Microscopietechnieken voor het interpreteren van schimmelkolonisatie in mycoheterotrofe plantenweefsels en symbiotische kieming van zaden

Samenvatting

Dit protocol is bedoeld om gedetailleerde procedures te bieden voor het verzamelen, fixeren en onderhouden van mycoheterotrofe plantenmonsters, waarbij verschillende microscopietechnieken worden toegepast, zoals scanning- en transmissie-elektronenmicroscopie, licht-, confocale en fluorescentiemicroscopie om schimmelkolonisatie te bestuderen in plantenweefsels en zaden ontkiemd met mycorrhizaschimmels.

Samenvatting

Structurele plantkunde is een onmisbaar perspectief om de ecologie, fysiologie, ontwikkeling en evolutie van planten volledig te begrijpen. Bij het onderzoeken van mycoheterotrofe planten (d.w.z. planten die koolstof uit schimmels verkrijgen), kunnen opmerkelijke aspecten van hun structurele aanpassingen, de patronen van weefselkolonisatie door schimmels en de morfoanatomie van ondergrondse organen hun ontwikkelingsstrategieën en hun relaties met schimmeldraden, de bron van voedingsstoffen, verlichten. Een andere belangrijke rol van symbiotische schimmels is gerelateerd aan de kieming van orchideeënzaden; alle Orchidaceae-soorten zijn mycoheterotroof tijdens ontkieming en zaailingstadium (initiële mycoheterotrofie), zelfs degenen die fotosynthetiseren in volwassen stadia. Vanwege het gebrek aan voedingsreserves in orchideeënzaden zijn schimmelsymbionten essentieel om substraten te bieden en ontkieming mogelijk te maken. Het analyseren van kiemfasen door structurele perspectieven kan ook belangrijke vragen beantwoorden met betrekking tot de interactie van schimmels met de zaden. Verschillende beeldvormingstechnieken kunnen worden toegepast om fungi-endofyten in plantenweefsels te onthullen, zoals in dit artikel wordt voorgesteld. Vrije hand en dunne delen van plantenorganen kunnen worden gekleurd en vervolgens worden waargenomen met behulp van lichtmicroscopie. Een fluorochroom geconjugeerd aan tarwekiem agglutinine kan worden toegepast op de schimmels en co-geïncubeerd met Calcofluor White om de celwanden van planten te benadrukken in confocale microscopie. Bovendien zijn de methodologieën van scanning- en transmissie-elektronenmicroscopie gedetailleerd voor mycoheterotrofe orchideeën en worden de mogelijkheden onderzocht om dergelijke protocollen toe te passen in verwante planten. Symbiotische kieming van orchideeënzaden (d.w.z. in aanwezigheid van mycorrhizaschimmels) wordt in het protocol in detail beschreven, samen met mogelijkheden om de structuren verkregen uit verschillende stadia van ontkieming voor te bereiden voor analyses met licht-, confocale en elektronenmicroscopie.

Inleiding

Structureel onderzoek in de plantkunde, dat betrekking heeft op plantenmorfologie en anatomie, is fundamenteel voor het begrijpen van het hele organisme ^1,2, en biedt onmisbare perspectieven om te integreren en bij te dragen aan kennis over de ecologie, fysiologie, ontwikkeling en evolutie van planten³. Methoden in plantenmorfologie en anatomie omvatten momenteel protocollen, apparatuur en kennis die onlangs en meer dan een eeuw geleden zijn ontwikkeld². De continue uitvoering en aanpassing van klassieke methoden (bijv. Lichtmicroscopie) samen met meer recente technieken (bijv. Confocale microscopie, röntgenmicrotomografie) hebben dezelfde essentiële basis: theoretische kennis die de ontwikkeling van een methodologie mogelijk maakt.

Het belangrijkste hulpmiddel in de anatomie en morfologie van planten is het beeld. Ondanks de misvatting dat dergelijke analyses eenvoudige observaties zijn, ruimte geven aan subjectieve interpretaties², vereist het analyseren en begrijpen van beelden op dit gebied kennis van de toegepaste methoden (de apparatuur, type analyse, methodologische procedures), celcomponenten, histochemie en het plantenlichaam (weefselorganisatie en -functie, ontogenie, morfologische aanpassingen). Het interpreteren van de beelden verkregen via een verscheidenheid aan methoden kan leiden tot het correleren van vorm en functie, het ontcijferen van de chemische samenstelling van een structuur, het bevestigen van taxa, het begrijpen van infecties door fytopathogenen en andere dergelijke beoordelingen.

Bij het onderzoeken van mycoheterotrofe (MH) planten (d.w.z. niet-fotosynthetische planten die koolstof verkrijgen uit mycorrhizaschimmels ^4,5), kunnen opmerkelijke aspecten van hun structurele aanpassingen, de patronen van weefselkolonisatie door schimmels en de morfoanatomie van ondergrondse organen hun ontwikkelingsstrategieën en relaties met schimmeldraden, die de bron van voedingsstoffen zijn, verlichten. De ondergrondse organen van MH-planten vertonen meestal belangrijke aanpassingen in verband met hun associatie met bodemschimmels, daarom is het essentieel om deze anatomische en morfologische onderzoeken uit te voeren⁶. De luchtorganen van MH-soorten mogen niet worden genegeerd, omdat endofyten ook in deze weefsels aanwezig kunnen zijn, zelfs als het geen mycorrhizaschimmels zijn (persoonlijke waarnemingen, nog niet gepubliceerd).

Naast de gevestigde essentie van mycorrhizaschimmels associëring met MH-soorten gedurende hun hele levenscyclus⁷, heeft elke orchideeënsoort, zelfs de autotrofe, een initieel verplicht mycoheterotroof stadium in natuurlijke omgevingen. Het komt voor omdat het embryo van de orchideeën ongedifferentieerd is en geen endosperm of zaadlobben heeft, waardoor het niet in staat is zich te ontwikkelen en zich te vestigen in natuurlijke omgevingen zonder de voedingsondersteuning van schimmelpartners ^4,8. Gezien het feit dat symbiotische kiemprotocollen niet alleen kunnen worden toegepast op MH-soorten, maar ook op fotosynthetiserende orchideeën, gericht op het onderzoeken van orchidee-schimmelspecificiteit in kieming en protocormontwikkeling, een enorm toegepaste methodologie in initiatieven voor het behoud van bedreigde soorten ^9,10,11.

In deze methodeassemblage beschrijven we belangrijke stappen die betrokken zijn bij het verzamelen, fixeren en opslaan van MH-fabrieksmonsters voor anatomisch onderzoek (sectie 1), oppervlakteanalyse en monsterselectie (sectie 2), sectiemethoden (uit de vrije hand: sectie 3, microtomie: sectie 4, cryomicrotomie: sectie 5), kleuring en montage (sectie 6), fluorescentie en confocale microscopie van schimmel-endofyten (sectie 7), scanning-elektronenmicroscopie (sectie 8), en transmissie-elektronenmicroscopie (rubriek 9). Daarnaast beschrijven we een symbiotische kiemingsmethode voor orchideeënzaden (MH en autotroof, sectie 10), omdat de eerder genoemde beeldvormingsmethoden met succes kunnen worden toegepast om schimmelkolonisatie van zaden, protocormen en zaailingen in het kiemproces te analyseren.

Figuur 1: Schematische samenvatting van beeldvormingsmethoden. De schema's geven indicaties van protocolstappen waarin ze worden beschreven. Afkortingen: GMA = glycolmethacrylaat, OCT = optimale snijtemperatuurverbinding, SEM = scanningelektronenmicroscopie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De hier in detail beschreven microscopietechnieken (figuur 1) worden voorafgegaan door de volgende essentiële stappen: verzamelen, fixeren, dehydrateren, insluiten en doorsnijden van monsters. Aangezien de stappen variabel zijn (figuur 1), afhankelijk van de gekozen techniek(en), is het belangrijk om vooruit te denken, rekening houdend met de fixeermiddelen die moeten worden voorbereid en naar de verzamelplaats moeten worden vervoerd, hoe de monsters moeten worden voorbereid voordat ze worden gefixeerd, de te gebruiken dehydratatieprocessen (sectie 1) en verschillende inbeddingsmogelijkheden en sectiemethoden (secties 4, 5, en 9). Figuur 1 geeft een overzicht van alle stappen die nodig zijn voor elke microscopietechniek die hieronder grondig wordt beschreven.

Protocol

1. Verzamelen, bevestigen en onderhouden van monsters

OPMERKING: Volledig MH-planten zijn meestal te vinden in het donkere bos onder^12,13, voornamelijk in vochtige en strooiselrijke gebieden, terwijl gedeeltelijk MH-planten te vinden zijn in meer open bossen^12,13. MH-planten hebben meestal goed ontwikkelde ondergrondse organen in verschillende vormen en maten.

1. Bij het verzamelen van MH-soorten, verken de grond rond de plantenbasis, zorg ervoor dat ondergrondse organen niet worden beschadigd en vermijd het trekken van de planten van de grond om te voorkomen dat de luchtorganen worden losgekoppeld van de ondergrondse organen.
2. Graaf zorgvuldig rond luchtstructuren met behulp van een tuintroffel tijdens het verkennen van de ondergrondse organen zoals wortels, stengels, wortelstokken en opslagorganen, zonder deze structuren te beschadigen.
3. Verwijder bodemdeeltjes om fragiele structuren te behouden en was deze organen voorzichtig met kraanwater om de resterende bodemdeeltjes af te spoelen voordat de monsters worden bevestigd.
4. MH-planten geassocieerd met bladafval vragen extra aandacht; verzamel zorgvuldig organen die via hun schimmeldraden verbonden zijn met het ontbindende materiaal, vermijd het trekken van deze organen uit de verbonden structuren en verzamel ze zorgvuldig omdat deze delen zeer delicaat zijn. Bewaar structuren met dergelijke verbindingen en verzamel het strooisel ook voor analyse.
5. Als u ervoor kiest om vers materiaal te analyseren met behulp van beeldvormingstechnieken, onderhoudt u de monsters in gesloten plastic zakken met voldoende vocht, voldoende water dat verdampt en de plant hydrateert, waardoor overmatig water niet in contact komt met de monsters. Transporteer ze onmiddellijk naar het laboratorium en analyseer de monsters op dezelfde dag dat ze zijn verzameld, terwijl je erop let of de monsters nog steeds worden bewaard bij het analyseren ervan.
6. Breng fixeermiddelen naar de verzamelplaats in goed afgesloten containers. Fixeer monsters snel na verzameling voor lichtmicroscopie (LM) en scanningelektronenmicroscopie (SEM) in een van de volgende fixatieven: 10% neutraal gebufferd formaline (NBF¹⁴, tabel 1) of Karnovsky's oplossing (gemodificeerd¹⁵, tabel 2). Karnovsky's oplossing kan worden bereid met 0,2 M fosfaatbuffer¹⁵, waarvan het recept wordt beschreven in tabel 3.
7. Voor analyse door transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) snijdt u de monsters met een dikte van 4-3 mm in een druppel glutaaraldehyde-natriumcacodylaatbuffer (gewijzigd¹⁶, tabel 4) in kleinere secties van 1-2 mm dikte. Gooi de randen weg die buiten de druppel zijn gesneden. Breng de secties onmiddellijk over naar een verzamelbuis met een volume fixatief dat meer dan 10 keer groter is dan het volume van de monsters, omdat het een additief fixatief is (d.w.z. de moleculen worden chemisch toegevoegd aan de vaste eiwitten¹⁶).
   LET OP: De drie beschreven fixatieven zijn zeer giftig. Vermijd inademing, vooral tijdens het gebruik ervan in het veld. Bereid alle fixeermiddelen in een zuurkast met handschoenen. Meng cacodylaat en zuren niet, omdat arseengas kan worden gevormd¹⁶.
8. Als de vaste monsters in het fixatiemiddel zweven, duidt dit op de aanwezigheid van gas in plantenweefsels. Lucht en andere gassen voorkomen dat het fixatiemiddel het hele monster binnendringt². Verwijder gas uit weefsels door ze in kleinere delen opnieuw te bemonsteren en een vacuümpomp (-300 tot -400 inHg druk) te gebruiken totdat alle monsters naar de bodem van de oplossing zinken¹⁷. Wees voorzichtig, want overmatige druk uitgeoefend door de pomp kan monsters beschadigen.
9. Was na ten minste 48 uur in Karnovsky's oplossing of 10% NBF de monsters in 0,2 M PB (tabel 3) en droog ze uit met een reeks van 10%, 30%, 50% en ten slotte 70% ethanol. Voor delicate monsters, droog gedurende 30 minuten in elke concentratie; voor grotere monsters, droog gedurende 1 uur of langer.
   OPMERKING: Een 70% ethanoloplossing is het ideale medium voor het opslaan van monsters. Monsters in 70% ethanol kunnen jarenlang bij kamertemperatuur worden bewaard. Bewaar plantmateriaal niet voor lange perioden in de fixeermiddelen, omdat het verwijderen van fixatiemiddelen een essentiële stap is na fixatie².
10. Bewaar monsters in glutaaraldehyde-cacodylaat bij 4 °C voordat u overgaat tot postfixatie (stap 9.1).

10% neutraal gebufferd formaline (NBF)14
stap 1	voeg 10 ml 37-40% formaldehyde-oplossing toe in 80 ml gedestilleerd water
stap 2	voeg 0,4 g natriumfosfaat monobasisch monohydraat (NaH2PO4· H2O) naar de oplossing
stap 3	voeg 0,65 g natriumfosfaat dibasisch, watervrij (Na2HPO4) toe
stap 4	vul het volume aan tot 100 ml

Tabel 1: 10% neutraal gebufferd formaline recept¹⁴.

Karnovsky's oplossing (gewijzigd15)
stap 1	in 20 ml gedestilleerd water bij 60-70 °C
stap 2	voeg 0,8 g paraformaldehyde toe (om 4% g/v te verkrijgen), roerend
stap 3	voeg 1-4 druppels van 40% NaOH toe en roer tot de oplossing helder wordt
stap 4	koel het af en voeg 30 ml 0,2 M fosfaatbuffer pH 7,2 toe (tabel 3)
stap 5	verdun 25% glutaaraldehyde in 0,1 M PB (pH 7,2) om 1% glutaaraldehyde te verkrijgen (eindvolume: ~60 ml)
stap 6	voeg 1% glutaaraldehyde (stap 5) toe aan de in stap 4 verkregen oplossing totdat het tot 100 ml fixatief is gemaakt

Tabel 2: Karnovsky's oplossingsrecept (gewijzigd¹⁵).

0,2 M fosfaatbuffer (PB) pH 7,2
stap 1	voeg 14,196 g natriumfosfaat dibasisch, watervrij (Na2HPO4) toe aan 400 ml gedestilleerd water
stap 2	voeg 13,8 g natriumfosfaat monobasisch monohydraat (NaH2PO4· H2O)
stap 3	roer tot de oplossing helder is
stap 4	pas het uiteindelijke volume aan op 500 ml met gedestilleerd water
stap 5	stel de pH in op 7,2
stap 6	voor een 0,1 M PB, verdun 1:1

Tabel 3: 0,2 M fosfaatbufferrecept.

3% glutaaraldehyde 0,2 M natriumcacodilaatbuffer (gemodificeerd16)
stap 1	0,2 M cacodylaatbuffer: voeg 4,28 g natriumcacactylietydraat toe aan 100 ml gedestilleerd water
stap 2	stel de pH in op 7,2
stap 3	voeg 12 ml 25% glutaaraldehyde toe in 25 ml van de oplossing in stap 2 (0,2 M cacodylaatbuffer pH 7,2)
stap 4	vul het volume aan tot 100 ml met gedestilleerd water

Tabel 4: 3% glutaaraldehyde 0,2 M natriumcacodylaatbufferrecept (gewijzigd¹⁶).

2. Oppervlakteanalyse van organen in vast en niet-vast materiaal

1. Om oppervlakkige schimmeldraden in organen te analyseren, vooral ondergrondse, en die in contact komen met bladafval, observeer vast of vers materiaal in een ontleedmicroscoop (stereomicroscoop) bij een vergroting van 7,5x of hoger, afhankelijk van de geanalyseerde monsters.
   1. Visualiseer de monsters ondergedompeld in het fixatieve, 70% ethanol (indien daarin opgeslagen), of kraanwater in het geval van vers materiaal. Voorkom direct licht van de ontleedmicroscoop, omdat dit monsters kan drogen en beschadigen.
   2. Zoek naar interessegebieden in de monsters, geleid door de oppervlakkige schimmeldraden en rhizomorfen. Selecteer monsters die gebieden met oppervlakkige rhizomorfen bevatten, omdat deze kunnen worden doorsneden om pelotonen en schimmeldraden in corticale cellen in wortels en stengels te visualiseren.
   3. Volg na selectie de stappen 1.6 en 1.9 als de monsters nog niet zijn gefixeerd. Fotografeer indien gewenst verse monsters met een lichtmicroscoop zonder bevestiging, zoals beschreven in rubriek 3.
   4. Gebruik de camera gekoppeld aan de stereomicroscoop om beelden te verzamelen van orgaanoppervlakken, rhizomorfen en andere waargenomen structuren. Zorg in dergelijke gevallen voor een adequate achtergrondkleur om goed te contrasteren met het materiaal en kies indien mogelijk een achtergrondmateriaal met een minder ruw oppervlak (bijvoorbeeld papier).

3. Vrije hand secties van plantenorganen

OPMERKING: Vrije hand secties van plantenorganen kunnen een uitdaging zijn, vooral voor kleine en dunne structuren. Deze delen van weefsels met schimmel-endofyten kunnen echter in sommige gevallen schimmeldraden en andere kenmerken beter aantonen in vergelijking met dunne secties.

1. Snijd verse of vaste monsters met een scherp mes, snijd ze zo dun mogelijk en plaats ze onmiddellijk in een kleine petrischaal met water (indien vers) of 70% ethanol (indien vast). Gebruik een klein penseel om de secties te manipuleren zonder ze te beschadigen.
2. Om het snijden van meer uitdagende materialen (d.w.z. kleine, dunne, flexibele organen) te vergemakkelijken, omringt u het monster in een structuur, bijvoorbeeld polystyreen of Cecropia-bladsteel . Snijd de ondersteuning om het monster te accommoderen en maak een dun gedeelte van het monster en de ondersteuning helemaal.
3. Beits en monteer de monsters zoals beschreven in rubriek 6.

4. Inbedding van plantenmonsters in hars en secties

1. Verdere uitdroging van de monsters opgeslagen in 70% ethanol in 80%, 96% en 2x in 100% ethanol, gedurende 30 minuten tot 2 uur, afhankelijk van de grootte en samenstelling van de monsters.
2. Gebruik een glycol methacrylaat (GMA) hars kit volgens de instructies van de fabrikant. Bekijk Gerrits en Horobin (1996)¹⁸ voor verdere overwegingen. Volg dienovereenkomstig de stappen voor infiltratie en inbedding.
   LET OP: GMA-hars is giftig, het kan allergische reacties en huid-, ogen- en slijmvliesirritatie veroorzaken. Gebruik de reagentia in een zuurkast en gebruik handschoenen.
3. Gebruik polyethyleen gietbakken voor inbedding, geselecteerd op monstergrootte (bijv. 13 mm x 19 mm x 5 mm voor grotere monsters, 6 mm x 8 mm x 5 mm voor kleinere). Besteed aandacht aan de gewenste monsteroriëntatie in de mal en gebruik een naald om te helpen oriënteren.
4. Laat voor polymerisatie, bij voorkeur bij kamertemperatuur, totdat het volledig is gestold. Het verhardingsproces duurt meestal een paar uur, hoewel het wordt aanbevolen om de blokken de volgende dag te ontsmolten. Maak na polymerisatie de harsblokken voorzichtig los van de mallen en ga zo snel mogelijk verder met het bevestigen van de blokken om uitbuiging van het blok te voorkomen.
5. Schuur het oppervlak van het harsblok dat zal worden bevestigd, waardoor een plat oppervlak ontstaat. Lijm het harsblok op een houten kubus (2 cm x 2 cm x 3 cm aanbevolen) met een vloeibare cyanoacrylaatlijm met gemiddelde viscositeit (zie Materiaaltabel). Zorg ervoor dat de hars volledig is bevestigd om te voorkomen dat de secties in gevaar komen.
6. Voer secties uit in een roterende microtoom zoals hieronder beschreven.
   LET OP: De messen van microtoommessen zijn zeer scherp en kunnen ongelukken veroorzaken. Zorg ervoor dat u ze behandelt volgens alle veiligheidsmaatregelen. Voordat u het mes nadert (bijvoorbeeld om het blok te vervangen, om de hars te bevochtigen), vergrendelt u het grove handwiel en plaatst u het veiligheidsdeksel van het lemmet. Bewaar wegwerpmesjes in geschikte gevallen. Wees uiterst voorzichtig bij het vervangen van messen.
   OPMERKING: Verschillende soorten messen (bijv. wegwerp of vast; glas of staal) kunnen worden gebruikt om GMA-hars¹⁸ te snijden. De kwaliteit van de secties hangt af van hoe scherp het mes is. Zorg ervoor dat het mes goed vastzit en niet kan bewegen. Wegwerpmessen moeten mogelijk regelmatig worden vervangen om een betere sectie te bereiken.
   1. Bevestig de houten kubus stevig aan de blokhouder. Pas de oriëntatie van de sectie aan met behulp van de oriëntatieschroeven en zorg voor een adequate hoek van het mes met behulp van de meskanteling. Selecteer de dikte van de secties; gebruik een dikkere instelling voor het trimmen en een dunnere instelling voor geselecteerde secties, omdat GMA-secties zich beter hechten aan de glasschuif wanneer deze dunner zijn; de voorgestelde dikte voor plantenweefsels is 5-8 μm.
   2. Voordat u begint, koelt u de kamer indien nodig, omdat hogere temperaturen de kwaliteit van secties verslechteren. Bereid het volgende voor op sectie: een bekerglas met gedestilleerd water, een hete plaat, verfborstels (ten minste twee), een fijnpuntpincet, een Pasteur-pipet, glazen dia's, filterpapier (of tissuepapier) en een potlood (om de monsters te identificeren die worden gesneden).
   3. Zet de kookplaat op 50 °C en plaats het bekerglas erop. Let op verschillen in verwarming afhankelijk van het gebied van de kookplaat (meestal verwarmt het middelste gebied meer dan de randen; verwarm het water bij voorkeur in het midden).
   4. Kies een glazen dia, identificeer deze met een potlood en pipetteer het warme gedestilleerde water over het hele diaoppervlak. Gebruik indien nodig een oplossing (bijv. reinigingsmiddel en water, of 70% ethanol) om de spanning tussen het water en het glas te verbreken, zodat de hele glijbaan gelijk bedekt is. Sommige soorten dia's moeten vooraf worden gereinigd met 70% ethanol om voldoende sectietrouw te verkrijgen.
   5. Begin met het geleidelijk naar voren brengen van het oppervlak van het harsblok naar het mesblad. Probeer niet te sectieren zonder eerst het blok vooruit te helpen, anders kunnen de apparatuur en het blok beschadigd raken. Snijd het blok indien nodig bij met een hogere dikte (10 μm en hoger).
   6. Maak bij het naderen van een geschikte sectie een stevige eenrichtingsbeweging met het handwiel, zodat de sectie in één keer wordt gemaakt. Houd het harsvocht in de gaten. Hydrateer tijdens het snijden regelmatig het gezicht van het blok dat wordt gesneden met behulp van een penseel gedoopt in gedestilleerd water als er een probleem is met krulsecties. Verwijder overtollig water met een tissuepapier.
   7. Plaats met een fijn punt pincet het verkregen gedeelte in het water over de glijbaan. Bij contact met water rekt GMA-hars uit. Gebruik indien nodig een penseel om de secties voorzichtig uit te vouwen en uit te rekken. Gebruik een andere kwast om het mes constant vrij te houden van harsresten. Wissel niet tussen de penselen om te voorkomen dat het mes nat wordt.
   8. Nadat u alle gewenste secties in de dia in de wachtrij hebt geplaatst, droogt u de onderkant van de dia en plaatst u deze boven de kookplaat. Verwijder het overtollige water van de bovenkant van de dia door voorzichtig te deppen met een filterpapier (optioneel). De secties zullen hechten wanneer het water uit de glijbaan verdampt. Laat de dia's niet te lang staan om te voorkomen dat de secties worden beschadigd door overmatige hitte.
   9. Bewaar de dia's in een schuifdoos, uit de buurt van stof en de zon, en gebruik ze voor vlekken en andere procedures. De dia's kunnen meerdere jaren worden bewaard.

5. Invriezen van plantenmonsters en sectie met een cryostaat

OPMERKING: De essentiële overweging bij cryosectie van biologisch weefsel is om schade als gevolg van ijskristalvorming te verminderen bij het invriezen van monsters. Cryoprotectie wordt meestal gedaan door chemisch inerte oplossingen zoals glycerol of sucrose^19,20 te infunderen.

1. Voer een dag voor de monstersectie de volgende stappen uit.
   1. Verdun 100 ml 0,2 M PB (tabel 3) in 100 ml gedestilleerd water om 200 ml van 0,1 M PB te verkrijgen. Bereid 10%, 20% en 30% sucrose-oplossingen in 0,1 M PB (voeg bijvoorbeeld voor een 10% oplossing 2 g sucrose toe in 20 ml buffer).
   2. Voor verse monsters, was ze in 0,1 M PB gedurende 30 minuten. Voor monsters in een fixatief, was ze in dezelfde buffer die wordt gebruikt voor het bereiden van het fixeermiddel gedurende 30 minuten. Voor monsters in 70% ethanol, hydrateer ze in 50% en 30% ethanol en was in 0,1 M PB gedurende 1 uur in elke oplossing.
   3. Incubeer de monsters gedurende 2 uur in 10% sucrose, 2 uur in 20% sucrose en 2 uur in 30% sucrose, bij kamertemperatuur. Incubeer daarna een nacht in 30% sucrose bij 4 °C (of ten minste gedurende 3 uur; maximale tijd is 48 uur).
2. Bereid op de dag van de sectie 40% en 50% sucrose in 0,1 M PB; bereid sucrose-oplossingen niet meer dan 12 uur van tevoren. Incubeer gedurende 2 uur in elke sacharoseconcentratie bij 4 °C.
3. Maak voor het inbedden, in kleine mallen, een laag OCT-verbinding (optimaal snijtemperatuurmedium, gebruikt voor het inbedden en invriezen van de monsters) en houd het op -20 ° C om in te vriezen. De mallen kunnen gewone histologische mallen zijn, maar om het ontsmolten van de blokken te vergemakkelijken, kunnen papieren of tinfoil-mallen worden gemaakt met behulp van een klein kubusje als frame en plakband.
4. Nadat de onderste laag van de OCT-verbinding in de mallen is bevroren, werkt u in een cryostaatkamer (ca. -27 °C). Plaats de monsters geïncubeerd in 50% sucrose in de mallen, in de richting waarin ze zullen worden gesneden. Het bovenste gezicht van een kubusvormig blok is meestal een beter gezicht van secties. Markeer in de mal waar de monsters worden geplaatst, zodat het blok gemakkelijk kan worden bijgesneden en de juiste oriëntatie kan worden gehandhaafd.
5. Omring de monsters in OCT-verbinding en breek elke luchtbel die de monsters raakt. Vries ze in bij -20 °C. Plaats de blokken volledig ingevroren in de cryostaatkamer (ca. -27 °C). Maak ze allemaal alleen los voor gebruik en let op de markeringen die de monsterlocatie in het blok aangeven.
6. Omdat OCT-compound gemakkelijk met een mes kan worden gesneden, moet u de blokken op de juiste manier bijsnijden voordat u ze op de klauwplaten plaatst. Doe wat OCT-verbinding in de cryostaathouder en plaats het blok zo dat het bovenvlak wordt doorsneden. Gezichten met kleinere gebieden zorgen voor betere secties. Wacht tot het blok goed is bevestigd aan de klauwplaat en test het voordat u begint met sectie.
7. Plaats de klauwplaat stevig in de klauwplaathouder. Pas de oriëntatie van de sectie aan met behulp van de oriëntatieschroeven. Pas de hoek van het mes aan met behulp van de meskanteling. Selecteer de dikte van de secties. De monsters kunnen dikker worden gesneden dan gebruikelijke harssecties. Secties in een bereik tussen 5-20 μm worden met succes verkregen, waarbij dikkere secties gemakkelijker te maken zijn (minder krullen en minder schade aan structuren).
8. Beweeg het gezicht van het bevroren blok naar het mesblad. Probeer geen sectie zonder dit te doen, anders kan het blok losraken van de klauwplaat en beschadigd raken. Snijd het blok indien nodig bij met een hogere dikte (10 μm en hoger).
9. Wanneer u een geschikte sectie nadert, plaatst u de antirolplaat (d.w.z. een transparante plaat die de sectie behoudt) boven het mes en maakt u een stevige eenrichtingsbeweging met het handwiel, zodat de sectie in één keer wordt gemaakt. Krulproblemen kunnen worden veroorzaakt als de antirolplaat moet worden aangepast (deze is meestal instelbaar ten opzichte van het blad) of als er puin in het blad zit. Reinig het mes constant met een penseel om vuil te verwijderen.
10. Gebruik speciale dia's zodat de secties gemakkelijk kunnen worden bevestigd, zoals gesilumaniseerde dia's (commercieel of bereid met 2% aminoalkylsilaan in aceton²¹), of dia's bereid met 500 μg / ml poly-L-Lysine in gedestilleerd water²¹ of 0,2% gelatine (zie details²¹). Houd de dia's op kamertemperatuur.
11. Om de sectie aan een glijbaan te hechten, tilt u de antirolplaat op en zorgt u ervoor dat de dia snel de sectie raakt. Omdat de glijbaan op kamertemperatuur is, smelt het gedeelte onmiddellijk en hecht het zich aan de glijbaan. Let op het draaien van het behandelde gezicht van de dia naar het gedeelte, dat boven het mes of op de binnenkant van de antirolplaat kan blijven. Om krullen van secties te voorkomen, voert u deze stap snel uit zodra de plaat wordt opgetild en moet u oppassen dat u de sectie niet verdraait.
12. Laat de schuif buiten de cryostaatkamer (bij kamertemperatuur) als er nieuwe secties aan moeten worden toegevoegd. Nadat u alle gewenste secties aan de dia hebt bevestigd, bewaart u deze in de cryostaatkamer of in de vriezer (-20 °C of lager). Stel de dia's niet bloot aan vocht. Bewaar ze in een diavak en vergeet niet om de dia's met een potlood te identificeren.
    OPMERKING: Dia's en blokken OCT kunnen worden bewaard bij -20 °C, maar niet te lang. Om betere resultaten te bereiken, gebruikt u de dia's en de blokken binnen een paar dagen.

6. Kleuring plantensecties en endofyten voor lichtmicroscopie

OPMERKING: Veel soorten vlekken kunnen worden gebruikt voor plantensecties. Het is een uitdaging om endofytische schimmels en plantenweefsels differentieel te kleuren. Hoewel het geen kleuringsprocedure is, wordt in rubriek 7 een methode voor het markeren van schimmelstructuren gepresenteerd (fluorescentie met een tarwekiemagglutinineconjugaat). Secties uit de vrije hand (uitgelegd in sectie 3), harssecties (sectie 4) en cryosecties (sectie 5) kunnen worden gekleurd, hoewel vlekken op basis van fenol en alcohol een uitdaging zijn voor deze monsters, omdat GMA-hars en OCT in deze gevallen de hechting aan de dia verliezen.

1. Gebruik een of combineer de volgende gebruikelijke kleuringsmethoden voor plantenmonsters.
   1. Toluidineblauw O ^22,23, een veel toegepaste methode voor algemene kleuring van plantendelen. Bereid een oplossing van 0,05% toluidineblauw O in 0,1 M fosfaat (pH 6,8) of 0,09 M citraatbuffer (pH 4,5-4,8), afhankelijk van de soort en soorten weefsel. Incubeer GMA-harssecties gedurende 2-10 minuten met behulp van een glaaskleuringspot of door enkele druppels boven de secties te plaatsen als er weinig dia's zijn gekleurd. Was zorgvuldig met gedestilleerd water of buffer na incubatie en monteer de dia's met water of droog ze op een hete plaat om permanente dia's te produceren zoals beschreven in stap 6.3.
   2. Lugolreagens² duidt op de aanwezigheid van zetmeel. Bereid een 5% jodium (I₂) en 10% kaliumjodide (KI) oplossing in gedestilleerd water. Vleksecties gedurende 2 minuten, door enkele druppels boven de dia toe te voegen en vervolgens te wassen met gedestilleerd water. Deze histochemische test wordt meestal toegepast op tijdelijke dia's.
   3. Sudan III, IV en zwarte B^24,25 vlek voor verschillende lipiden. Bereid een oplossing van 0,3% Soedan (III, IV of zwart B) in 70% ethanol, verwarm het tot het kookt en laat afkoelen. Gebruik het supernatant, filter het en incubeer secties gedurende 15-30 minuten in een gesloten petrischaal. Was de secties zorgvuldig met 70% ethanol en gedestilleerd water. Monteer de dia's met water (meestal alleen toegepast op tijdelijke dia's).
      OPMERKING: Omdat Soedan een op alcohol gebaseerde kleurstof is, is het meer geschikt voor secties uit de vrije hand. Voer GMA-harssectievlekken zorgvuldig uit, omdat ze meestal loskomen van de glijbaan.
2. Voor tijdelijke dia's monteer je de secties in water of glycerine en observeer je vervolgens. Sluit de coverslip af met nagellak om ze wat langer te bewaren.
3. Voor permanente dia's monteer je de secties met kunstharsen (bijv. snelmontagemedium, zie Materiaaltabel). Druppel een paar druppels van het montagemedium (het kan de coverslip overlopen), plaats de coverslip voorzichtig om bubbels te voorkomen en gebruik wasknijpers om de schuif tegen de coverslip te drukken totdat deze volledig droog is. Verwijder het teveel aan gedroogd montagemedium met een scheermesje.

7. Toepassing van een fluorochroom geconjugeerd op tarwekiemagglutinine in fluorescentie en confocale microscopie

OPMERKING: Deze methode kan worden toegepast op secties uit de vrije hand (uitgelegd in sectie 3), harssecties (sectie 4) en cryosecties (sectie 5). Cryosecties kunnen geschikt zijn voor confocale microscopiedoeleinden, omdat dikkere monsters kunnen worden verstrekt in vergelijking met harssecties, maar niet zo dik als uit de vrije hand. Een fluorochroom geconjugeerd aan tarwekiemagglutinine (WGA, zie Tabel van materialen) wordt toegepast op schimmelbeeldvorming in fluorescentiemicroscopie²⁶. Een confocale microscoop is niet essentieel, hoewel het duidelijke driedimensionale beelden van plantenstructuren kan opleveren²⁷.

1. Bereid een oplossing van 0,2 mg/ml WGA-fluorochroomconjugaat in 0,1 M PB²⁸ (pH 7,2, controleer stap 5.1.1 en tabel 3). Bereid een oplossing van 1% Calcofluor White in 0,1 M PB (pH 7,2). Bereid kleine hoeveelheden van deze oplossingen voor, omdat de secties er direct mee worden geïncubeerd.
2. Incubeer de secties in de glasglaasjes gedurende 30 minuten in de WGA-fluorochroomconjugaatoplossing²⁹, gebruik voldoende volume om de secties te bedekken en was vervolgens in 0,1 M PB.
3. Incubeer de secties in de calcofluoroplossing en gebruik voldoende volume als montagemedium. De oplossing kan tijdens de observatieperiode worden gehandhaafd.
4. Leg coverslips op de dia's en observeer in een confocale microscoop of een fluorescentielichtmicroscoop met behulp van de volgende filters: TC/GFP (excitatie: 470-440, emissie: 525-550, voor WGA-fluorochroom in de tabel van materialen - schimmelcelwand fluoresceert groen onder dit filter²⁹) en DAPI (excitatie: 358, emissie: 463, voor calcofluorwit)³⁰.
   OPMERKING: Driedimensionale beelden kunnen worden verkregen met behulp van de Z-serie functie in de confocale microscoop²⁷.

8. Scanning elektronenmicroscopie van plantenorganen

1. Na het fixeren van monsters, het uitvoeren van dehydratie en het opslaan in 70% ethanol (sectie 1), is een mogelijkheid om monsters te snijden om elk gewenst oppervlak bloot te leggen voor SEM-analyse, indien nodig (bijv. Interne weefsels, eierstokstructuur). Gebruik een scherp en nieuw scheermesje en maak sneden met een eenrichtingsbeweging, waardoor een beschadigd uiterlijk van deze gebieden in SEM wordt vermeden. Gebruik indien nodig een stereomicroscoop om de monsters te selecteren en overweeg het gebied met metalen stompen om de steekproefgrootte te bepalen.
2. Verdere uitdrogingsmonsters voor SEM in een ethanolische reeks: 80%, 96% en 2x in absolute ethylalcohol (≥99,8%). Houd kleine en delicate monsters gedurende 30 minuten in elke concentratie en grotere en dichtere monsters gedurende 1 uur.
3. Vouw kleine enveloppen met tissuepapier om monsters te organiseren voor de volgende stappen, grotere monsters kunnen zonder envelop worden verwerkt. Identificeer de enveloppen met een potlood door een brief of een nummer te schrijven en houd een logboek bij van alle monsters in elk exemplaar. Bewaar de monsters in absolute ethanol, hoewel niet voor lang, en ga zo snel mogelijk verder met stap 8.4.
4. Ga verder met het drogen van kritieke punten (CP). Bedien een CP-droger volgens de standaard bedrijfsprocedures. Plaats monsters in absolute ethanol (tussenvloeistof) in een drukkamer. Op het kritieke punt CO₂ (31 °C, 7,3 x 10⁶ Pa) lost de tussenvloeistof op in de overgangsvloeistof (vloeibaar kooldioxide) en worden de monsters gedroogd³¹.
5. Bewaar monsters na het CP-drogen zo snel mogelijk in een droogmiddel, bijvoorbeeld een afgesloten kolf met silicagel. Luchtvochtigheid kan de monsters vernietigen als ze opnieuw worden geabsorbeerd³¹.
6. Gebruik metalen stompen om de monsters te monteren. Voor het monteren, doe handschoenen aan om de stompen te manipuleren, dompel ze gedurende 5 minuten onder in aceton om vet te verwijderen en laat ze drogen. Gebruik een geleidende dubbelzijdige koolstofkleefband om monsters op de stomp te bevestigen en een stereomicroscoop om monsters te positioneren, rekening houdend met het feit dat het zicht van bovenaf het enige mogelijke perspectief is in SEM-afbeeldingen.
7. Manipuleer monsters met een fijn pincet, wees voorzichtig omdat het monstergedeelte dat door het pincet wordt aangeraakt meestal beschadigd is, dus probeer onderdelen aan te raken die uit de buurt van de interessegebieden zijn geplaatst (bijvoorbeeld gebieden die in contact komen met de tape). Onderhoud de stompen met monsters in een afgesloten petrischaal met silicagel. Ga zo snel mogelijk verder met stap 8.8.
8. Gebruik een sputtercoater om een laag metaal, meestal goud of platina, op het oppervlak van de monsters af te zetten in een lagedrukatmosfeer van een inert gas, vaak argon³¹. Volg de standaard operationele procedures bij het gebruik van een sputtercoater. De laagdikte is afhankelijk van de topografie van de monsters, meestal tussen 15-40 nm³².
9. Bewaar de gecoate stompen in een afgesloten petrischaal met silicagel en op voorwaarde dat de silicagel vocht vasthoudt, kunnen monsters op deze manier wekenlang worden bewaard. Gebruik een scanning elektronenmicroscoop om de monsters te analyseren. De monsters in vacuo worden getroffen door een bundel elektronen en de emissie van signalen van een dergelijke interactie wordt geïnterpreteerd als beelden³¹. Voor meer informatie over het bedienen van een scanning elektronenmicroscoop, lees Jeffree en Read (1991)³¹ en Bozzola en Russell (1999)³².
10. Om de stompen opnieuw te gebruiken, trekt u aan de plakband en schrobt u ze met draadwol. Was in leidingwater, dompel ze onder in absolute ethanol en droog ze adequaat, waardoor oxidatie van het samenstellende metaal wordt voorkomen.

9. Transmissie-elektronenmicroscopie

1. Prefix monsters met glutaaraldehyde-cacodylaat buffer zoals uitgelegd in stap 1.7 en 1.10. Was de monsters na 12-24 uur prefixatie 3x in 0,2 M cacodylaatbuffer (pH 7,25) gedurende 10 min. Voer postfixatie uit met 1% osmiumtetroxide (OsO₄) in 0,2 M cacodylaatbuffer, gedurende 12 uur in het donker, bij kamertemperatuur. Was 3x met gedestilleerd water gedurende 5 min.
   LET OP: Cacodylaat en osmiumtetroxide zijn zeer giftig en mogen niet worden ingeademd. Gebruik ze in zuurkasten, volgens de respectieve veiligheidsinformatiebladen.
2. Droog de monsters uit met 30%, 50%, 70% en 96% ethanol, 2x in elke concentratie, gedurende 10 minuten. Droog vervolgens 3x uit in absolute alcohol, gedurende 15 minuten per keer.
3. Infiltreer de monsters in hydrofiele acrylharsen (zie Tabel van materialen), eenmaal met 1:1 hars + absolute ethanol en 3x met pure hars gedurende 8-12 uur elk. Voer polymerisatie uit in gelatinecapsules bij 60 °C totdat het volledig is gestold (maximaal^{12 uur).}
4. Evalueer nauwgezet de oriëntatie van monsters in het harsblok; snijd het bovenste deel van het blok, met een scheermesje, maak een piramidale vorm die het monster concentreert in het sectiegebied. Verkrijg semidunne secties (250-500 nm)³³ in een ultramicrotoom met een diamantmes en plaats op glazen dia's in enkele druppels water.
5. Bewaar de dia's op een hete plaat bij 60 °C. Kleur de secties met toluidineblauw O zoals in stap 6.1.1 en laat de vlek volledig drogen. Was voorzichtig met kraanwater. Evalueer de verkregen sectie door vier kwadranten te tekenen en het meest geschikte kwadrant voor analyse te selecteren.
6. Snijd het blok zo in dat de piramidale vorm het gekozen kwadrant concentreert op het bovenvlak van het blok. Produceer ultradunne secties (50-100 nm)^33,34. Dikte wordt geëvalueerd op basis van de interferentiekleur van de secties: secties met ongeveer 70 nm lijken zilver-goud, met ongeveer 100 nm lijken goud en met ongeveer 200 nm verschijnen blauw³⁴.
7. Verzamel de ultradunne secties uit water met behulp van koperen roosters en ga verder met de contrastkleuringsmethode met uranylacetaat en loodcitraat, zoals hieronder beschreven.
   1. Bereid een loodcitraatoplossing (tabel 5) en vries de uiteindelijke oplossing in microcentrifugebuizen in met 1 ml oplossing in elk, alleen ontdooien vlak voor gebruik.
   2. Bereid een uranylacetaatoplossing: los 0,625 g uranylacetaat [UO₂(CH₃COO)₂] op in 25 ml recent gekookt en gekoeld gedestilleerd water. Bewaren in een donkere kolf in de vriezer.
      LET OP: Loodnitraat is giftig bij inname. 1 N NaOH is zeer corrosief. Uranylacetaat is radioactief en giftig. Het mag niet worden ingenomen, ingeademd of in contact komen met de huid.
   3. Doe bij het kleuren beide bereide reagentia in afzonderlijke spuiten van 3 ml met filtereenheden (porie van 0,22 μm, zie materiaaltabel). Bereid een petrischaaltje ondersteboven met een afdichtende thermoplastische film eroverheen (zie Tabel met materialen) en in een bredere schaal, met NaOH-pellets aan de randen als val voor CO₂³² (zie figuur 2).
   4. Gooi de eerste druppel weg en plaats over de film een druppel uranylacetaat en drie druppels gedestilleerd water voor elk rooster gekleurd. Doe hetzelfde met loodcitraat en voeg nog drie druppels gedestilleerd water toe.
   5. Incubeer het raster (met de ondoorzichtige kant naar beneden, waar de secties zijn) in uranyl gedurende 30 minuten (variabele tijd). Was 3x in de gedestilleerde waterdruppels en droog het rooster telkens voorzichtig met filtreerpapier aan de schitterende kant. Herhaal dit met de druppel loodcitraat (30 min) en was deze.
8. Analyseer na ten minste 4 uur de roosters in een transmissie-elektronenmicroscoop. In deze microscoop gaat een bundel elektronen door de secties in vacuo en wordt het beeld geprojecteerd op een fluorescerend scherm. Voor meer informatie over het bedienen van een transmissie-elektronenmicroscoop, lees Bozzola en Russell (1999)³².

loodcitraatoplossing (voor TEM-contrastkleuring)
stap 1	omring een bekerglas met tinfoil
stap 2	los 0,266 g loodnitraat [Pb(NO3)2] op in 6 ml recent gekookt en gekoeld gedestilleerd water
stap 3	roer gedurende 2 min
stap 4	voeg 0,352 g trinatriumcitraat toe [Na3(C6H5O7).2H2O] (de oplossing moet er melkachtig uitzien)
stap 5	roer gedurende 15 minuten, sluit het bekerglas af met tinfoil en breng de oplossing over op een bekerglas van 10 ml
stap 6	voeg 1,6 ml 1N NaOH en 2,4 ml gedestilleerd water toe (de oplossing moet doorschijnend zijn)
stap 7	indien nodig, de pH dicht bij 12

Tabel 5: Recept voor loodcitraatoplossing.

Figuur 2: Contrasterend kleuringsschema met loodcitraat en uranylacetaatoplossingen. (A) Bereid de petrischalen voor, één ondersteboven gedraaid (in het midden) met thermoplastische film, zodat druppels erboven kunnen worden geplaatst, in een bredere. NaOH pellets zijn plaatsen rond de centrale schotel. (B) Uranylacetaatdruppels worden in de cirkels met de letter U geplaatst en loodcitraatdruppels in de cirkels gemarkeerd met L. DW duidt op druppels gedestilleerd water. De rasters zijn sequentieel gekleurd in de kolom, zodat vijf rasters tegelijkertijd kunnen worden gekleurd zoals weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

10. Symbiotische kieming van orchideeënzaden

1. Zorg ervoor dat de oplossingen en alle materialen die worden gebruikt bij symbiotische ontkieming van zaden steriel zijn om besmetting te voorkomen. Begin met ze gedurende 20 minuten te autoclaveren bij 121 °C. De symbiotische kiemstappen zijn samengevat in figuur 3.
2. Desinfecteer fruit en zaden oppervlakkig door ze onder te dompelen in natriumhypochlorietoplossing met 2% actief chloor gedurende 10-15 minuten voor fruit en 7-10 minuten voor zaden, rekening houdend met de stijfheid en dikte van zaadlaag⁹. Slanke en fragiele zaden kunnen worden ondergedompeld in een 1:1 verdunde natriumhypochlorietoplossing. Was daarna 3x in geautoclaveerd gedestilleerd water om de hypochlorietoplossing te verwijderen.
3. Herstel de zaden door te filteren in zeefdruk en gebruik de zaden om door te gaan met kiemproeven (bij voorkeur). Bewaar ze zo nodig in enveloppen van filterpapier in glazen kolven met silicagel, bij 4 °C, sluit de kolven hermetisch en sluit ze af met vershoudfolie. Breng enkele druppels water van de laatste wasbeurt over op aardappeldextrose-agar (PDA, 39 g / L), om de effectiviteit van het wasproces te evalueren.
4. Voordat zaden in het kweekmedium worden gezaaid, moet u de levensvatbaarheid ervan evalueren door middel van de tetrazoliumtest (optioneel) zoals beschreven onder³⁵.
   1. Incubeer ongeveer 10 mg zaden in een microcentrifugebuis met 1 ml 10% sucrose in gedestilleerd water, gedurende 24 uur bij kamertemperatuur (ca. 25 °C), in licht.
   2. Verwijder de sucrose-oplossing met een micropipette en voeg 1 ml tetrazoliumoplossing (trifenyltetrazoliumchloride) toe aan gedestilleerd water. Incubeer bij 40 °C in een thermoblok gedurende 24 uur in het donker.
   3. Verwijder de tetrazoliumoplossing met een micropipette en was de zaden met gedestilleerd water 2x of totdat de oplossing is verwijderd. Verwijder alle vloeistoffen. Indien nodig kunnen de zaden maximaal een week in de vriezer worden bewaard (zoals in stap 10.3) voordat ze worden geanalyseerd.
   4. Resuspendeer de zaden in gedestilleerd water en analyseer ze onder een lichtmicroscoop. Levensvatbare zaden krijgen een lichte tot donkerrode kleur, terwijl niet-levensvatbare zaden hun natuurlijke kleur behouden.
5. Voer het volgende aangepaste^9-protocol uit voor symbiotische kieming van orchideeënzaden.
   1. Incubeer de zaden over geautoclaveerde filterpapierschijven (1-2 cm in diameter) geplaatst in petrischalen met havermout agar (OMA) kweekmedium (2,5 g/L havervlokken en 7 g/L agar, pH 6).
   2. Ent in het midden van de petrischaal een fragment van kweekmedium (ca. 1 cm²) met mycelium van de gekozen geïsoleerde schimmel voor kiemprocedure. Sluit de petrischalen af met vershoudfolie en incubeer ze in het donker bij ongeveer 25 °C of kamertemperatuur, omdat het meer geschikt is voor schimmelgroei.
   3. Bereid sommige gerechten met zaden en zonder schimmelinenting, als een negatieve controle voor de kiemingstest.
6. Analyseer de kiemresultaten wekelijks, door kwantitatieve en kwalitatieve gegevens te verzamelen en protocormen en zaailingen te fotograferen. De observatie van zaden en protocormen moet worden uitgevoerd met behulp van een stereomicroscoop voor een nauwkeurigere beoordeling van de kieming. Gebruik een lichtbron die van onderaf komt, omdat dit een groter contrast mogelijk maakt, waardoor het mogelijk is om het schimmelmycelium gemakkelijker van protocormen te onderscheiden.
   1. Verzamel monsters in verschillende ontwikkelingsstadia en fixeer voor anatomische analyses (sectie 1). Pas alle eerder beschreven beeldanalyses toe om schimmel-endofyten in zaden, protocormen en zaailingen tijdens de kieming te onderzoeken (lichtmicroscopie - secties 4, 5 en 6; confocale en fluorescentie - sectie 7; SEM en TEM - secties 8 en 9).
   2. Kwantitatieve resultaten genereren volgens de classificatie van fasen volgens tabel 6. De stadia beschrijven de gebruikelijke ontwikkeling van zaden van mycoheterotrofe orchideeën. Verzamel wekelijks gegevens en tabel met de initiële datums van elke waargenomen fase.
   3. Verzamel daarnaast kwantitatieve gegevens die het kiempercentage en de kiemsnelheid schatten. Tel minstens 100 zaden of definieer telvelden³⁵. Baken drie of meer telvelden per petrischaal af, bestaande uit vaste gebieden met een gestandaardiseerd gebied, en evalueer wekelijks. Bereken de verzamelde gegevens volgens de groei-index (GI) vergelijking:
      
      waar N₀ het aantal getelde zaden in stadium 0 is, N₁ verwijst naar stadium 1 en volgt tot stadium 6 (geregistreerd als N₆)³⁶.

Figuur 3: Schematische samenvatting van symbiotische kieming van zaden methodologie. De schema's geven indicaties van gedetailleerde stappen in het protocol. Afkortingen: OMA = havermout agar, PDA = aardappel dextrose agar. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Kiemfase	Beschrijving
0	Geen kieming
1	Zwelling van het embryo
2	Testa breuk
3	Absorberende haren ontwikkelen zich
4	Stamprojectie ontwikkelt zich
5	Beschermende schubben (schutbladen) ontwikkelen zich
6	Eerste wortels ontwikkelen zich

Tabel 6: Beschrijving van protocorm ontwikkelingsstadia toegepast op periodieke analyses van kiemproeven. Gewijzigd uit stadia beschreven in Otero et ^al.36.

Resultaten

Het volgen van de essentiële stadia van het fixeren van plantenweefsel levert cellulaire structuren op die zo veel mogelijk lijken op de levende toestand, rekening houdend met de morfologie, het volume en de ruimtelijke organisatie van cellulaire componenten en weefsels¹⁶. Observeer dergelijke eigenschappen in de monsters na chemische fixatie (figuur 4). Figuur 4C-F vertegenwoordigt voldoende vaste monste...

Discussie

Beeldanalyses in de anatomie en morfologie van planten hebben een belangrijk potentieel om doelstellingen te bereiken en helpen de relaties tussen mycoheterotrofe planten en hun onmisbare schimmel-endofyten te begrijpen, zoals aangetoond door studies van ondergrondse organen ^6,40, structurele analyses van symbiotische kieming van zaden³⁹ en lucht- en voortplantingsstructuren⁴¹ . Structurele plantkunde, ondanks het f...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Aceton	Sigma-Aldrich	179124	(voor SEM-stubs montage)
Agar-agar (AA)	Sigma-Aldrich	A1296	(voor zaadkiemtests)
Calcofluor White Stain	Sigma-Aldrich	18909	fluorescente kleurstof (detecteert cellulose)
Citraatbufferoplossing, 0,09M pH 4,8	Sigma-Aldrich	C2488	(voor toluidine blauw O-kleuring)
Leidbare dubbelzijdige koolstoftape	Fisher Scientific	50-285-81	(voor SEM)
Confocale microscoop	Zeiss		(elk model)
Koperroosters	Sigma-Aldrich	G4776	(voor TEM)
Kritisch puntdroger	Balzers		(elk model)
Cryostat	Leica Biosystems		(elk model)
Dissectiemicroscoop	Leica Biosystems		(= stereomicroscoop, elk model)
Entellan	Sigma-Aldrich	107960	snel montagemedium voor microscopie
Ethylalcohol, zuiver (≥99,5%)	Sigma-Aldrich	459836	(= ethanol, voor dehydratatieproecessen)
Formaldehydeoplossing, 37%	Sigma-Aldrich	252549	(voor NBF-oplossingsvoorbereiding)
Formalineoplossing, neutraal gebufferd, 10%	Sigma-Aldrich	HT501128	histologisch weefselfixatief
Gelatinecapsules voor TEM	Fisher Scientific	50-248-71	(voor harspolymerisatie in TEM)
Gelatineoplossing, 2% in H2O	Sigma-Aldrich	G1393	(verdunnen voor de voorbereiding van dia's - OCT-hechting)
Glutaraldehydeoplossing, 25%	Sigma-Aldrich	G6257	(voor Karnovsky’s oplossingsvoorbereiding)
HistoResin	Leica Biosystems	14702231731	glycolmethacrylaat (GMA) inbeddingskit
Jodium	Sigma-Aldrich	207772	(voor Lugol-oplossingsvoorbereiding)
Lood(II)nitraat	Sigma-Aldrich	228621	Pb(NO3)2 (voor TEM-contrastkleuring)
Lichtmicroscoop	Olympus		(elk model)
LR White acrylhars	Sigma-Aldrich	L9774	hydrofiele acrylhars voor TEM
Lugol-oplossing	Sigma-Aldrich	62650	(voor kleuring)
Metalen stubs voor specimenmontages	Rave Scientific		(voor SEM, verschillende modellen)
Microtoom	Leica Biosystems		manuele roterende microtoom of ander model
Havermoutagar (OMA)	Millipore	O3506	(voor zaadkiemtests)
OCT-compound, Tissue-Tek	Sakura Finetek USA	4583	inbeddingsmedium voor bevroren weefsels
Osmiumtetraoxide	Sigma-Aldrich	201030	OsO4 (voor TEM-postfixatie)
Parafilm M	Sigma-Aldrich	P7793	afdichtingsthermoplastische film
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127	(voor Karnovsky’s oplossingsvoorbereiding)
Poly-L-lysineoplossing, 0,1% in H2O	Sigma-Aldrich	P8920	(voor de voorbereiding van dia's - OCT-hechting)
Poly-Prep dia's	Sigma-Aldrich	P0425	poly-L-lysine gecoate glazen dia's
Polyethyleen gietvormpjes	Polysciences	17177A-3	(6x8x5 mm, voor het inbedden van monsters in GMA-hars)
Polyethyleen gietvormpjes	Polysciences	17177C-3	(13x19x5 mm, voor het inbedden van monsters in GMA-hars)
Kaliumjodide	Sigma-Aldrich	221945	(voor Lugol-oplossingsvoorbereiding)
Aardappeldextroseagar (PDA)	Millipore	70139	(voor zaadkiemtests)
Rasterelektronenmicroscoop	Jeol		(elk model)
Silaam [ (3-aminopropyl)triethoxysilaan]	Sigma-Aldrich	A3648	(voor de voorbereiding van dia's - OCT-hechting)
Silaam-Prep dia's	Sigma-Aldrich	S4651	glasdia's gecoat met silaam
Silicagel oranje, korrelig	Supelco	10087	(voor dessicatieprocessen)
Natriumcacodylat trihydraat	Sigma-Aldrich	C0250	(voor glutaraldehyde-natriumcacodylatbuffer)
Natriumhydroxide	Sigma-Aldrich	S5881	NaOH (voor Karnovsky’s oplossingsvoorbereiding en TEM-contrastkleuring)
Natriumhypochlorietoplossing	Sigma-Aldrich	425044	NaClO (voor oppervlaktedesinfectie van zaden)
Dinatriumfosfaat dibasisch, watervrij	Sigma-Aldrich	71640	Na2HPO4 (voor NBF-oplossing en PB-voorbereiding)
Natriumfosfaat monobasisch monohydraat	Sigma-Aldrich	S9638	NaH2PO4·H2O (voor NBF en PB)
Sputtercoater	Balzers		(elk model)
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389	C12H22O11 (voor cryobescherming en kiemtest)
Sudan III	Sigma-Aldrich	S4131	(voor kleuring)
Sudan IV	Sigma-Aldrich	198102	(voor kleuring)
Sudan Black B	Sigma-Aldrich	199664	(voor kleuring)
Spuit			(3 mL, elk merk, voor TEM-contrastkleuring)
Spuitfiltereenheid, Millex-GV 0,22 &