Dit protocol beschrijft een methode om een kraswondtest vast te stellen en uit te voeren op tweedimensionale (2D) monolagen afgeleid van driedimensionale (3D) enteroïden geïsoleerd uit niet-menselijke primatenileum.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Effect van hyaluronzuur 35 kDa op een in vitro model van te vroeg geboren darmletsel en genezing met behulp van enteroïde-afgeleide monolagen
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
In vitro kraswondtesten worden vaak gebruikt om de mechanismen en kenmerken van epitheliale genezing in verschillende weefseltypen te onderzoeken. Hier beschrijven we een protocol om een tweedimensionale (2D) monolaag te genereren uit driedimensionale (3D) niet-menselijke primaat enteroïden afgeleid van darmcrypten van het terminale ileum. Deze van enteroïden afgeleide monolagen werden vervolgens gebruikt in een in vitro kraswondtest om het vermogen van hyaluronaat 35 kDa (HA35), een ha-mimiek voor moedermelk, te testen om celmigratie en proliferatie langs de epitheliale wondrand te bevorderen. Nadat de monolagen tot confluentie waren gegroeid, werden ze handmatig bekrast en behandeld met HA35 (50 μg / ml, 100 μg / ml, 200 μg / ml) of controle (PBS). Celmigratie en proliferatie in de kloof werden in beeld gebracht met behulp van een doorgelaten lichtmicroscoop die is uitgerust voor live-cell imaging. Wondsluiting werd gekwantificeerd als percentage wondgenezing met behulp van de Wound Healing Size Plugin in ImageJ. Het krasgebied en de snelheid van celmigratie en het percentage wondsluiting werden gemeten gedurende 24 uur. HA35 in vitro versnelt wondgenezing in enteroïde monolagen in de dunne darm, waarschijnlijk door een combinatie van celproliferatie aan de wondrand en migratie naar het wondgebied. Deze methoden kunnen mogelijk worden gebruikt als een model om darmregeneratie in de premature menselijke dunne darm te onderzoeken.
Inleiding
Necrotiserende enterocolitis (NEC) is een van de meest voorkomende gastro-intestinale noodsituaties bij te vroeg geboren baby's1. De ziekte wordt gekenmerkt door ernstige darmontsteking die snel kan verslechteren tot darmnecrose, sepsis en mogelijk de dood. Hoewel de etiologie onduidelijk is, suggereert bewijs dat NEC multifactorieel is en het resultaat van een complexe interactie van voeding, abnormale bacteriële kolonisatie en een onrijp darmepitheel 2,3. Premature baby's hebben een verhoogde darmdoorlaatbaarheid, abnormale bacteriële kolonisatie en een laag regeneratief vermogen
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dierprocedures in deze studie werden goedgekeurd door het University of Oklahoma Health Sciences Center Institutional Animal Care and Use Committee. Na institutionele goedkeuring werden foetale dunne darm gemaksmonsters van een premature niet-menselijke primaat (NHP, 90% dracht, olijfbaviaan, Papio anubis) verkregen na euthanasie voor een afzonderlijke studie (Protocol # 101523-16-039-I) 20.
1. Vaststelling van premature niet-menselijke primaat 3D intestinale enteroïden
- Media voorbereiding
OPMERKING: Media kunnen tot 1 week voor cryptisolatie worden voorbereid volgens de st....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De effecten van HA op weefselherstel en wondgenezing in verschillende weefsels en organen zijn goed gedocumenteerd; de specifieke effecten van HA met een molecuulgewicht van 35 kDa op foetale of neonatale genezing en regeneratie van de dunne darm zijn momenteel echter onbekend. Om het vermogen van HA35 te testen om wondgenezing te bevorderen in een model van de foetale of neonatale dunne darm, genereerden we 3D-intestinale enteroïden uit NHP-ileaal weefsel en dissocieerden we dit weefsel verder in afzonderlijke cellen om.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het maagdarmkanaal van een te vroeg geboren baby staat onder voortdurende regeneratieve druk van herhaalde blootstelling aan milieu-beledigingen geassocieerd met dysbiose, inflammatoire bacteriële metabolieten en toxines, en intermitterende hypoxie23,24. Helaas is het darmepitheel van het te vroeg geboren kind niet in staat om snel functionele integriteit vast te stellen23, wat resulteert in barrièredisfunctie, verhoogde darmdoorlaatbaarhe.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen en geen belangenconflicten.
Dankbetuigingen
Deze inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de National Institutes of Health. HC wordt ondersteund door subsidie P20GM134973 van de National Institutes of Health. KB wordt ondersteund door een Children's Hospital Foundation (CHF) en Presbyterian Health Foundation (PHF) subsidie. Live-cell imaging-diensten die worden aangeboden door de Cancer Functional Genomics-kern werden gedeeltelijk ondersteund door het National Institute of General Medical Sciences Grant P20GM103639 en national cancer institute grant P30CA225520 van de National Institutes of Health, toegekend aan het Uni....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 10 mL Serologische Pipet | Fisher Scientific | 13-675-49 | |
| 100x21mm Dish, Nunclon Delta | ThermoFisher Scientific | 172931 | |
| 15 mL Conische buis | VWR | 89039-666 | |
| 24-Well, TC-behandeld, Platte Bodemplaat | Corning | 3524 | |
| 37 µM Omkeerbare Cell Strainer | STEMCELL Technologies | 27215 | |
| 50 mL Conische buis | VWR | 89039-658 | |
| 70 µm Sterile Cell Strainers | Fisher Scientific | FB22-363-548 | |
| Albumine, Rund (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9681 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Ham's Mixture F-12 (DMEM-F12) met 15 mM HEPES buffer | STEMCELL Technologies | 36254 | |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | STEMCELL Technologies | 100-0485 | |
| ImageJ | NIH | imagej.nih.gov/ij/ | |
| Incucyte S3 Live-Cell Analysis Instrument | Sartorius | 4647 | |
| Incucyte Scratch Wound Analysis Software Module | Sartorius | 9600-0012 | |
| IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) | STEMCELL Technologies | 06010 | Dit is HOGMY, maar zonder de Y-27632 of antibiotica. Ook gebruikt als basis voor HOGM, maar dan alleen zonder de antibiotica. |
| Lipopolysaccharides van Escherichia coli O111:B4, gezuiverd door gel-filtratie chromatografie | Millipore Sigma | L3012-10MG | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Fenol Rood-Vrij | Corning | 356231 | |
| Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-behandeld, Platte Bodemplaat | ThermoFisher Scientific | 136101 | |
| PBS (Phosphate-Buffered Saline), 1X [-] Calcium, Magnesium, pH 7.4 | Corning | 21-040-CM | |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | Dit zijn breed-spectrum antibiotica |
| Natrium Hyaluronaat, Onderzoekskwaliteit, HA20K | Lifecore Biomedical | HA20K-1 | |
| TC20 Automated Cell Counter | Bedrijf: Bio-Rad | 1450102 | |
| Trypsin-EDTA 1X, 0,25% Trypsin | Fisher Scientific | MT25053CI | |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72302 |
Referenties
- Lemons, J. A., et al. Very low birth weight outcomes of the National Institute of Child Health and Human Development Neonatal Research Network, January 1995 through December 1996. Pediatrics. 107 (1), 1(2001).
- Burge, K., Vieira, F., Eckert, J., Chaaban, H.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
