zoutoplossing.
      2. Na behandeling met antibiotische cocktailoplossingen gedurende 4 weken, laat de muizen in de ABX (DSS)-groep gedurende 1 week water krijgen met 2,5% DSS en gedurende 2 weken normale fysiologische zoutoplossing.
      3. Na behandeling met antibiotische cocktailoplossingen en DSS-water, behandelen de muizen van de ABX-groep (B. cereus + DSS) dagelijks met B. cereus (2 x 108 cellen) in 200 μL fysiologische zoutoplossing met behulp van een intragastrische canule gedurende 2 weken.
  5. Behandel de mannelijke C57BL/6-muizen na toediening van de antibioticacocktail onmiddellijk met 2,5% DSS-oplossing in drinkwater gedurende 7 dagen.
  6. Noteer het lichaamsgewicht van de muizen vóór de DSS-interventie als basisgewicht.

3. Kwantificering van B. cereus

  1. Bereid acht microcentrifugebuisjes van 1,5 ml voor, gevuld met 900 μl steriele normale zoutoplossing.
  2. Pipetteer 100 μL logaritmische groei B. cereus en los op in 900 μL steriele normale zoutoplossing.
  3. Verdun B. cereus serieel met behulp van tubes.
  4. Plaat 40 μL van elke verdunning op de respectieve LB-agarplaat met de verdunningsverhouding. Herhaal 3x voor elke verdunningsverhouding.
  5. Kweek de platen gedurende 16 uur in een incubator met constante temperatuur van 37 °C.
  6. Selecteer de platen met ~20-70 kolonies om te tellen. Bereken de gemiddelde bacterieconcentratie op basis van het verdunningsveelvoud van de geselecteerde platen.

4. Bereiding van B. cereus voor maagsonde

  1. Verzamel na de kwantificering van B. cereus 1 ml B. cereus-medium met 1 x 109 CFU en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 8.000 x g . Was vervolgens de bacteriecellen 2x met steriel water door centrifugatie op 8.000 x g gedurende 10 minuten en verwijder het supernatant.
  2. Verdun het geconcentreerde B. cereus met een steriele normale zoutoplossing tot een eindconcentratie van 2 x 108 kve/200 μl4.
  3. Pipetteer de verdunning herhaaldelijk op en neer om een gedispergeerde B. cereus-suspensie te verkrijgen.
  4. Kwantificeer de concentratie van B. cereus met behulp van de techniek van het tellen van platen voordat de maagsondemethode is voltooid.

5. Toepassing van B. cereus-supplementen via een maagsonde

  1. Dien de interventies (2 x 108 CFU probiotica in 200 μL normale zoutoplossing) op een vast tijdstip toe aan de muizen via een orale maagsonde.
  2. Om B. cereus toe te dienen, sluit u een maagsondenaald (vulnaalddikte: 20 G, 38 mm) aan op een spuit van 1 ml. Veeg de buitenkant van de maagsondenaald af met 70% ethanol tussen de muizen en zorg voor de juiste dosistoepassing.
  3. Om de muizen in bedwang te houden, pak je ze bij hun staart op en pak je de losse huid van de rug stevig vast met het uiteinde van de staart tussen de laatste twee vingers van de handler.
  4. Houd de muizen in een verticale positie. Steek vervolgens de sondenaald voorzichtig en voorzichtig door de mond in de slokdarm. Als er bij deze stap geen weerstand wordt ondervonden, duwt u de naald voorzichtig in de maag.
    OPMERKING: Bevestig een regelmatige en ongehinderde ademhaling van de muizen voordat het geneesmiddel wordt toegediend.
  5. Beweeg de naald langzaam vooruit en dien de B. cereus-oplossing toe. Trek de naald voorzichtig terug nadat de sonde is voltooid. Laat de muis los en plaats hem terug in zijn kooi.

6. Bepaling van de ziekteactiviteitsindex

OPMERKING: De ziekteactiviteitsindex (DAI) werd dagelijks berekend aan de hand van het gewichtsverlies van het lichaamsgewicht van de muizen, het fecale occulte bloed en de consistentie van de ontlasting.

  1. Meet dagelijks het lichaamsgewicht van de muizen. Wijs een score van 0-4 toe aan elke muis op basis van het percentage gewichtsverlies (0: 0%, 1: 1%-5%, 2: 6%-10%, 3: 11%-18% en 4: >18%).
  2. Verzamel verse ontlastingsmonsters van elke muis. Gebruik een wattenstaafje om de samentrekking van de anus te stimuleren om de ontlasting te bevorderen. Verzamel vervolgens de ontlastingsmonsters onmiddellijk na de ontlasting in een gesteriliseerde centrifugebuis.
  3. Bepaal het fecale occulte bloed door ontlasting occult bloedtestpapier. Verzamel 10 mg ontlastingsmonster op een applicatorstick.
  4. Plaats het preparaat op de testkaart en breng een dun uitstrijkje aan op de kaart. Open de achterflap en breng developer aan op het uitstrijkje.
  5. Scoor vervolgens binnen 120 s voor occult bloed met behulp van occult bloedtestpapier voor ontlasting.
    OPMERKING: Elk spoor van blauw op of aan de rand van het uitstrijkje is positief voor occult bloed. Fecale occulte scores waren als volgt: 0: Geen, 1: Hemoccult positief, 2: Licht, 3: Bloedsporen in de ontlasting en 4: Grove bloeding.
  6. Identificeer de consistentie van de ontlasting door het ontlastingsmonsterte detecteren 11. Ken een score van 0-4 toe (0: Normaal, 1: Dunne ontlasting, 2: Halfgevormde ontlasting, 3: Vloeibare ontlasting en 4: Diarree).

7. Weefselverzameling

  1. Verdoof de muizen door 10% chloraalhydraat (10 mg/kg) te injecteren aan het einde van de eerste en tweede fase van het experiment. Evalueer de diepte van de anesthesie bij muizen door de knijpterugtrekkingsreflex.
  2. Euthanaseer vervolgens de muizen door cervicale dislocatie.
  3. Bevestig de muizen in rugligging op de operatietafel en open de peritoneale holte.
  4. Scheid de hele dikke darm operatief en meet de lengte met een liniaal.
  5. Was vervolgens de dikke darm voorzichtig met een spuit van 5 ml gevuld met voorgekoelde PBS.

8. Beoordeling van histologische schade

  1. Snijd het darmweefsel in kleine fragmenten, fixeer ze in 4% paraformaldehyde en veranker ze in paraffine met behulp van een weefselinbeddingsmachine.
  2. Snijd vervolgens de in paraffine ingebedde weefsels met een microtoom om 4 μm dikke darmweefselcoupes voor te bereiden. Ontwas en dehydrateer de dikke darmsecties. Kleur vervolgens de dikke darmsecties met hematoxyline en eosine (H&E).
    OPMERKING: De monsters van de gekleurde dikke darm worden door de onderzoeker beoordeeld met een systeem voor de volgende maatregelen: mate van infiltratie van ontstekingscellen (Geen: 0, Licht: 1, Matig: 2, Ernstig: 3), slijmvliesbeschadiging (Geen: 0, Slijmlaag: 1, Submucosa: 2, Muscularis en serosa: 3), crypteschade (Geen: 0, 1/3: 1, 2/3: 2, geheel: 3, geheel + epitheelverlies: 4), bereik van laesies (%) (0%: 0, 1%-25%: 1, 26%-50%: 2, 51%-75%: 3, 76%-100%: 4). De totale histologische schadescore wordt berekend voor elke individuele score van de bovenstaande maatregelen5.
  3. Laat twee onafhankelijke onderzoekers de histologische scores van het monster evalueren (geblindeerd) onder een lichtmicroscoop.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

B. cereus suppletie en colitis
Het acute experimentele colitismodel werd geïnduceerd door de DSS-interventie in drinkwater. Figuur 1A toont het experimentele protocol voor toediening van B. cereus aan het colitis muismodel. DSS-inducatie verminderde duidelijk het lichaamsgewicht (Figuur 1B) en de lengte van de dikke darm. Het verlichtende effect van B. cereus via orale sonde werd on...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om probiotica in klinische studies te gebruiken, is het noodzakelijk om de werkzaamheid en veiligheid van probiotica in diermodellen te evalueren. De verstrekte protocollen zijn eerder geoptimaliseerd voor het evalueren van de ernst van colitis. Muizen die met DSS worden behandeld, zijn een model van darmontsteking, dat de klinische en histologische kenmerken nabootst die kenmerkend zijn voor colitis ulcerosa12. Acute colitis-modelmuizen worden gekenmerkt door gew...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd ten minste gedeeltelijk ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (K.S., subsidie nr. 32000081), de Natural Science Foundation van de provincie Anhui (K.S., subsidie nr. 1908085QC120), het Open Project-programma van het State Key Laboratory of Food Science and Technology, Jiangnan University (K.S., subsidie nr. SKLF-KF-201920), de Natural Science Foundation van Anhui Higher Education Institutions of China (K.S., subsidie nr. KJ2019A0040), de Doctoral Scientific Research Foundation van Anhui University (K.S., grant No. J01003316), de National Natural Science Foundation of China (Y.W., grant Nos. 31770066, 31470218), het Open Fund for Discipline Construction, Institute of Physical Science and Information Technology van Anhui University (Y.W.), en het Outstanding Talents Program van Anhui University, China (Y.W.).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.01 M PBS (poeder, pH7.2–7.4)SolarbioP1010-2L
Absolute ethyl alcoholHushi64-17-5
Acid alcohol fsat differentiatieoplossingBeyotimeNo.C0163S
AgarSangon Biotech9002-18-0
AmpicillinSolarbio69-53-4Bewaar bij 2–8 °C
Anaërobe incubatorLong YueLA1-3T
Dextran sulfaat natriumzout colitis graadMP Biomedicals160110
Elektrothermische incubatorSANFAHP-050A
Weerbaar weefselfixeermiddelbiosharpBL539A
GlycerinumHushi56-81-5
Hematoxyline en eosine kleuringskitBeyotimeNo.C0105
Kisser's Montage MediumBeyotimeNo.C0181
MetronidazolSolarbio443-48-1Bewaar bij 2–8 °C
Neomycine sulfaatSolarbio1405-10-3Bewaar bij 2–8 °C
Oscillerende incubatorShanghai ZhichuZQLY-180S
NatriumchlorideSangon Biotech7647-14-5
StooccultbloedtestpapierBasoBA2020B
TryptoneOXOID2285856
VancomycineSolarbio1404-93-9Bewaar bij 2–8 °C
XYleenHushi1330-20-7
GistextractSangon Biotech8013-01-2

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pittayanon, R., et al. Differences in gut microbiota in patients with vs without inflammatory bowel diseases: A systematic review. Gastroenterology. 158 (4), 960-946 (2020).
  2. Kuehn, F., Hodin, R. A. Impact of modern drug therapy on surgery: Ulcerative colitis. Visceral Medicine. 34 (6), 426-431 (2018).
  3. Harmand, P. -O., Solassol, J. Thiopurine drugs in the treatment of ulcerative colitis: Identification of a novel deleterious mutation in TPMT. Genes. 11 (10), 1212(2020).
  4. Sheng, K., et al. Synbiotic supplementation containing Bifidobacterium infantis and xylooligosaccharides alleviates dextran sulfate sodium-induced ulcerative colitis. Food & Function. 11 (5), 3964-3974 (2020).
  5. Sheng, K., et al. Probiotic Bacillus cereus alleviates dextran sulfate sodium-induced colitis in mice through improvement of the intestinal barrier function, anti-inflammation, and gut microbiota modulation. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 69 (49), 14810-14823 (2021).
  6. Wei, L., et al. PRKAR2A deficiency protects mice from experimental colitis by increasing IFN-stimulated gene expression and modulating the intestinal microbiota. Mucosal Immunology. 14 (6), 1282-1294 (2021).
  7. Souza, E. L. S., et al. Beneficial effects resulting from oral administration of Escherichia coli Nissle 1917 on a chronic colitis model. Beneficial Microbes. 11 (8), 779-790 (2020).
  8. Trinder, M., Daisley, B. A., Dube, J. S., Reid, G. Drosophila melanogaster as a high-throughput model for host-microbiota interactions. Frontiers in Microbiology. 8, 751(2017).
  9. Liang, W., et al. Colonization potential to reconstitute a microbe community in pseudo germ-free mice after fecal microbe transplant from equol producer. Frontiers in Microbiology. 11, 1221(2020).
  10. Hernandez-Chirlaque, C., et al. Germ-free and antibiotic-treated mice are highly susceptible to epithelial injury in DSS colitis. Journal of Crohns & Colitis. 10 (11), 1324-1335 (2016).
  11. Sheng, K., et al. Grape seed proanthocyanidin extract ameliorates dextran sulfate sodium-induced colitis through intestinal barrier improvement, oxidative stress reduction, and inflammatory cytokines and gut microbiota modulation. Food & Function. 11 (9), 7817-7829 (2020).
  12. Xu, X., et al. Histological and ultrastructural changes of the colon in dextran sodium sulfate-induced mouse colitis. Experimental and Therapeutic Medicine. 20 (3), 1987-1994 (2020).
  13. Zheng, L., et al. Jianpi Qingchang decoction alleviates ulcerative colitis by inhibiting nuclear factor-kappa B activation. World Journal of Gastroenterology. 23 (7), 1180-1188 (2017).
  14. Gao, X., et al. Symptoms of anxiety/depression is associated with more aggressive inflammatory bowel disease. Scientific Reports. 11, 1440(2021).
  15. Thippeswamy, B. S., et al. Protective effect of embelin against acetic acid induced ulcerative colitis in rats. European Journal of Pharmacology. 654 (1), 100-105 (2011).
  16. Sakai, S., et al. Astaxanthin, a xanthophyll carotenoid, prevents development of dextran sulphate sodium-induced murine colitis. Journal of Clinical Biochemistry and Nutrition. 64 (1), 66-72 (2019).
  17. Li, S., et al. Role of gut microbiota in the anti-colitic effects of anthocyanin-containing potatoes. Molecular Nutrition & Food Research. 65 (24), 2100152(2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Colitismodelprobiotische supplementatieDSS ge nduceerde colitisantibioticabehandelingtoediening via gavageoccult bloed in de ontlastinghistopathologie van het colonontstekingsziekten

Gerelateerde artikelen