Methodenartikel

Een spin-tipverrijkingsstrategie voor gelijktijdige analyse van N-glycopeptiden en fosfopeptiden uit menselijke pancreasweefsels

DOI:

10.3791/63735

⸱

4 mei 2022

 ,  , 
1Department of Chemistry, University of Wisconsin-Madison, 2School of Pharmacy, University of Wisconsin-Madison

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Posttranslationele modificaties (PTM's) veranderen eiwitstructuren en -functies. Methoden voor de gelijktijdige verrijking van meerdere PTM-typen kunnen de dekking in analyses maximaliseren. We presenteren een protocol met behulp van dual-functionele Ti(IV)-geïmmobiliseerde metaalaffiniteitschromatografie gevolgd door massaspectrometrie voor de gelijktijdige verrijking en analyse van eiwit N-glycosylatie en fosforylering in pancreasweefsels.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Massaspectrometrie kan een diepe dekking bieden van posttranslationele modificaties (PTM's), hoewel verrijking van deze modificaties uit complexe biologische matrices vaak noodzakelijk is vanwege hun lage stoichiometrie in vergelijking met niet-gemodificeerde analyten. De meeste verrijkingsworkflows van PTM's op peptiden in bottom-up proteomics-workflows, waarbij eiwitten enzymatisch worden verteerd voordat de resulterende peptiden worden geanalyseerd, verrijken slechts één type modificatie. Het is echter het hele complement van PTM's dat leidt tot biologische functies, en verrijking van een enkel type PTM kan een dergelijke kruisverwijzing van PTM's missen. PTM-kruisverwijzing is waargenomen tussen eiwitglycosylering en fosforylering, de twee meest voorkomende PTM's in menselijke eiwitten en ook de twee meest bestudeerde PTM's met behulp van massaspectrometrieworkflows. Met behulp van de hierin beschreven simultane verrijkingsstrategie worden beide PTM's verrijkt uit postmortaal menselijk pancreasweefsel, een complexe biologische matrix. Dual-functionele Ti(IV)-geïmmobiliseerde metaalaffiniteitschromatografie wordt gebruikt om verschillende vormen van glycosylering en fosforylering tegelijkertijd in meerdere fracties te scheiden in een handige op spintip gebaseerde methode, waardoor downstream-analyses van potentiële PTM-overspraakinteracties mogelijk zijn. Deze verrijkingsworkflow voor glyco- en fosfopeptiden kan worden toegepast op verschillende monstertypen om diepe profilering van meerdere PTM's te bereiken en potentiële doelmoleculen voor toekomstige studies te identificeren.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eiwit posttranslationele modificaties (PTM's) spelen een belangrijke rol bij het moduleren van eiwitstructuren en bijgevolg hun functies en downstream biologische processen. De diversiteit van het menselijke proteoom neemt exponentieel toe als gevolg van de combinatorische variabiliteit die wordt geboden door verschillende PTM's. Verschillende varianten van eiwitten uit hun canonieke sequenties zoals voorspeld door het genoom staan bekend als proteoformen, en veel proteoformen komen voort uit PTM's1. Het bestuderen van proteoforme diversiteit in gezondheid en ziekte is de afgelopen jaren een onderzoeksgebied van groot belang geworden 2,3.

De studie van proteoformen en meer specifiek PTM's met grote diepgang is gemakkelijker geworden door de ontwikkeling van op massaspectrometrie (MS) gebaseerde proteomics-methoden. Met behulp van MS worden analyten geïoniseerd, gefragmenteerd en geïdentificeerd op basis van de m/z van fragmenten. Verrijkingsmethoden zijn vaak nodig vanwege de lage relatieve abundantie van PTM's in vergelijking met niet-gemodificeerde vormen van eiwitten. Hoewel de analyse van intacte eiwitten en hun PTM's, top-down analyses genoemd, meer routine zijn geworden, is de enzymatische vertering van eiwitten en de analyse van hun componentpeptiden in bottom-up analyses nog steeds de meest gebruikte route voor PTM-analyse. De twee meest bestudeerde PTM's, en de twee meest voorkomende PTM's in vivo, zijn glycosylering en fosforylering4. Deze twee PTM's spelen een belangrijke rol in celsignalering en -herkenning en zijn dus belangrijke wijzigingen om te karakteriseren in ziekteonderzoek.

De chemische eigenschappen van verschillende PTM's bieden vaak routes naar verrijking van deze PTM's op eiwit- en peptideniveaus voorafgaand aan de analyse. Glycosylering is een hydrofiele PTM vanwege de overvloed aan hydroxylgroepen op elke monosaccharide. Deze eigenschap kan worden gebruikt om glycopeptiden te verrijken in hydrofiele interactiechromatografie (HILIC), die meer hydrofiele glycopeptiden kan scheiden van de hydrofobe niet-gemodificeerde peptiden5. Fosforylering voegt het fosfaatgedeelte toe, dat negatief geladen is, behalve bij zure pH. Vanwege deze lading kunnen verschillende metaalkationen, waaronder titanium, worden gebruikt om fosfopeptiden aan te trekken en te binden, terwijl niet-gefosforyleerde soorten worden weggespoeld. Dit is het principe van geïmmobiliseerde metaalaffiniteitschromatografie (IMAC). Verdere discussies over deze en andere verrijkingsstrategieën voor glycosylering en fosforylering zijn te vinden in recente beoordelingen 6,7.

Relatief grote hoeveelheden uitgangspeptidemateriaal (0,5 mg of meer) zijn vaak nodig voor verrijkingsprotocollen vanwege de lage stoichiometrie van PTM's op peptiden. In scenario's waarin deze hoeveelheid monster mogelijk niet gemakkelijk kan worden verkregen, zoals tumorkernbiopsie of cerebrospinale vloeistofanalyses, is het nuttig om gemakkelijke workflows te gebruiken die resulteren in maximale biomoleculaire informatie. Recente strategieën ontwikkeld door ons laboratorium en anderen hebben de gelijktijdige en parallelle analyse van glycosylering en fosforylering benadrukt met behulp van dezelfde PTM-verrijkingsworkflow 8,9,10,11,12. Hoewel de chemische eigenschappen van deze twee PTM's kunnen verschillen, kunnen deze PTM's in meerdere stappen worden geanalyseerd vanwege de innovatieve scheidingstechnieken en gebruikte materialen. Elektrostatische repulsie-hydrofiele interactiechromatografie (ERLIC) overlays bijvoorbeeld scheidingen op basis van hydrofiele interacties tussen analyten en de mobiele fase met lading-ladingsinteracties tussen analyten en het stationaire fasemateriaal 13,14,15,16. Bij zure pH kan de aantrekkingskracht van gefosforyleerde peptiden naar de stationaire fase hun retentie en scheiding van niet-gemodificeerde peptiden verbeteren. Materiaal bestaande uit Ti(IV) geïmmobiliseerd op hydrofiele microsferen kan worden gebruikt voor HILIC en IMAC-gebaseerde elutie om fosfopeptiden en neutrale, zure en mannose-6-gefosforyleerde glycopeptidente scheiden 17,18. Deze strategie staat bekend als dual-functionele Ti(IV)-IMAC. Het gebruik van deze strategieën voor het verrijken van meerdere PTM's in één workflow kan analyses van potentiële PTM-overspraakinteracties toegankelijker maken. Bovendien zijn de totale hoeveelheid monster en tijdsvereisten minder dan de conventionele verrijkingsmethoden wanneer ze parallel worden uitgevoerd (d.w.z. HILIC en IMAC op afzonderlijke monsteraliquots).

Om de dual-functionele Ti (IV) -IMAC-strategie voor gelijktijdige analyse van eiwitglycosylering en fosforylering te demonstreren, hebben we deze toegepast om postmortale menselijke pancreasweefsels te analyseren. De alvleesklier produceert zowel spijsverteringsenzymen als regulerende hormonen, waaronder insuline en glucagon. De pancreasfunctie is aangetast bij pancreasaandoeningen. Bij diabetes wordt de regulatie van de bloedsuikerspiegel beïnvloed, wat leidt tot hogere glucosespiegels in het bloed. Bij pancreatitis is een ontsteking het gevolg van autovertering van het orgaan3. Veranderingen in PTM-profielen, waaronder glycosylering en fosforylering, kunnen, zoals vaak het geval is, resulteren in andere ziekten.

Hier beschrijven we een protocol voor een op spin-tip gebaseerde gelijktijdige verrijkingsmethode, gebaseerd op een dual-functionele Ti (IV) -IMAC-strategie, voor N-glycopeptiden en fosfopeptiden afgeleid van eiwitten geëxtraheerd uit pancreasweefsel. Het protocol omvat eiwitextractie en -vertering, verrijking, MS-gegevensverzameling en gegevensverwerking, zoals te zien is in figuur 1. Representatieve gegevens uit deze studie zijn beschikbaar via ProteomeXchange Consortium met identifier PXD033065.

figure-introduction-1
Figuur 1: Workflow voor gelijktijdige analyse van N-glycopeptiden en fosfopeptiden uit menselijke pancreasweefsels. Weefsels worden eerst gecryopiseerd tot een fijn poeder voordat eiwit wordt geëxtraheerd met behulp van het wasmiddel natriumdodecylsulfaat (SDS). Eiwitten worden vervolgens onderworpen aan enzymatische spijsvertering. De resulterende peptiden worden gealiquoteerd voorafgaand aan verrijking met behulp van dual-functionele Ti(IV)-IMAC. Ruwe gegevens worden verzameld met behulp van nanoschaal omgekeerde fase vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (nRPLC-MS) en worden geanalyseerd met behulp van database zoeksoftware. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Dit protocol is bedoeld om PTM-analyses toegankelijker te maken en een bredere analyse van meerdere PTM's in dezelfde workflow mogelijk te maken. Dit protocol kan worden toegepast op andere complexe biologische matrices, waaronder cellen en biovloeistoffen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Toestemming werd verkregen voor het gebruik van pancreasweefsels voor onderzoek van de nabestaanden van de overledene en een toestemming van de University of Wisconsin-Madison Health Sciences Institutional Review Board werd verkregen. IRB-toezicht is niet vereist omdat het geen menselijke proefpersonen betreft zoals erkend door 45 CFR 46.102 (f).

LET OP: Voorzichtigheid is geboden bij het hanteren van de reagentia die in dit protocol worden gebruikt, waaronder zuren (mierenzuur, azijnzuur, trifluorazijnzuur), basen (ammoniumhydroxide) en cryogenen (vloeibare stikstof). Lees de veiligheidsinformatiebladen voor de gebruikte reagentia om vertrouwd te raken met de bijbehorende gevaren en de benodigde voorzorgsmaatregelen. Concentraties die worden aangeduid met percentages zijn volume/totaal volume (v/v) en worden verdund met water.

1. Cryoverpulvering, lysis en eiwitextractie van weefsel

  1. Vul een dewar met vloeibare stikstof. Koel de delen van de weefselverpulverizer die in contact komen met de pancreasweefsels, namelijk de kamer, verpulverizer en herstellepel vooraf in een polystyreencontainer.
  2. Breng de bevroren stukjes weefsel over in de voorgekoelde monsterhouder en voeg een lepel vloeibare stikstof toe aan het weefsel.
  3. Plaats de vergruizer in de kamer en sla er vijf tot tien keer met een hamer op om het monster te verpletteren. Verwijder de verpulverizer uit de kamer en schraap het aanhangende weefselpoeder en de stukjes eraf.
  4. Voeg een lepel vloeibare stikstof toe aan de kamer als weefsels beginnen te smelten. Herhaal het verpulveringsproces totdat het monster een fijn poeder is zonder grote weefselbrokken. Verdeel de monsters in ongeveer 100 mg aliquots in voorgekoelde buizen.
  5. Bereid lysisbuffer met 4% natriumdodecylsulfaat (SDS), 150 mM NaCl en 25 mM Tris (pH = 7,4). Los één tablet protease- en fosfataseremmer op in 500 μL water voor een voorraad van 20x van elk. Voeg het vereiste volume van 20x voorraad van elke remmer toe aan de lysisbuffer voor een uiteindelijke concentratie van 1x.
  6. Voeg 600 μL lysisbuffer per 100 mg weefsel toe aan de buis en incubeer bij 95 °C in een verwarmingsblok gedurende 10 minuten met schudden bij 800 tpm. Haal de monsters uit het verwarmingsblok en laat ze afkoelen tot kamertemperatuur.
  7. Soniceer de monsters met 60 W energie (20 kHz) gedurende 45 s met behulp van 15 s pulsen met een rust van 30 s ertussen. Pelleteer de monsters bij 3.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C.
  8. Voeg het supernatant toe aan een 5x precipitatieoplosmiddel, 300 μL lysisbuffer tot 1,5 ml precipitatieoplosmiddel, dat 50% aceton, 49,9% ethanol en 0,1% azijnzuur bevat. Koel 's nachts bij -20 °C.
  9. Pelleteer de monsters opnieuw op 3.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C en verwijder het supernatant. Was de pellet door te breken met een spatel en te mengen met dezelfde hoeveelheid precipitatie-oplosmiddel. Pellet nogmaals, de wasstap 2x herhalen.
  10. Pelleteer het monster bij 16.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C. Droog de monsterpellet gedurende 15 minuten aan de lucht in een zuurkast en bewaar bij -80 °C totdat het klaar is om verder te gaan.

2. Eiwitvertering en ontzouting

  1. Resuspendeer de eiwitpellet in 300 μL vers gemaakte digestiebuffer met 50 mM triethylammoniumbicarbonaat (TEAB) en 8 M ureum.
  2. Schat de eiwitconcentratie van de oplossing met behulp van een eiwittest volgens het protocol van de fabrikant.
  3. Voeg aan het eiwit in de oplossing dithiothreitol (DTT) toe tot een uiteindelijke concentratie van 5 mM, meng en verlaag bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Voeg vervolgens jodoacetamide (IAZ) toe aan een eindconcentratie van 15 mM, meng en alkylaat bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten in het donker. Doof alkylering door de toevoeging van DTT in hetzelfde volume als voorheen te herhalen en meng.
  4. Voeg LysC/trypsine toe in een verhouding tussen 1:100 enzym en eiwit en incubeer bij 37 °C gedurende 4 uur. Voeg vervolgens 50 mM TEAB toe om het ureum van 8 M te verdunnen dat wordt gebruikt om 1 M te <. Voeg trypsine toe in een verhouding van 1:100 enzym: eiwit en incubeer 's nachts bij 37 °C.
  5. Doof de spijsvertering met de toevoeging van trifluorazijnzuur (TFA) tot 0,3% v/v. Voor elke 1 mg starteiwit, conditioneer een ontzoutingspatroon (1 cc, 10 mg) met 1 ml acetonitril (ACN) en 3x met 1 ml van 0,1% TFA.
  6. Plaats het verteerde mengsel op de ontzoutingspatroon. Was het mengsel 3x met 1 ml van 0,1% TFA. Als de elutie langzaam is, oefen dan positieve druk uit, maar vermijd een debiet > één druppel per seconde.
  7. Elutepeptiden met 1 ml 60% ACN en 0,1% mierenzuur (FA) oplossing. Droog geëlueerde peptiden bij ongeveer 35 °C met behulp van een centrifugale vacuümconcentrator totdat het oplosmiddel volledig is verdampt.
  8. Resuspend peptiden in 300 μL water en schat peptideconcentraties met behulp van een peptide-assay volgens het protocol van de fabrikant. Deel de peptiden in 500 μg aliquots en droog volledig.

3. ERLIC N-glycopeptide verrijking

OPMERKING: Exacte centrifugesnelheden en -tijden kunnen verschillen op basis van monsters en moeten worden geoptimaliseerd. Over het algemeen is 300 x g gedurende 2 minuten geschikt voor conditionering en wassen van het materiaal en 100 x g gedurende 5 minuten voor eluting.

  1. Weeg ongeveer 3 mg watten af en verpak deze in een lege pipetpunt van 200 μL (spinpunt; zie Materiaaltabel).
  2. Breng sterk anionenwisselingsverrijkingsmateriaal over in een buis en voeg 200 μL 0,1% TFA per 10 mg materiaal toe. Gebruik voor de verrijking van 500 μg peptiden 15 mg van het materiaal. Activeer het materiaal door gedurende 15 minuten te schudden.
  3. Plaats met behulp van een buisadapter de spinpunt over een buis van 2 ml en voeg voldoende drijfmest toe aan de punt voor 15 mg materiaal. Verwijder de vloeistof door in een benchtopcentrifuge te draaien.
  4. Conditioneer het materiaal door 3x te centrifugeren met 200 μL ACN. Herhaal de drievoudige conditionering met 100 mM ammoniumacetaat (NH4Ac), 1% TFA en 80% ACN/0,1% TFA (laadbuffer).
  5. Resuspendeer 500 μg peptidemonsters in ongeveer 200 μL laadbuffer en stroom door de spin-tip. Herlaad de doorstroom 2x om volledige binding te garanderen.
  6. Was het materiaal door 5x te centrifugeren met 200 μL van 80% ACN/0,1% TFA en vervolgens 2x met 200 μL van 80% ACN/0,1% FA.
  7. Eluteer de peptiden door te centrifugeren met 200 μL van elk van de volgende: 50% ACN / 0,1% FA (E1); 0,1% FA (E2); 0,1% TFA (E3); 300 mM KH2PO4, 10% ACN (E4).
  8. Was het materiaal door 2x te centrifugeren met 200 μL van 80% ACN/5% NH4OH. Eluteer de resterende peptiden met 200 μL van 10% NH4OH (E5).
  9. Droog alle eluties volledig met behulp van een centrifugale vacuümconcentrator bij ongeveer 35 °C.
  10. Voer het ontzouten van de basiselution (E5) uit met behulp van een ontziltingstip volgens het protocol van de fabrikant.
  11. Droog de elutie van de ontziltingspunt met behulp van een centrifugaalvacuümconcentrator bij ongeveer 35 °C tot volledigheid.

4. Ti(IV)-IMAC fosfopeptide verrijking

OPMERKING: Exacte centrifugesnelheden en -tijden kunnen verschillen op basis van monsters en moeten worden geoptimaliseerd. Over het algemeen is 300 x g gedurende 2 minuten geschikt voor conditionering en wassen van het materiaal en 100 x g gedurende 5 minuten voor eluting.

  1. Weeg ongeveer 3 mg watten en verpak het in een lege pipetpunt van 200 μL (spin-tip).
  2. Breng Ti-IMAC fosfopeptideverrijkingsmateriaal over in een buis en voeg 200 μL 0,1% TFA per 10 mg materiaal toe. Gebruik voor de verrijking van 500 μg peptiden 10 mg materiaal.
  3. Plaats met behulp van een buisadapter de spin-tip over een buis van 2 ml en voeg voldoende slurry toe aan de tip voor 10 mg materiaal. Verwijder de vloeistof door in een benchtopcentrifuge te draaien.
  4. Conditioneer het materiaal met 200 μL van 40% ACN/3% TFA met dezelfde centrifuge-instellingen als hierboven beschreven. Resuspend peptide monsters in 200 μL van 40% ACN/3% TFA en stroom door de spin-tip. Laad de doorstroom twee keer opnieuw om een completere binding te garanderen.
  5. Was het materiaal door te centrifugeren met 200 μL 50% ACN, 6% TFA en 200 mM NaCl-oplossing, gevolgd door 2x in 200 μL van 30% ACN en 0,1% TFA-oplossing te wassen.
  6. Elute peptiden met 200 μL van 10% NH4OH. Droog de elutie volledig onder vacuüm. Voer ontzouting uit met behulp van een ontziltingstip volgens het protocol van de fabrikant. Droog de elutie van de ontzoutingspunt onder vacuüm tot volledigheid.

5. Dual-functionele Ti(IV) gelijktijdige verrijking

OPMERKING: Exacte centrifugesnelheden en -tijden kunnen verschillen op basis van monsters en moeten worden geoptimaliseerd. Over het algemeen is 300 x g gedurende 2 minuten geschikt voor conditionering en wassen van het materiaal en 100 x g gedurende 5 minuten voor eluting.

  1. Weeg ongeveer 3 mg watten en verpak het in een lege spin-tip.
  2. Breng ongeveer 1 g Ti(IV)-IMAC-materiaal over in een buis. Voeg 0,1% TFA toe aan een bekende concentratie materiaal, bijvoorbeeld 20 mg/200 μL (materiaal kan in deze suspensie bij 4 °C worden bewaard).
  3. Voeg voor verrijking van 500 μg peptiden voldoende drijfmest toe aan een spin-tip om 20 mg materiaal over te brengen. Was de spin-tip door te centrifugeren met 200 μL van 0,1% TFA.
  4. Resuspendeer de monsters in 200 μL laad-/wasmiddel (80% ACN en 3% TFA) en stroom door de spin-tip. Herlaad de doorstroom 2x.
  5. Was de centrifugeer 6x door te centrifugeren met 200 μL laad-/wasmiddel. Was de spin-tip met 200 μL 80% ACN/0,1% FA-oplossing.
  6. Eluteer de peptiden met 200 μL van elk van de volgende: 60% ACN/0,1% FA (E1) en 40% ACN/0,1% FA (E2). Analyseer elke elutie afzonderlijk.
  7. Eluteer de peptiden met 200 μL van elk van de volgende: 20% ACN / 0,1% FA en 0,1% FA. Combineer de twee ellutionen en analyseer als één monster (E3).
  8. Eluteer de peptiden met 200 μL van elk van de volgende: 40% ACN/3% TFA; 50% ACN/6% TFA, 200 mM NaCl; en 30% ACN/0,1% TFA. Combineer deze ellutions en analyseer als één (E4) na ontzouting met behulp van een verpakte punt.
  9. Conditioneer het materiaal tot een basis-pH met 200 μL van 90% ACN/2,5% NH4OH voor 3x. Gooi deze wasbeurten weg.
  10. Eluteer de peptiden met 200 μL van elk van de volgende: 60% ACN/10% NH4OH (E5) en 40% ACN/10% NH4OH (E6). Analyseer deze ellutions afzonderlijk na ontzouting met behulp van een verpakte punt.
  11. Eluteer de peptiden met 200 μL van elk van de volgende: 20% ACN/10% NH4OH; 10% ACN/10% NH4OH; en 10% NH4OH. Combineer deze ellutions en analyseer als één (E7) na ontzouting met behulp van een verpakte punt.
  12. Droog alle eluties volledig onder vacuüm.

6. Nano-flow omgekeerde fase vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (nRPLC-MS)

OPMERKING: MS-methoden voor gegevensverzameling en -analyse zijn divers en daarom wordt slechts één voorgestelde LC-MS-pijplijn (en de bijbehorende parameters) hier in de volgende stappen beschreven. Monsters die zijn gegenereerd met behulp van de eerder geschetste monstervoorbereidings- en verrijkingsstappen kunnen worden geanalyseerd met behulp van andere instrumentele opstellingen, inclusief het gebruik van in de handel verkrijgbare chromatografische kolommen, mits voldoende gegevenskwaliteit.

  1. Trek en verpak een 15 cm lang capillair (75 μm binnendiameter) met behulp van C18-materiaal zoals beschreven in19. Bereid mobiele fase A (0,1% FA in water) en mobiele fase B (0,1% FA in ACN) voor.
  2. Reconstitueer verrijkte peptidemonsters in 15 μL van 3% mobiele fase B. Laad 2 μL van het monster (~ 13% monstervolume) rechtstreeks op de kolom. Analyseer elk monster in technisch duplicaat.
  3. Elutepeptiden met een gradiënt van 3% naar 30% mobiele fase B gedurende 90 minuten bij een stroomsnelheid van 0,3 μL/min. Was de kolom met 75% B gedurende 8 minuten gevolgd door 95% B gedurende 8 minuten en eindig de methode met evenwicht op 3% B gedurende 12 minuten.
  4. Bedien de massaspectrometer in de positieve ionmodus met behulp van gegevensafhankelijke acquisitie van de bovenste 20 pieken met de volgende parameters: spuitspanning 2 kV; MS1-detectie in LC/MS van 400-2.000 m/z bij een resolutie van 120.000, 2E5 AGC-doel (automatic gain control), maximale injectietijd van 100 ms, 30% RF-lens, quadrupole-isolatie met 1,6 m/z-venster , voor laadtoestanden 2-8 en onbepaald, en dynamische uitsluiting van 30 s; MS2-detectie in de LC/MS met behulp van getrapte HCD-fragmentatie bij 22%, 30% en 38%, vaste eerste massa 120 m/z bij 30.000 resolutie, 5E4 AGC-doel en 2,5E4 minimale intensiteitsvereiste.

7. Gegevensanalyse van de lidstaten

OPMERKING: Een pijplijn voor gegevensanalyse met behulp van twee verschillende software om dezelfde gegevensset te analyseren, wordt hier gepresenteerd. Fosforylering en glycosylatie kunnen tegelijkertijd worden doorzocht met behulp van een enkele software in plaats van twee afzonderlijke software zoals hier beschreven, hoewel over het algemeen de zoektijd van software evenredig is met de zoekruimte, d.w.z. het aantal beschouwde PTM's. Om deze reden worden twee verschillende software gebruikt parallel aan de zoektocht naar glycopeptiden en fosfopeptiden.

  1. Verwerk onbewerkte gegevensbestanden met behulp van de juiste software (zie Materiaalopgave).
    1. Zoek spectra tegen de UniProt menselijke (of geschikte soortspecifieke) database. Stel carbamidomethylatie van Cys in als een vaste modificatie. Stel het maximum aantal gemiste enzymatische decolleté's in op twee.
  2. Zoek in de onbewerkte gegevensbestanden met behulp van commerciële software (zie Tabel met materialen) naar glycopeptiden die moeten worden geanalyseerd20. Gebruik een 10 ppm precursor massatolerantie en een 0,01 Da fragment massatolerantie met een minimale peptidelengte van vier residuen.
    1. Zoeken met behulp van de software-embedded N-glycan database uitgebreid met typische mannose-6-fosfaat (M6P) glycanen, waaronder HexNAc (2) Hex (4-9) Fosfo (1-2), HexNAc (3-4) Hex (4-9) Fosfo (1-2), HexNAc (2) Hex (3-4) Phospho (1) en HexNAc (3) Hex (3-4) Phospho (1).
    2. Stel N-glycosylatie in als een veel voorkomende wijziging. Stel de maximale totale modificaties per peptide spectrale match (PSM) in als één veel voorkomende en twee zeldzame.
    3. Stel de volgende variabele modificaties in: oxidatie van Met (zeldzaam), deamidatie bij Asn en Gln (zeldzaam) en fosforylering bij Ser, Thr en Tyr (vaak). Stel de volgende identificatiefilters in: score cut-off > 150, |log prob| > 1 en delta mod score > 10.
    4. Exporteer en analyseer zoekresultaten op de tabbladen Eiwitten en Peptidegroep.
    5. Screen handmatig de identificaties die M6P-glycanen bevatten op de aanwezigheid van het fosfohex oxoniumion (243 m/z) in de MS/MS-spectra en verwijder vals-positieve identificaties, die dit diagnostische ion niet bevatten.
  3. Zoek in de onbewerkte gegevensbestanden met behulp van een open-source software (zie Tabel van materialen) naar fosfopeptiden die moeten worden geanalyseerd21. Gebruik een 20 ppm first search peptide tolerantie en een 4,5 ppm main search peptide tolerantie.
    1. Stel het maximum aantal modificaties per peptide in op 5. Stel PSM en protein false discovery rate (FDR) in op 1% en minimale peptidelengte op 7 residuen.
    2. Stel variabele modificaties in als oxidatie bij Met, N-terminale eiwitacetylering en fosforylering bij Ser, Thr en Tyr. Analyseer zoekresultaten met behulp van de modificationSpecificPeptides-bestanden.
  4. Bepaal het aantal identificaties van PTM's op het niveau van eiwitten, peptiden en modificaties.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Representatieve massaspectrometriegegevens, waaronder onbewerkte bestanden en zoekresultaten, zijn gedeponeerd bij het ProteomeXchange Consortium via de PRIDE-partnerrepository met de dataset-id PXD03306522.

In dit werk werden dubbele injectiereplicaties geanalyseerd voor elke verrijkingselelution. Identificaties gemaakt van beide technische replica's werden verzameld in de uiteindelijke analyse. Vanwege de semi-stochastische aard van gegevensafhankelijke acqui...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De dual-functionele Ti(IV)-IMAC strategie is nuttig voor de gelijktijdige analyse van N-glycopeptiden en fosfopeptiden uit hetzelfde monster in een enkele monstervoorbereidingsworkflow. Erlic-gebaseerde methoden hebben ook aangetoond dat ze gelijktijdige verrijking van PTM's uitvoeren. Beide strategieën zijn eerder gebruikt voor diepe dekking in PTM-analyses 14,18. Door de dual Ti-methode aan te passen aan het verminderen van de incubatietijd van monsters door ge...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit onderzoek werd gedeeltelijk ondersteund door subsidiefinanciering van de NIH (R01DK071801, RF1AG052324, P01CA250972 en R21AG065728) en Juvenile Diabetes Research Foundation (1-PNF-2016-250-S-B en SRA-2016-168-S-B). De hier gepresenteerde gegevens werden ook gedeeltelijk verkregen door steun van een NIH / NCATS UL1TR002373-prijs via het University of Wisconsin Institute for Clinical and Translational Research. De Orbitrap-instrumenten werden gekocht met de steun van een NIH shared instrument grant (NIH-NCRR S10RR029531) en office of the Vice Chancellor for Research and Graduate Education aan de University of Wisconsin-Madison. We willen ook de genereuze steun erkennen van de Orgaan- en Weefseldonatieorganisatie van de Universiteit van Wisconsin die de menselijke alvleesklier voor onderzoek heeft geleverd en de hulp van Dan Tremmel, Dr. Sara D. Sackett en Prof. Jon Odorico voor het verstrekken van de monsters aan ons laboratorium. Ons onderzoeksteam wil in het bijzonder de families bedanken die weefsels hebben gedoneerd voor deze studie. L.L. erkent NIH-subsidie S10OD025084, een Pancreas Cancer Pilot-beurs van het Carbone Cancer Center van de Universiteit van Wisconsin (233-AAI9632), evenals een Vilas Distinguished Achievement Professorship en het Charles Melbourne Johnson Distinguished Chair Professorship met financiering door de Wisconsin Alumni Research Foundation en de University of Wisconsin-Madison School of Pharmacy.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Azijnzuur, Glaciaal (Gecertificeerd ACS)Fisher ScientificA38S-500
Aceton (Gecertificeerd ACS)Fisher ScientificA18-1
Acetonitril, Optima LC/MS GradeFisher ScientificA955-4
Ammoniumacetaat (Kristallijn/Gecertificeerd ACS)Fisher ScientificA637-500
Ammoniumhydroxide (Gecertificeerd ACS Plus)Fisher ScientificA669-212
Byonic softwareProtein Metricsn/aCommerciële software gebruikt voor glycoproteomische analyse (https://proteinmetrics.com/byos/)
C18 BEH materiaalWaters186002353Materiaal verwijderd uit kolom en gebruikt om nano capillaire te vullen (tip rechtstreeks in lijn met instrument inlaat gebruikt)
CAE-Ti-IMAC, 100%J&K Scientific2749380-1GMateriaal gebruikt voor dubbel functioneel Ti(IV)-IMAC; kan ook worden gebruikt voor conventionele IMAC/conventionele fosfopeptide verrijking
Cellcrusher kitCellcrushern/aGebruikt voor het vermalen van weefsel monsters tot poeder voor extractie
Eppendorf 5424R MicrocentrifugeFisher Scientific05-401-205Voor temperatuur gecontroleerde centrifugatie
cOmplete protease remmercocktail tablettenSigma11697498001
DTT, Moleculair Grad (DL-Dithiothreitol)PromegaV3151Eiwit reducerend middel
Ethanol, 200 proof (100%), USPFisher22-032-601
Fisherbrand Analog Vortex MixerFisher Scientific02-215-414
Fisherbrand Low-Retention Microcentrifuge Tubes (1,5 mL)Fisher Scientific02-681-320
Fisherbrand Low-Retention Microcentrifuge Tubes (2 mL)Fisher Scientific02-681-321
Fisherbrand Model 120 Sonic DismembratorFisher ScientificFB120110Voor monster lysis met behulp van ultrasonificatie
Mierenzuur, 99,0+%, Optima LC/MS GradeFisher ScientificA117-50
Gefuzeerde silica capillaire (75 µm binnendiameter, 360 µm buitendiameter)Polymicro Technologies LLC100 m TSP075375Voor in-house getrokken en gevulde kolommen met geïntegreerde emitter
Fluorwaterstofzuur (48 wt. % in H2O)Sigma-Aldrich339261-100MLGebruikt voor het openen van emitter van getrokken capillaire kolom
Iodoacetamid, BioUltraSigmaI1149-5GEiwit reducerend reagens
MaxQuant softwaren/an/aGratis software gebruikt voor fosfoproteomische analyse (https://www.maxquant.org/)
Multi-therm Shaker met verwarming en koelingBenchmark ScientificH5000-HCVerwarmingsblok
Oasis HLB 1 cc Vac Cartridge, 10 mg Sorbent per Cartridge, 30 µm, 100/pkWaters186000383Grotere schaal cartridge ontzouten voor tryptische digests (laadcapaciteit ongeveer tot 1 mg elk)
OMIX C18 pipette tips, 100 µL tip, 10 - 100 μL elutie volume, 1 x 96 tipsAgilentA57003100Kleinere schaal gevulde pipette tip voor ontzouten voor verrijking eluties
P-2000 Micropipette PullerSutter Instrument Co.P-2000/FVoor het trekken van nano-capillaire kolommen voor LC-MS
PhosSTOP fosfataseremmertablettenSigma4906845001
Pierce BCA Eiwit Assay KitThermo Fisher Scientific23225
Pierce Kwantitatieve Colorimetrische Peptide AssayThermo Fisher Scientific23275
PolySAX LP (12 µm, poriegrootte 300 Å)PolyLCBMSX1203Materiaal voor sterke anionen uitwisselingschromatografie gebruikt voor ERLIC/conventionele glycopeptide verrijking
Kaliumfosfaat Monobasisch (Kristallijn/Gecertificeerd ACS)Fisher ScientificP285-500
Drukinjectiecel met geïntegreerde magnetische roerplaatNext AdvancePC77-MAGVoor het vullen van nano-capillaire kolommen met stationaire fase tot 2500 psi limiet
Proteome Discoverer softwareThermo Fisher Scientificn/aCommerciële software voor proteomics anaysis (met geïntegreerde database zoeksoftware nodes) en data visualisatie (https://www.thermofisher.com/us/en/home/industrial/mass-spectrometry/liquid-chromatography-mass-spectrometry-lc-ms/lc-ms-software/multi-omics-data-analysis/proteome-discoverer-software.html)
SpeedVac SC110 Vacuum Concentrator Model SC110-120Savantn/aCentrifugale vacuüm concentrator voor het drogen van monsters (onder warmte)
SDS Oplossing, 10% Natriumdodecylsulfaat Oplossing, Moleculaire Biologie/ElectroforeseFisher ScientificBP2436200
Sequencing Grade Gemodificeerd TrypsinePromegaV5111
Natriumchloride (Kristallijn/Gecertificeerd ACS)Fisher ScientificS271-500
TopTip, Leeg, 10-200 µL, Pak van 96Glygen CorporationTT2EMT.96Lege pipette tip met micron-grootte gat dat kan worden gebruikt om chromatografische materialen voor verrijkingen te vullen, gebundeld met buisadapters
Triethylammoniumbicarbonaat buffer (TEAB, 1 M, pH 8,5 (vluchtig))Sigma90360-100ML
Trifluorazijnzuur, Reagens Grad, 99%Fisher Scientific60-017-61
Tris Base (Witte Kristallen of Kristallijn Poeder/Moleculaire Biologie)Fisher ScientificBP152-500
Trypsine/Lys-C Mix, Mass Spec GradPromegaV5071
Urea (Gecertificeerd ACS)

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Smith, L. M., Kelleher, N. L. Proteoform: a single term describing protein complexity. Nature Methods. 10 (3), 186-187 (2013).
  2. Pan, S., Brentnall, T. A., Chen, R. Glycoproteins and glycoproteomics in pancreatic cancer. World Journal of Gastroenterology. 22 (42), 9288-9299 (2016).
  3. Tabang, D. N., Ford, M., Li, L. Recent advances in mass spectrometry-based glycomic and glycoproteomic studies of pancreatic diseases. Frontiers in Chemistry. 9, 707387(2021).
  4. Khoury, G. A., Baliban, R. C., Floudas, C. A. Proteome-wide post-translational modification statistics: frequency analysis and curation of the swiss-prot database. Scientific Reports. 1, 90(2011).
  5. Alpert, A. J. Hydrophilic-interaction chromatography for the separation of peptides, nucleic acids and other polar compounds. Journal of Chromatography A. 499, 177-196 (1990).
  6. Riley, N. M., Bertozzi, C. R., Pitteri, S. J. A pragmatic guide to enrichment strategies for mass spectrometry-based glycoproteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100029(2020).
  7. Low, T. Y., et al. Widening the bottleneck of phosphoproteomics: Evolving strategies for phosphopeptide enrichment. Mass Spectrometry Reviews. 40 (4), 309-333 (2021).
  8. Cho, K. C., Chen, L., Hu, Y., Schnaubelt, M., Zhang, H. Developing workflow for simultaneous analyses of phosphopeptides and glycopeptides. ACS Chemical Biology. 14 (1), 58-66 (2019).
  9. Zhou, Y., et al. An integrated workflow for global, glyco-, and phospho-proteomic analysis of tumor tissues. Analytical Chemistry. 92 (2), 1842-1849 (2020).
  10. Tang, R., et al. Facile preparation of bifunctional adsorbents for efficiently enriching N-glycopeptides and phosphopeptides. Analytica Chimica Acta. 1144, 111-120 (2021).
  11. Wang, Z., Wang, J., Sun, N., Deng, C. A promising nanoprobe based on hydrophilic interaction liquid chromatography and immobilized metal affinity chromatography for capture of glycopeptides and phosphopeptides. Analytica Chimica Acta. 1067, 1-10 (2019).
  12. Glover, M. S., et al. Characterization of intact sialylated glycopeptides and phosphorylated glycopeptides from IMAC enriched samples by EThcD fragmentation: Toward combining phosphoproteomics and glycoproteomics. International Journal of Mass Spectrometry. 427, 35-42 (2018).
  13. Alpert, A. J. Electrostatic repulsion hydrophilic interaction chromatography for isocratic separation of charged solutes and selective isolation of phosphopeptides. Analytical Chemistry. 80 (1), 62-76 (2008).
  14. Cui, Y., et al. Counterion optimization dramatically improves selectivity for phosphopeptides and glycopeptides in electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography. Analytical Chemistry. 93 (22), 7908-7916 (2021).
  15. Cui, Y., et al. Finding the sweet spot in ERLIC mobile phase for simultaneous enrichment of N-Glyco and phosphopeptides. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 30 (12), 2491-2501 (2019).
  16. Tabang, D. N., et al. Analysis of pancreatic extracellular matrix protein post-translational modifications via electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography coupled with mass spectrometry. Molecular Omics. 17 (5), 652-664 (2021).
  17. Huang, J., et al. Dual-functional Titanium(IV) immobilized metal affinity chromatography approach for enabling large-scale profiling of protein Mannose-6-Phosphate glycosylation and revealing its predominant substrates. Analytical Chemistry. 91 (18), 11589-11597 (2019).
  18. Huang, J., et al. Dual-functional Ti(IV)-IMAC material enables simultaneous enrichment and separation of diverse glycopeptides and phosphopeptides. Analytical Chemistry. 93 (24), 8568-8576 (2021).
  19. Jami-Alahmadi, Y., Pandey, V., Mayank, A. K., Wohlschlegel, J. A. A robust method for packing high resolution C18 RP-nano-HPLC columns. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62380(2021).
  20. Bern, M., Kil, Y. J., Becker, C. Byonic: advanced peptide and protein identification software. Current Protocols in Bioinformatics. , Chapter 13, Unit13.20 (2012).
  21. Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
  22. Perez-Riverol, Y., et al. The PRIDE database and related tools and resources in 2019: improving support for quantification data. Nucleic Acids Research. 47, 442-450 (2019).
  23. Zhou, Y., et al. Metascape provides a biologist-oriented resource for the analysis of systems-level datasets. Nature Communications. 10 (1), 1523(2019).
  24. Zacharias, L. G., et al. HILIC and ERLIC enrichment of glycopeptides derived from breast and brain cancer cells. Journal of Proteome Research. 15 (10), 3624-3634 (2016).
  25. Yang, W., et al. Comparison of enrichment methods for intact N- and O-linked glycopeptides using strong anion exchange and hydrophilic interaction liquid chromatography. Analytical Chemistry. 89 (21), 11193-11197 (2017).
  26. Toghi Eshghi, S., Shah, P., Yang, W., Li, X., Zhang, H. GPQuest: A spectral library matching algorithm for site-specific assignment of tandem mass spectra to intact N-glycopeptides. Analytical Chemistry. 87 (10), 5181-5188 (2015).
  27. Liu, M. -Q., et al. pGlyco 2.0 enables precision N-glycoproteomics with comprehensive quality control and one-step mass spectrometry for intact glycopeptide identification. Nature Communications. 8 (1), 438(2017).
  28. Lu, L., Riley, N. M., Shortreed, M. R., Bertozzi, C. R., Smith, L. M. O-Pair Search with MetaMorpheus for O-glycopeptide characterization. Nature Methods. 17 (11), 1133-1138 (2020).
  29. Caval, T., Heck, A. J. R., Reiding, K. R. Meta-heterogeneity: Evaluating and describing the diversity in glycosylation between sites on the same glycoprotein. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100010(2021).
  30. Lee, J. S., Smith, E., Shilatifard, A. The language of histone crosstalk. Cell. 142 (5), 682-685 (2010).
  31. Leutert, M., Entwisle, S. W., Villén, J. Decoding post-translational modification crosstalk with proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100129(2021).
  32. Hart, G. W., Slawson, C., Ramirez-Correa, G., Lagerlof, O. Cross talk between O-GlcNAcylation and phosphorylation: Roles in signaling, transcription, and chronic disease. Annual Review of Biochemistry. 80 (1), 825-858 (2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

N glycopeptide verrijkingfosfopeptide verrijkingspin tip methodetitanium IMACmassaspectrometriepancreasweefselpost translationele modificatiesglycosyleringfosforyleringprote neverteringbiomarker ontdekking

Gerelateerde artikelen