Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Effect van hyaluronzuur 35 kDa op een in vitro model van te vroeg geboren darmletsel en genezing met behulp van enteroïde-afgeleide monolagen

1.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/63758

⸱

28 juli 2022

 ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Division of Neonatal-Perinatal Medicine, University of Oklahoma Health Sciences Center

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een methode om een kraswondtest vast te stellen en uit te voeren op tweedimensionale (2D) monolagen afgeleid van driedimensionale (3D) enteroïden geïsoleerd uit niet-menselijke primatenileum.

Samenvatting

In vitro kraswondtesten worden vaak gebruikt om de mechanismen en kenmerken van epitheliale genezing in verschillende weefseltypen te onderzoeken. Hier beschrijven we een protocol om een tweedimensionale (2D) monolaag te genereren uit driedimensionale (3D) niet-menselijke primaat enteroïden afgeleid van darmcrypten van het terminale ileum. Deze van enteroïden afgeleide monolagen werden vervolgens gebruikt in een in vitro kraswondtest om het vermogen van hyaluronaat 35 kDa (HA35), een ha-mimiek voor moedermelk, te testen om celmigratie en proliferatie langs de epitheliale wondrand te bevorderen. Nadat de monolagen tot confluentie waren gegroeid, werden ze handmatig bekrast en behandeld met HA35 (50 μg / ml, 100 μg / ml, 200 μg / ml) of controle (PBS). Celmigratie en proliferatie in de kloof werden in beeld gebracht met behulp van een doorgelaten lichtmicroscoop die is uitgerust voor live-cell imaging. Wondsluiting werd gekwantificeerd als percentage wondgenezing met behulp van de Wound Healing Size Plugin in ImageJ. Het krasgebied en de snelheid van celmigratie en het percentage wondsluiting werden gemeten gedurende 24 uur. HA35 in vitro versnelt wondgenezing in enteroïde monolagen in de dunne darm, waarschijnlijk door een combinatie van celproliferatie aan de wondrand en migratie naar het wondgebied. Deze methoden kunnen mogelijk worden gebruikt als een model om darmregeneratie in de premature menselijke dunne darm te onderzoeken.

Inleiding

Necrotiserende enterocolitis (NEC) is een van de meest voorkomende gastro-intestinale noodsituaties bij te vroeg geboren baby's1. De ziekte wordt gekenmerkt door ernstige darmontsteking die snel kan verslechteren tot darmnecrose, sepsis en mogelijk de dood. Hoewel de etiologie onduidelijk is, suggereert bewijs dat NEC multifactorieel is en het resultaat van een complexe interactie van voeding, abnormale bacteriële kolonisatie en een onrijp darmepitheel 2,3. Premature baby's hebben een verhoogde darmdoorlaatbaarheid, abnormale bacteriële kolonisatie en een laag regeneratief vermogen van enterocyten 4,5, waardoor hun risico op intestinale barrièredisfunctie, bacteriële translocatie en NEC-ontwikkeling toeneemt. Daarom is het identificeren van strategieën of interventies om de intestinale epitheliale rijping te versnellen en regeneratie of genezing van het darmepitheel te bevorderen van cruciaal belang bij het voorkomen van deze dodelijke ziekte.

Studies hebben aangetoond dat moedermelk (HM) beschermend is tegen NEC bij te vroeg geboren baby's 6,7,8,9,10,11. Zowel menselijke als dierlijke studies hebben aangetoond dat op runderen gebaseerde formule de darmdoorlaatbaarheid verhoogt en direct toxisch is voor intestinale epitheelcellen 2,12. Hoewel niet volledig opgehelderd, suggereert bewijs dat de beschermende effecten van HM worden gemedieerd door bioactieve componenten zoals lactoferrine, immunoglobuline A (IgA) en HM oligosacchariden13. HM is ook rijk aan hyaluronaat (HA), een uniek niet-gesulfateerd glycosaminoglycaan met herhalend D-glucuronzuur en N-acetyl-D-glucosaminedisachariden14,15. Belangrijk is dat we hebben aangetoond dat orale 35 kDa HA (HA35), een HM HA-nabootsing, de ernst van darmletsel verzwakt, bacteriële translocatie voorkomt en de mortaliteit vermindert in een muizenNEC-achtig darmletselmodel16,17.

Hier worden de effecten van HA35 op darmgenezing en regeneratie in vitro verder onderzocht. Momenteel is de meest gebruikte in vitro assay voor darmbeschadiging en -reparatie een kraswondtest uitgevoerd in colorectale kanker (CRC) celmonolagen. De fysiologische relevantie van een dergelijk model voor de te vroeg geboren darm is beperkt, omdat wondherstel van CRC-cellen sterk afhankelijk is van de zeer proliferatieve aard van kankercellen in plaats van stamcelgestuurde reparatieprocessen18. Om deze beperking te overwinnen, wordt de oprichting van een 2D enteroïde kraswondmodel, inclusief de procedure voor het isoleren en onderhouden van primaire stamcel-afgeleide dunne darm enteroïden van premature niet-menselijke primaten (NHP), hier beschreven. Aangezien premature NEC meestal wordt gemeld in de distale dunne darm, biedt het gebruik van primaire epitheelcelorganoïden in een model van darmbeschadiging en -reparatie een meer fysiologisch vertaalbaar in vitro model in vergelijking met bestaande modellen die traditionele colorectale monolagen gebruiken18,19.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dierprocedures in deze studie werden goedgekeurd door het University of Oklahoma Health Sciences Center Institutional Animal Care and Use Committee. Na institutionele goedkeuring werden foetale dunne darm gemaksmonsters van een premature niet-menselijke primaat (NHP, 90% dracht, olijfbaviaan, Papio anubis) verkregen na euthanasie voor een afzonderlijke studie (Protocol # 101523-16-039-I) 20.

1. Vaststelling van premature niet-menselijke primaat 3D intestinale enteroïden

  1. Media voorbereiding
    OPMERKING: Media kunnen tot 1 week voor cryptisolatie worden voorbereid volgens de standaard aseptische techniek. Penicilline/streptomycine (eindconcentratie 1%) kan indien gewenst worden gebruikt in plaats van de breedspectrumantibiotica voor primaire cellen.
    1. Bereid humane organoïde groeimedia + Y-27632 (HOGMY) voor door 50 ml organoïde groeimedium menselijk basaal medium te mengen met 50 ml organoïde supplement (materiaaltabel). Voeg 200 μL van de breedspectrumantibiotica (eindconcentratie 100 μg/ml) (materiaaltabel) en Y-27632 (tot een eindconcentratie van 10 μM) toe. Warm op de benchtop tot kamertemperatuur.
    2. Bereid humane organoïde groeimedia (HOGM) voor door 50 ml organoïde groeimedium menselijk basaal medium te mengen met 50 ml organoïde supplement. Voeg 200 μL van de breedspectrumantibiotica (100 μg/ml) toe. Warm op de benchtop tot kamertemperatuur.
      OPMERKING: HOGM zal worden gebruikt bij het wisselen van media na de eerste 2-3 dagen na passage.
    3. Koel 100 ml 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) zonder calcium of magnesium tot het ijskoud is.
    4. Bereid 50 ml wasbuffer door 1x PBS zonder calcium of magnesium te combineren met 0,1% runderserumalbumine (BSA). Laat het afkoelen tot het ijskoud is.
    5. Bereid DMEM-F12 wasbuffer voor door 1 ml van de breedspectrumantibiotica (100 μg / ml) toe te voegen aan 500 ml DMEM / F12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium / Nutrient Ham's Mixture F12 + 15 mM HEPES-buffer). Houd het ijskoud.
  2. Crypt isolatie en beplating
    OPMERKING: Extracellulaire matrix (ECM) -gebaseerde hydrogel moet gedurende de hele procedure op het ijs blijven. Deze procedure gaat uit van voldoende weefsel om zes op ECM gebaseerde hydrogelkoepels te bevolken. Als een andere dichtheid van crypten wordt geoogst, moet het koepelnummer dienovereenkomstig worden gewijzigd.
    1. Ontdooi 150 μL groeifactor verminderd (GFR) keldermembraanextract (BME) (fenol roodvrij) 's nachts op het ijs bij 2-8 °C.
    2. Incubeer een 24-well, platte bodem, weefselkweekbehandelde polystyreenplaat in een incubator bij 37 °C en 5% CO2 gedurende minimaal 30 minuten voor gebruik.
    3. Na NHP-euthanasie en weefselverzameling spoelt u het ileumsegment van puin met een pipetpunt van 1.000 μL met behulp van ijskoude 1x PBS in een wegwerp petrischaaltje.
      OPMERKING: Vers weefsel moet snel worden geoogst en ijskoud worden gehouden om gezonde enteroïden te oogsten.
    4. Snijd het ileum in de lengterichting langs de hele darm en was 3x met ijskoude PBS. Gehakt het weefsel in kleine fragmenten (ongeveer 2 mm lang) met een steriele schaar over een conische buis van 50 ml met 15 ml ijskoude PBS, te beginnen met het deel van het ileale segment dat zich het dichtst bij de buis bevindt.
    5. Gebruik een serologische pipet van 10 ml om de crypten te verstoren door 5-10x op en neer te pipetteren. Laat de weefselsegmenten op de bodem van de buis zakken, verwijder vervolgens het supernatant en vervang het door verse, ijskoude PBS. Herhaal dit proces minimaal 7x-10x totdat het supernatant helder en vrij van vuil is.
    6. Eenmaal helder, verwijder het supernatant en resuspenseer de crypten in 25 ml celdissociatiereagens. Plaats de buis op een schommelplatform bij 20 rpm gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
    7. Verwijder de buis uit de rocker, laat de cellen ongeveer 30 s tot 1 min bezinken en verwijder het supernatant. Voeg 10 ml ijskoude wasbuffer toe. Pipetteer op en neer met een p1000 pipet om verder te dissociëren in enkele crypten.
    8. Filter het weefsel door een celzeef van 70 μm in een nieuwe conische buis van 50 ml. Spoel de originele conische buis van 50 ml met 10 ml ijskoude wasbuffer en filter door de zeef van 70 μm om ervoor te zorgen dat alle crypten uit de oorspronkelijke buis zijn verwijderd. Herhaal dit wassen van tissue voor een totaal van 4x spoelingen.
    9. Centrifugeer het filtraat bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en verwijder het supernatant. Voeg 600 μL HOGMY toe en verstoor de pellet door op en neer te pipetteren met een pipet van 200 μL. Plaats de buis op ijs totdat de oplossing ijskoud wordt.
      OPMERKING: Als de oplossing niet ijskoud is, zal de koepel niet de juiste structuur behouden wanneer deze wordt verguld. Vermijd het introduceren van bubbels bij het pipetteren van op ECM gebaseerde hydrogelkoepels, omdat bubbels een goede hechting aan de plaatbodem voorkomen.
    10. Voeg 600 μL ijskoude hydrogel op basis van ECM toe om de celpellet te suspenseren en meng goed met een pipet van 200 μL.
    11. Haal de 24-wells plaat uit de incubator en plaats deze op een 37 °C platenwarmer. Pipetteer 50 μL ijskoud HOGMY/ECM-gebaseerd hydrogelmengsel in het midden van 24 putten van een 24-well kweekplaat (50 μL per koepel).
    12. Laat de koepels na de vergulding 1 minuut op een platenwarmer van 37 °C zitten om hechting aan de onderkant van de plaat mogelijk te maken. Keer de plaat voorzichtig om, zorg ervoor dat er zich geen condensatie op de bodem van de plaat heeft opgehoopt en plaats de omgekeerde plaat in de incubator bij 37 °C en 5% CO2.
    13. Draai na 15 minuten de plaat rechts omhoog en pipetteer 750 μL HOGMY op kamertemperatuur in elke put.
      OPMERKING: Pipet media langzaam op de zijwand van putten, voorzichtig om de nieuw gevormde 3D ECM-gebaseerde hydrogelkoepel niet te verstoren.
    14. Zodra alle putjes zijn gevuld met media, plaatst u de plaat in de incubator en vervangt u de media om de 3 dagen met 750 μL HOGM. Passage enteroïden om de 7-10 dagen.
  3. Intestinale enteroïde passaging
    OPMERKING: Het volgende protocol is voor één 24-well kweekplaat met NHP-enteroïden met een splitsnelheid van 1:2.
    1. Verwijder de enteroïde media uit elke put, zorg ervoor dat de ECM-koepel met enteroïden niet wordt verstoord, voeg 500 μL ijskoude celdissociatiereagens toe aan elke put met behulp van een pipet van 1.000 μL en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 minuut.
    2. Verstoor de ECU handmatig door 8-12x op en neer te pipetteren. Breng de inhoud van 12 putten over op één conische buis van 15 ml.
    3. Zodra alle oplossing is verzameld uit de 24-well kweekplaat, voegt u 250 μL celverstoringsreagens toe aan elke put om ervoor te zorgen dat alle NHP-enteroïden uit elke put zijn verwijderd en voegt u deze laatste spoeling toe aan de bestaande conische buizen van 15 ml.
    4. Plaats op een schommelplatform bij 40 tpm gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (20 °C). U kunt de buizen ook handmatig schudden gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
    5. Na 15 minuten centrifugeren bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Verwijder het supernatant uit de buizen van 15 ml totdat alleen de pellet overblijft.
    6. Voeg 8 ml ijskoude DMEM + breedspectrumantibiotica toe aan één conische buis van 15 ml en zorg ervoor dat de pellet voldoende verstoord is. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en gooi het supernatant weg.
    7. Voeg 600 μL HOGMY toe en verstoor de pellet door op en neer te pipetteren met een pipet van 1.000 μL. Plaats de buis op ijs totdat de oplossing ijskoud wordt. Zodra de oplossing ijskoud is, voegt u 600 μL ijskoude ECU toe om de celpellet te suspenseren en mengt u goed met een pipet van 1.000 μL. Herhaal stap 1.3.2.-1.3.7. voor de overige 12 putten.
      1. Voor de overige stappen raadpleegt u stap 1.2.11.-1.2.16.

2. Vaststelling van enteroïde monolaag- en kraswondtest

  1. Media en behandelingsvoorbereiding
    1. Koel 5 ml PBS zonder calcium of magnesium tot het ijskoud is.
    2. Bereid DMEM-F12 wasbuffer voor door 1 ml van de breedspectrumantibiotica (100 μg / ml) toe te voegen aan 500 ml DMEM / F12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium / Nutrient Ham's Mixture F12 + 15 mM HEPES-buffer). Houd ijskoud.
    3. Bereid 100 ml HOGMY, zoals beschreven in stap 1.1.1., en verwarm het op de bank tot kamertemperatuur.
    4. Verwarm 25 ml 0,25% trypsine-ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) in een waterbad van 37 °C.
    5. Bereid 50 μg/ml, 100 μg/ml en 200 μg/ml ha35 voor celbehandeling, met steriel PBS zonder calcium of magnesium als oplosmiddel. De uiteindelijke verdunning van HA35 zal HOMGY als oplosmiddel gebruiken.
      OPMERKING: HA35-preparaat kan verschillende verdunningen vereisen, omdat HA35 vaak uit de oplossing komt in een concentratie van meer dan 5 mg / ml.
  2. Enteroïde monolaagvorming
    OPMERKING: De volgende procedure biedt volumes die voldoende zijn voor het genereren van één 24-well plaat van enteroïde monolagen. Pas de volumes aan voor het gewenste aantal monolagen.
    1. Ontdooi 96 μL op ECM gebaseerde hydrogel BME (fenol roodvrij) 's nachts op ijs bij 2-8 °C. Verdun ECM-gebaseerde hydrogel in ijskoude PBS zonder calcium of magnesium in een verhouding van 1:50. Bestrijk elk putje van een 24-well weefselkweekplaat met 200 μL ijskoude verdunde hydrogel op basis van ECM.
    2. Incubeer de op ECM gebaseerde hydrogel-gecoate plaat gedurende minimaal 1 uur bij 37 °C en 5% CO2. Aspirateer media uit de 24-well kweekplaat met de 3D-enteroïden bestemd voor monolagen en vervang door 500 μL celdissociatiereagens/put.
    3. Verbreek handmatig op ECM gebaseerde hydrogelkoepels door 8x-12x op en neer te pipetteren en breng de inhoud van 12 putten over naar een conische buis van 15 ml.
    4. Was de 12 lege putjes met 250 μL celdissociatiereagens om ervoor te zorgen dat alle enteroïden zijn verwijderd en breng de inhoud over naar een conische buis van 15 ml. Herhaal stap 2.2.5. en stap 2.2.6. voor de overige 12 putten met behulp van een tweede conische buis van 15 ml.
    5. Centrifugeer de conische buizen bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en gooi het supernatant weg. Voeg 10 ml ijskoude DMEM-F12 wasbuffer toe aan 15 ml conische buizen en suspensie de enteroïde pellets door de buizen om te keren. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
    6. Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellets in 12 ml trypsine-EDTA van 37 °C. Plaats de buisjes gedurende 10 minuten in een waterbad van 37 °C of totdat de cellen oplosbaar lijken. Voeg 3 ml DMEM-F12 wasbuffer toe aan elke buis om Trypsin-EDTA te verdunnen, meng door de buizen om te keren en plaats op ijs.
    7. Filter de gedissocieerde enteroïden door een 37 μM mesh celzeef en verzamel de inhoud in schone conische buizen van 15 ml. Centrifugeer de buizen bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
    8. Terwijl de cellen in de centrifuge pelleteren, verwijdert u de op ECM gebaseerde hydrogel-gecoate plaat uit de incubator en zuigt u overtollige hydrogeloplossing op basis van ECM op zonder het gecoate oppervlak te krassen of de plaat volledig te laten drogen.
    9. Verwijder het supernatant uit de conische buizen en resuspenseer de celpellets met 6 ml HOMGY. Voeg 500 μL van de gecombineerde 12 ml HOMGY-celsuspensie toe aan elke put van de 24-well plaat bedekt met ECM-gebaseerde hydrogel met een zaaidichtheid van ongeveer 3 x 105 cellen / put. Draai de plaat met een deksel erop om een gelijkmatige verdeling van de cellen in de putten te garanderen.
    10. Incubeer de plaat bij 37 °C en 5% CO2 en wissel elke 2 dagen HOMGY-media uit totdat de monolagen >90% samenvloeiing bereiken.
  3. Monolayer behandeling en kras wond assay
    1. Zodra de monolagen >90% confluency bereiken, aspirateer media om cellen te verwijderen die zich niet hechten. Behandel cellen met 500 μL HA35 (50 μg/ml, 100 μg/ml, 200 μg/ml) of PBS, opgelost in HOMGY, gedurende 24 uur.
    2. Verwijder na 24 uur de media en zorg ervoor dat u het oppervlak van de monolaag niet verstoort. Maak met behulp van een pipetpunt van 200 μL een lineaire kras over de volledige oppervlaktediameter van de monolaag in elke put, waarbij u moet oppassen dat u monolagen niet laat drogen.
    3. Was de bekraste monolagen 1x met 500 μL 1x PBS. Voeg 500 μL HA35 (50 μg/ml, 100 μg/ml, 200 μg/ml) of PBS opgelost in HOMGY toe en breng de plaat over naar het levendcelanalyse-instrument (materiaaltabel) in een CO2-incubator van 37 °C en 5%.
    4. Klik onder het pictogram Schema in de live-cell analysesoftware (Materiaaltabel) op het pictogram Launch Add New Vessel Wizard en stel de scanfrequentie in om volgens een schema te scannen. Maak een nieuw Whole Well-vat onder Scantype, geef de scaninstellingen op (d.w.z. Fase voor beeldkanalen en 4x voor Doelstelling) en klik op Volgende.
    5. Selecteer de fabrikant van de plaat en het catalogusnummer in de lijst. Kies onder het pictogram Schema het plussymbool waar de plaat in het live-cell analyse-instrument wordt geplaatst. Selecteer het gewenste scanpatroon en maak vervolgens een plaatkaart door "+" te selecteren op de pagina Plaatindeling. Selecteer Analyse uitstellen tot later en stel vervolgens het scanschema in voor elke 4 uur gedurende 24 uur en controleer de acquisitie-instellingen op de pagina Overzicht van de wizard Vaartuig . Selecteer ten slotte Toevoegen aan schema.
    6. Zodra de 24-test is voltooid, dubbelklikt u onder het pictogram Weergave op Vessel Name en exporteert u afbeeldingen en films. Selecteer putjes en een reeks afbeeldingen om weer te geven en te exporteren als JPEG. Analyseer afbeeldingen voor procent wondgenezing met behulp van de Wound Healing Size Plugin voor ImageJ21, volgens stap 2.4. onder.
  4. Kras wondanalyse
    1. Open ImageJ-software. Upload de scratch wound assay afbeeldingen (. TIFF of .JPG).
    2. Selecteer Afbeelding > Typ > 8-bits om de afbeelding te wijzigen van 24-bits RGB in 8-bits. Installeer de Wound Healing Size Plugin door Plugins > Macros te selecteren > Install > Wound Healing Size Plugin te installeren.
    3. Draai de afbeelding zodat de kras verticaal is en initialiseer de Wound Healing Size Tool-plug-in.
    4. Selecteer de plugin parameters in het dialoogvenster om het beste bij de kras wond te passen. Stel de waarde van de parameters voor opties voor wondgenezingsgrootte als volgt in: Variantievensterradius op 20, Drempelwaarde op 100 en Percentage verzadigde pixels op 0,001 en kies Ja voor Schaal globaal instellen. Voltooi de selectie door op de knop OK te klikken. Controleer of het geselecteerde gebied het wondgebied is. De bovenstaande parameters kunnen standaardisatie van laboratorium tot laboratorium vereisen.
    5. Herhaal stap 2.4.2.-2.4.4. voor de resterende tijdspunten voor elke kras.
    6. Bereken het percentage wondgenezing van het krasgebied van migrerende of prolifererende cellen gedurende 24 uur als volgt:
      % Wondgenezing = figure-protocol-1
      waarbij T0 = % oppervlakte op tijdstip 0 h en Tc = % oppervlakte 0 h, 4 h, 12 h of 24 h.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De effecten van HA op weefselherstel en wondgenezing in verschillende weefsels en organen zijn goed gedocumenteerd; de specifieke effecten van HA met een molecuulgewicht van 35 kDa op foetale of neonatale genezing en regeneratie van de dunne darm zijn momenteel echter onbekend. Om het vermogen van HA35 te testen om wondgenezing te bevorderen in een model van de foetale of neonatale dunne darm, genereerden we 3D-intestinale enteroïden uit NHP-ileaal weefsel en dissocieerden we dit weefsel verder in afzonderlijke cellen om...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het maagdarmkanaal van een te vroeg geboren baby staat onder voortdurende regeneratieve druk van herhaalde blootstelling aan milieu-beledigingen geassocieerd met dysbiose, inflammatoire bacteriële metabolieten en toxines, en intermitterende hypoxie23,24. Helaas is het darmepitheel van het te vroeg geboren kind niet in staat om snel functionele integriteit vast te stellen23, wat resulteert in barrièredisfunctie, verhoogde darmdoorlaatbaarhe...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen en geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

Deze inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de National Institutes of Health. HC wordt ondersteund door subsidie P20GM134973 van de National Institutes of Health. KB wordt ondersteund door een Children's Hospital Foundation (CHF) en Presbyterian Health Foundation (PHF) subsidie. Live-cell imaging-diensten die worden aangeboden door de Cancer Functional Genomics-kern werden gedeeltelijk ondersteund door het National Institute of General Medical Sciences Grant P20GM103639 en national cancer institute grant P30CA225520 van de National Institutes of Health, toegekend aan het University of Oklahoma Health Sciences Center Stephenson Cancer Center.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
10 mL Serologische PipetFisher Scientific13-675-49
100x21mm Dish, Nunclon DeltaThermoFisher Scientific172931
15 mL Conische buisVWR89039-666
24-Well, TC-behandeld, Platte BodemplaatCorning3524
37 µM Omkeerbare Cell StrainerSTEMCELL Technologies27215
50 mL Conische buisVWR89039-658
70 µm Sterile Cell StrainersFisher ScientificFB22-363-548
Albumine, Rund (BSA)VWR0332-100G
CellTiter-Glo 3D Cell Viability AssayPromegaG9681
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Ham's Mixture F-12 (DMEM-F12) met 15 mM HEPES bufferSTEMCELL Technologies36254
Gentle Cell Dissociation ReagentSTEMCELL Technologies100-0485
ImageJNIHimagej.nih.gov/ij/
Incucyte S3 Live-Cell Analysis InstrumentSartorius4647
Incucyte Scratch Wound Analysis Software ModuleSartorius9600-0012
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)STEMCELL Technologies06010Dit is HOGMY, maar zonder de Y-27632 of antibiotica. Ook gebruikt als basis voor HOGM, maar dan alleen zonder de antibiotica.
Lipopolysaccharides van Escherichia coli O111:B4, gezuiverd door gel-filtratie chromatografieMillipore SigmaL3012-10MG
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Fenol Rood-VrijCorning356231
Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-behandeld, Platte BodemplaatThermoFisher Scientific136101
PBS (Phosphate-Buffered Saline), 1X [-] Calcium, Magnesium, pH 7.4Corning21-040-CM
PrimocinInvivogenant-pm-1Dit zijn breed-spectrum antibiotica
Natrium Hyaluronaat, Onderzoekskwaliteit, HA20KLifecore BiomedicalHA20K-1
TC20 Automated Cell CounterBedrijf: Bio-Rad1450102
Trypsin-EDTA 1X, 0,25% TrypsinFisher ScientificMT25053CI
Y-27632STEMCELL Technologies72302

Referenties

  1. Lemons, J. A., et al. Very low birth weight outcomes of the National Institute of Child Health and Human Development Neonatal Research Network, January 1995 through December 1996. Pediatrics. 107 (1), 1(2001).
  2. Burge, K., Vieira, F., Eckert, J., Chaaban, H. Lipid composition, digestion, and absorption differences among neonatal feeding strategies: Potential implications for intestinal inflammation in preterm infants. Nutrients. 13 (2), 550(2021).
  3. Duffy, L. C. Interactions mediating bacterial translocation in the immature intestine. The Journal of Nutrition. 130, 2S Suppl 432-436 (2000).
  4. Nanthakumar, N., et al. The mechanism of excessive intestinal inflammation in necrotizing enterocolitis: An immature innate immune response. PLoS One. 6 (3), 17776(2011).
  5. Nanthakumar, N. N., Fusunyan, R. D., Sanderson, I., Walker, W. A. Inflammation in the developing human intestine: A possible pathophysiologic contribution to necrotizing enterocolitis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (11), 6043-6048 (2000).
  6. He, Y., Lawlor, N. T., Newburg, D. S. Human milk components modulate toll-like receptor-mediated inflammation. Advances in Nutrition. 7 (1), 102-111 (2016).
  7. Walker, W. A., Iyengar, R. S. Breast milk, microbiota, and intestinal immune homeostasis. Pediatric Research. 77 (1-2), 220-228 (2015).
  8. Westerbeek, E. A., vanden Berg, A., Lafeber, H. N., Fetter, W. P., van Elburg, R. M. The effect of enteral supplementation of a prebiotic mixture of non-human milk galacto-, fructo- and acidic oligosaccharides on intestinal permeability in preterm infants. British Journal of Nutrition. 105 (2), 268-274 (2011).
  9. vanden Berg, A., et al. The effect of glutamine-enriched enteral nutrition on intestinal permeability in very-low-birth-weight infants: A randomized controlled trial. Journal of Parenteral and Enteral Nutrition. 30 (5), 408-414 (2006).
  10. Foster, J. P., Seth, R., Cole, M. J. Oral immunoglobulin for preventing necrotizing enterocolitis in preterm and low birth weight neonates. The Cochrane Database of Systematic Reviews. 4 (4), (2016).
  11. Maffei, D., Schanler, R. J. Human milk is the feeding strategy to prevent necrotizing enterocolitis. Seminars in Perinatology. 41 (1), 36-40 (2017).
  12. Patel, A. L., Kim, J. H. Human milk and necrotizing enterocolitis. Seminars in Pediatric Surgery. 27 (1), 34-38 (2018).
  13. Nolan, L. S., Parks, O. B., Good, M. A review of the immunomodulating components of maternal breast milk and protection against necrotizing enterocolitis. Nutrients. 12 (1), 14(2019).
  14. Hill, D. R., et al. Human milk hyaluronan enhances innate defense of the intestinal epithelium. Journal of Biological Chemistry. 288 (40), 29090-29104 (2013).
  15. Burge, K., Bergner, E., Gunasekaran, A., Eckert, J., Chaaban, H. The role of glycosaminoglycans in protection from neonatal necrotizing enterocolitis: A narrative review. Nutrients. 12 (2), 546(2020).
  16. Chaaban, H., et al. Acceleration of small intestine development and remodeling of the microbiome following hyaluronan 35 kDa treatment in neonatal mice. Nutrients. 13 (6), 2030(2021).
  17. Gunasekaran, A., et al. Hyaluronan 35 kDa enhances epithelial barrier function and protects against the development of murine necrotizing enterocolitis. Pediatric Research. 87 (7), 1177-1184 (2020).
  18. Montenegro-Miranda, P. S., et al. A novel organoid model of damage and repair identifies HNF4α as a critical regulator of intestinal epithelial regeneration. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 10 (2), 209-223 (2020).
  19. Lee, C., Hong, S. N., Kim, E. R., Chang, D. K., Kim, Y. H. Epithelial regeneration ability of Crohn's disease assessed using patient-derived intestinal organoids. International Journal of Molecular Sciences. 22 (11), 6013(2021).
  20. Gurung, S., et al. Maternal Zika virus (ZIKV) infection following vaginal inoculation with ZIKV-infected semen in timed-pregnant olive baboons. Journal of Virology. 94 (11), 00058(2020).
  21. Suarez-Arnedo, A., et al. An image J plugin for the high throughput image analysis of in vitro scratch wound healing assays. PLoS One. 15 (7), 0232565(2020).
  22. Kobelt, D., Walther, W., Stein, U. S. Real-time cell migration monitoring to analyze drug synergism in the scratch assay using the IncuCyte system. Methods in Molecular Biology. 2294, 133-142 (2021).
  23. de Jong, J. C. W., Ijssennagger, N., van Mil, S. W. C. Breast milk nutrients driving intestinal epithelial layer maturation via Wnt and Notch signaling: Implications for necrotizing enterocolitis. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1867 (11), 166229(2021).
  24. Yu, Y., et al. Erythropoietin protects epithelial cells from excessive autophagy and apoptosis in experimental neonatal necrotizing enterocolitis. PLoS One. 8 (7), 69620(2013).
  25. Kessler, S. P., et al. Multifunctional role of 35 kilodalton hyaluronan in promoting defense of the intestinal epithelium. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 66 (4), 273-287 (2018).
  26. Fraser, J. R. E., Laurent, T. C., Laurent, U. B. G. Hyaluronan: Its nature, distribution, functions and turnover. Journal of Internal Medicine. 242 (1), 27-33 (1997).
  27. Kim, Y., et al. Hyaluronan 35kDa treatment protects mice from Citrobacter rodentium infection and induces epithelial tight junction protein ZO-1 in vivo. Matrix Biology. 62, 28-39 (2017).
  28. Prehm, P., Schumacher, U. Inhibition of hyaluronan export from human fibroblasts by inhibitors of multidrug resistance transporters. Biochemical Pharmacology. 68 (7), 1401-1410 (2004).
  29. Stenson, W. F., Ciorba, M. A. Nonmicrobial activation of TLRs controls intestinal growth, wound repair, and radioprotection. Frontiers in Immunology. 11 (3591), 617510(2021).
  30. Riehl, T. E., Ee, X., Stenson, W. F. Hyaluronic acid regulates normal intestinal and colonic growth in mice. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 303 (3), 377-388 (2012).
  31. Riehl, T. E., Santhanam, S., Foster, L., Ciorba, M., Stenson, W. F. CD44 and TLR4 mediate hyaluronic acid regulation of Lgr5+ stem cell proliferation, crypt fission, and intestinal growth in postnatal and adult mice. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 309 (11), 874-887 (2015).
  32. Hill, D. R., Kessler, S. P., Rho, H. K., Cowman, M. K., de la Motte, C. A. Specific-sized hyaluronan fragments promote expression of human beta-defensin 2 in intestinal epithelium. Journal of Biological Chemistry. 287 (36), 30610-30624 (2012).
  33. Fernando, E. H., Gordon, M. H., Beck, P. L., MacNaughton, W. K. Inhibition of intestinal epithelial wound healing through protease-activated receptor-2 activation in Caco2 cells. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 367 (2), 382-392 (2018).
  34. Nyegaard, S., Christensen, B., Rasmussen, J. T. An optimized method for accurate quantification of cell migration using human small intestine cells. Metabolic Engineering Communications. 3, 76-83 (2016).
  35. Roodsant, T., et al. A human 2D primary organoid-derived epithelial monolayer model to study host-pathogen interaction in the small intestine. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 272(2020).
  36. Singh, A., Poling, H. M., Spence, J. R., Wells, J. M., Helmrath, M. A. Gastrointestinal organoids: a next-generation tool for modeling human development. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 319 (3), 375-381 (2020).
  37. Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract. Experimental Biology and Medicine. 239 (9), 1124-1134 (2014).
  38. Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as a model of upper small intestinal ion transport physiology and pathophysiology. Gastroenterology. 150 (3), 638-649 (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Entero de monolagenscratch wound assayintestinale regeneratiecelmigratiecelproliferatievroeggeboorte darmwondgenezingImageJ analyseextracellulaire matrix
Effect van hyaluronzuur 35 kDa op een in vitro model van te vroeg geboren darmletsel en genezing met behulp van enteroïde-afgeleide monolagen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.