Hier wordt een beschrijving gegeven van de eenvoudige en relatief snelle isolatie van Caenorhabditis elegans genomisch DNA van een of enkele dieren met behulp van een in de handel verkrijgbare weefselkit. Het resulterende gDNA-preparaat is een geschikt sjabloon voor PCR.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Kleinschalige extractie van Caenorhabditis elegans Genomisch DNA
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Genomische DNA-extractie uit enkele of enkele Caenorhabditis elegans heeft veel downstream-toepassingen, waaronder PCR voor genotyperingslijnen, klonen en sequencing. De traditionele proteïnase K-gebaseerde methoden voor genomische DNA-extractie uit C. elegans duren enkele uren. Commerciële extractiekits die de C. elegans-cuticula effectief openbreken en genomisch DNA extraheren, zijn beperkt. Een eenvoudige, snellere (~ 15 min) en kostenefficiënte methode voor het extraheren van C. elegans genomisch DNA dat goed werkt voor klaslokalen en onderzoekstoepassingen wordt hier gerapporteerd. Deze DNA-extractiemethode is geoptimaliseerd om enkele of enkele laatlarven (L4) of volwassen nematoden te gebruiken als uitgangsmateriaal voor het verkrijgen van een betrouwbare sjabloon om PCR uit te voeren. De resultaten geven aan dat de DNA-kwaliteit geschikt is voor het versterken van gendoelen van verschillende grootte door PCR, waardoor genotypering van enkele of enkele dieren mogelijk is, zelfs bij verdunningen tot een vijftigste van het genomische DNA van een enkele volwassene per reactie. De gerapporteerde protocollen kunnen betrouwbaar worden gebruikt om snel DNA-sjablonen te produceren uit een enkele of een kleine steekproef van C. elegans voor PCR-gebaseerde toepassingen.
Inleiding
Hier worden twee gerelateerde protocollen gepresenteerd voor de lysis van Caenorhabditis elegans om DNA toegankelijk te maken voor PCR-gebaseerde toepassingen. PCR is een veelgebruikte moleculaire techniek die voor veel toepassingen wordt gebruikt, waaronder genotypering en het versterken van DNA-fragmenten voor onder andere klonen en sequencing. De kleine (1 mm), vrijlevende rondworm C. elegans is een populair diersysteem voor biologisch onderzoek. Het verkrijgen van geschikt genomisch DNA van een enkel dier of een paar dieren is voldoende om de sequentie door PCR te versterken. Late L4-larven en volwassenen bevatten slechts ~ 1.000 somatische cellen (waaronder sommige multinucleaire, polyploïde cellen), geslachtscellen en (als het dier een gravid hermafrodiet is) nakomelingen in utero1. Deze dieren worden echter beschermd door een cuticula die moet worden verstoord om het genomische DNA2 te extraheren. Standaardmethoden om nematode genomische DNA-sjabloon voor PCR voor te bereiden, omvatten meerdere stappen en duren enkele uren. De dieren worden eerst ingevroren in een wormlysisbuffer met proteïnase K (−70 °C of lager) gedurende ten minste 15-45 minuten (langer wordt aanbevolen door sommige protocollen)3,4,5,6. Deze stap breekt de dieren open.
Na bevriezing worden de dieren gedurende 1 uur bij 60-65 ° C geïncubeerd om het proteïnase K te laten werken, waarna het enzym gedurende 15-30 minuten bij 95 ° C wordt geïnactiveerd. Het proteïnase K vernietigt de nucleasen die DNA afbreken. De inactivatie van proteïnase K vóór PCR is belangrijk om te voorkomen dat het proteïnase K het DNA-polymerase afbreekt. De twee kit-gebaseerde protocollen die hier worden beschreven, zijn snelle, betrouwbare en kosteneffectieve methoden om genomisch DNA te extraheren uit een enkel dier of een paar nematoden voor dagelijks onderzoek en het onderwijzen van laboratoriumtoepassingen. De gebruikte kit werd oorspronkelijk door de fabrikant geoptimaliseerd om DNA uit dierlijk weefsel, speeksel en haar te extraheren7. Het maakt gebruik van een gepatenteerde weefselpreparatieoplossing en extractieoplossing om cellen te lyseren en genomisch DNA toegankelijk te maken. Een gepatenteerde neutralisatieoplossing neutraliseert vervolgens de componenten die PCR kunnen remmen (bijv. Zouten, ionen en Mg2 + -bindende moleculen).
Bij genotypering kan een enkel dier worden getest. Bij het bepalen of een stam homozygoot is, geeft het testen van zes of meer nakomelingen van een enkel dier een hoge mate van vertrouwen dat een lijn homozygoot is of niet (er is een kans van 0,02% om willekeurig zes homozygote mutante nakomelingen te kiezen van een heterozygote ouder [(1/4)6 × 100% = 0,02%]). Deze methode 1) is eenvoudig, met minder stappen dan de proteïnase K-methode, en 2) vermindert de voorbereidingstijd van de sjabloon tot 15 minuten. De resultaten in dit werk tonen aan dat het ontwikkelde protocol robuust werkt bij het extraheren van genomisch DNA uit enkele of enkele wormen, die betrouwbaar kunnen worden gebruikt voor downstream-toepassingen die geen sterk gezuiverd DNA vereisen, inclusief PCR.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Onderhoud van C. elegans
OPMERKING: N2 (wild type) en blmp-1(tm548) C. elegans stammen werden gehandhaafd op standaard nematode groeimedia (NGM) platen bij 20 °C.
- Bereid NGM-platen door 23,005 g NGM-poeder op te lossen in 973 ml water in een kolf van 2 L. Dek de opening van de kolf af met aluminiumfolie (of autoclaveerbare dop die ontluchting mogelijk maakt) en bevestig de bekleding met autoclaaftape. Autoclaaf om het poeder op te lossen en de inhoud te steriliseren met een sterilisatiecyclus van ten minste 30 minuten.
- Koel het medium af tot 60 °C in een waterbad.
- Voeg aan het afgekoelde medium 25 ml steriele 1 M fosfaatbuffer (KH2PO4), pH 6,0, toe; 1 ml calciumchlorideoplossing van 1 m; en 1 ml magnesiumsulfaatoplossing van 1 M.
- Roer het medium op een magneetroerplaat om een homogeen mengsel te verkrijgen en om ongelijke afkoeling en stolling te voorkomen (~5 min). Zorg ervoor dat de roerstaaf snel genoeg draait om een vortex te creëren, maar niet zo snel dat er bellen worden geïntroduceerd (~ 250-300 rpm).
- Giet ~ 25 ml van het medium in elke petriplaat van 10 cm (~ 40 platen in totaal). Droog de platen 's nachts bij kamertemperatuur (meestal 16-25 °C).
- Kweek een kolonie Escherichia coli OP50 in 30-50 ml LB bouillon gedurende de nacht bij 37 °C.
- Zaai elke plaat met 500 μL E. coli OP50-cultuur en laat ze voor gebruik bij kamertemperatuur drogen (meestal 16-25 °C)8. Bewaar de platen bij 4 °C gedurende maximaal 3 weken.
- Breng C. elegans over op gezaaide platen met behulp van een draadprikker of een andere methode en laat ze uitgroeien tot L4 of volwassen stadium bij de temperatuur die nodig is voor de stam (meestal 16-25 °C, 1-2 dagen als dieren uitgehongerd als dauers, 3-4 dagen als dieren als embryo's zijn verguld)8.
2. DNA-extractie met één worm
OPMERKING: Deze methode is nuttig voor het extraheren van DNA uit een enkele worm (één worm in 1,8 μL van het totale volume). Een mastermix kan worden gemaakt als er meerdere wormen tegelijk worden gelyseerd.
- Programmeer een thermocycler voor één cyclus bij 55 °C gedurende 10 minuten gevolgd door 95 °C gedurende 3 minuten (lysisprogramma).
- Aliquot 0,8 μL van de extractieoplossing uit de kit op de binnenwand van een 0,2 ml PCR-buis op ijs. Voeg 0,2 μL van de weefselpreparaatoplossing uit de kit toe aan de druppel van de extractieoplossing. Mix door te pipetteren.
- Identificeer een L4 of volwassen dier onder een ontleedmicroscoop9. Om L4-hermafrodieten te identificeren, zoekt u naar een karakteristieke vulva die zichtbaar is als een bleke halve cirkel in het midden van het dier. Identificeer volwassen hermafrodieten door te zoeken naar de grootste dieren op de plaat die ovale embryo's zichtbaar kunnen hebben in hun baarmoeder.
- Breng met behulp van een platina draadprikker het geselecteerde dier over in de oplossing10.
- Centrifugeer de buis kort (2-3 s, ≤6.000 rpm/2.000 × g) bij kamertemperatuur om de inhoud aan de onderkant van de buis op te vangen.
- Plaats de buis in de thermocycler en voer het lysisprogramma uit dat is ingesteld bij stap 2.1.
- Wanneer het programma is voltooid, centrifugeer je de buis kort en plaats je deze op ijs. Voeg 0,8 μL van de neutralisatieoplossing uit de kit toe aan het mengsel. Mix door te pipetteren.
- Centrifugeer de buis kort bij kamertemperatuur (2-3 s, ≤6.000 tpm/2.000 × g).
- Gebruik het lysaat direct voor PCR of bewaar het bij 4 °C of −20 °C voor toekomstig gebruik.
OPMERKING: Geëxtraheerd DNA is stabiel bij 4 °C of −20 °C gedurende ten minste 6 maanden7.
3. DNA-extractie van enkele individuen
OPMERKING: Deze methode is handig voor het extraheren van DNA uit een paar wormen. Een mastermix kan worden bereid als er meerdere soorten tegelijk worden gelyseerd.
- Programmeer de thermocycler gedurende één cyclus bij 55 °C gedurende 10 minuten gevolgd door 95 °C gedurende 3 minuten (lysisprogramma).
- Aliquot 2,0 μL van de extractieoplossing uit de kit op de binnenwand van een 0,2 ml PCR-buis op ijs. Voeg 0,5 μL van de weefselpreparaatoplossing uit de kit toe aan de druppel extractieoplossing. Mix door te pipetteren.
- Identificeer L4 of volwassen dieren onder een ontleedmicroscoop9. L4 hermafrodieten hebben een karakteristieke vulva die zichtbaar is als een bleke halve cirkel in het midden van het dier. Volwassen hermafrodieten zijn de grootste dieren op de plaat en kunnen ovale embryo's zichtbaar hebben in hun baarmoeder.
- Breng met behulp van een platinadraadpluk een paar dieren over in de oplossing: 9 dieren leveren 1 dierlijk equivalent van genomisch DNA op per 0,5 μL lysaat en 16 dieren leveren ~1 dierlijk equivalent van genomisch DNA op in 0,25 μL (3,5 nematoden/μL)10.
OPMERKING: Het is moeilijk om meer dan 16 dieren in dit volume over te brengen. - Centrifugeer de buis kort bij kamertemperatuur (2-3 s, ≤6.000 tpm / 2.000 × g).
- Plaats de buis in de thermocycler en voer het lysisprogramma uit dat is ingesteld bij stap 3.1.
- Wanneer het programma is voltooid, centrifugeer je de buis kort en plaats je deze op ijs. Voeg 2 μL van de neutralisatieoplossing uit de kit toe aan het mengsel. Mix door te pipetteren.
- Centrifugeer de buis kort bij kamertemperatuur (2-3 s, ≤6.000 tpm/2.000 × g).
- Gebruik de lysis direct voor PCR of bewaar deze bij 4 °C of −20 °C voor toekomstig gebruik.
OPMERKING: Geëxtraheerd DNA is stabiel bij 4 °C of −20 °C gedurende ten minste 6 maanden7.
4. PCR-reactie
OPMERKING: Een downstream-toepassing van deze wormlysistechniek, het detecteren van een deletiemutatie met behulp van een snel polymerase, wordt beschreven. De effectiviteit van de twee wormlysisprotocollen bij het produceren van genomisch sjabloon-DNA voor succesvolle PCR bij verdunningen tot 1/50e van een worm per reactie wordt ook aangetoond.
- Extraheer DNA van een enkele worm en 16 wormen met behulp van wild-type N2 en mutante stammen, zoals hierboven beschreven in stap 2 en stap 3.
- Bereid 2-, 10-, 20- en 50-voudige verdunningen van single-worm DNA van wild-type N2-dieren.
- Stel PCR-reacties in volgens het protocol van de fabrikant met behulp van primers die specifiek zijn voor de volgorde van interesse en hot-start PCR-mastermix (tabel 1 en tabel 2). Gebruik 1 μL onverdund DNA of 2 μL verdund DNA als sjabloon in elke reactie.
- Bevestig de PCR-producten door gel-elektroforese en beeldvorming11.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Genomisch DNA van een enkele of enkele wild-type volwassenen werd geëxtraheerd met behulp van de commerciële kit of het traditionele lysisprotocol om de werkzaamheid van deze twee methoden te vergelijken. Deze lysaten werden vervolgens gebruikt als sjablonen voor PCR om ofwel een groter doel van ~ 2.100 bp (codering blmp-1) of een kleiner doel van ~ 500 bp (coderend voor een deel van sma-10) te versterken. Beide methoden leverden met succes geschikte PCR-producten op (figuur 1A
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het bepalen van de genotypen van C. elegans is een belangrijke stap bij het uitvoeren van genetische kruisingen om nieuwe C. elegans-stammen te creëren. Genomische DNA-extractie met behulp van een enkele of enkele C. elegans is een cruciale stap in het genotyperen van C. elegans. Dit protocol beschrijft genomische DNA-extractie van C. elegans met behulp van een commerciële kit. Deze methode is snel en werkt robuust. Het genomische DNA dat met deze methode wordt geëxtraheerd, k...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Dankbetuigingen
De N2-stam en E. coli OP50-bacteriën werden verkregen van het Caenorhabditis Genetics Center (CGC), dat wordt gefinancierd door NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). De blmp-1 (tm548) stam werd verkregen van het National Bioresource Project, Japan. De auteurs bedanken WormBase. Dit werk werd ondersteund door NIH R01GM097591 aan T.L.G., interne financiering door Texas Woman's University aan T.L.G. en TWU's Center for Student Research aan M.F.L.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| autoclave tape | Defend | 43237-2 | |
| aluminiumfolie, zwaar gebruik | Reynolds Wrap | 2182934 | |
| calciumchloride | Millipore Sigma | 102382 (CAS 10035-04-8) | |
| Extract-N-Amp kit (bevat Tissue Preparation Solution, Extraction Solution en Neutralization Solution) | Sigma-Aldrich Co. LLC | XNAT2-1KT | |
| Isotemp hotplate/roerder | Fisher Scientific | 11-100-495H | |
| LB media, Lennox, capsules | MP Biomedicals, LLC | 3002-131 | |
| magnesiumsulfaat, 97% puur, watervrij | Thermo Scientific | AC413485000 (CAS 7487-88-9) | |
| microcentrifuge | Labnet International, Inc. | PrismR, C2500-R | |
| NEB Q5U Hot Start High-Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs, Inc. | M0515S | "Pol E" gebruikt in Aanvullende Figuur S1, een snel, hoog-getrouw polymerase (20–30 s/kb) |
| NGM media poeder | US Biological Life Sciences | N1000 | |
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix met HF Buffer | New England Biolabs, Inc. | M0531S | "Pol D" in Figuur 1B, een snel, hoog-getrouw polymerase (15–30 s/kb) |
| primers | Integrated DNA Technologies | custom DNA oligos | |
| PrimeSTAR GXL polymerase | Takara Bio Inc. | R050B | "Pol C" in Figuur 1B, een hoog-getrouw polymerase (1 min/kb) voor GC-rijke templates en templates tot 30 kb |
| Quick-Load Purple 2-log DNA Ladder (0.1–10.0 kb) | New England Biolabs, Inc. | N0550S | |
| SapphireAmp Fast PCR Master Mix | Takara Bio Inc. | RR350A | "Pol A" in Figuur 1B, polymerase gebruikt in Figuur 1A, C, D, een snel polymerase (10 s/kb) voor targets tot 5 kb |
| Sigma ReadyMix Taq PCR reactiemix | Sigma-Aldrich Co. LLC | P4600 | "Pol B" in Figuur 1B, een polymerase (1 min/kb) voor targets tot 7 kb |
| SimpliAmp thermal cycler | Applied Biosystems | A24812 | |
| roerbar | Fisher Scientific | 14-512-126 | |
| vortex mixer | Fisher Scientific | 2215365 | |
| worm pick | Genesee Scientific Corporation | 59-AWP |
Referenties
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans. WormBook. , ed. The C. elegans Community, WormBook 1-31 (2015).
- Page, A. P., Johnstone, I. L. The cuticle. WormBook. , ed. The C. elegans Community, WormBook (2007).
- Williams, B. D., Schrank, B., Huynh, C., Shownkeen, R., Waterston, R. H. A genetic mapping system in Caenorhabditis elegans based on polymorphic sequence-tagged sites. Genetics. 131, 609-624 (1992).
- Lissemore, J. L., Lackner, L. L., Fedoriw, G. D., De Stasio, E. A. Isolation of Caenorhabditis elegans genomic DNA and detection of deletions in the unc-93 gene using PCR. Biochemistry and Molecular Biology Education. 33, 219-226 (2005).
- Fay, D., Bender, A. SNPs: introduction and two-point mapping. WormBook. , ed. The C. elegans Community, WormBook 1-10 (2008).
- Biron, D. C. elegans: Methods and Applications. Haspel, G. , Humana Press. Totowa, NJ. (2015).
- Sigma-Aldrich. Extract-N-Amp Tissue PCR Kit technical bulletin. , Available from: https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/249/244/xnat2bul.pdf (2013).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , ed. The C. Elegans Research Community, Wormbook (2006).
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (27), e1152(2009).
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (47), e2293(2011).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (62), e3923(2012).
- Gumienny, T. L., et al. Caenorhabditis elegans SMA-10/LRIG is a conserved transmembrane protein that enhances bone morphogenetic protein signaling. PLoS Genetics. 6, 1000963(2010).
- Nelson, M. D., et al. A bow-tie genetic architecture for morphogenesis suggested by a genome-wide RNAi screen in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 7, 1002010(2011).
- Zhang, L., Zhou, D., Li, S., Jin, C. BLMP-1 contributes to collagen-related morphogenesis in C. elegans. Life Science Journal. 9, 1080-1088 (2012).
- Horn, M., et al. DRE-1/FBXO11-dependent degradation of BLMP-1/BLIMP-1 governs C. elegans developmental timing and maturation. Developmental Cell. 28, 697-710 (2014).
- Huang, T. -F., et al. BLMP-1/Blimp-1 regulates the spatiotemporal cell migration pattern in C. elegans. PLoS Genetics. 10, 1004428(2014).
- Lakdawala, M. F., Madhu, B., Faure, L., Vora, M., Padgett, R. W., Gumienny, T. L. Genetic interactions between the DBL-1/BMP-like pathway and dpy body size-associated genes in Caenorhabditis elegans. Molecular Biology of the Cell. 30, 3151-3160 (2019).
- Madeira, F., et al. The EMBL-EBI search and sequence analysis tools APIs in 2019. Nucleic Acids Research. 47, 636-641 (2019).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
