Methodenartikel

Isolatie en kweek van mesenchymale stamcellen van het beenmerg uit de menselijke onderkaak

2.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/63811

⸱

13 april 2022

 ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Military Stomatology, National Clinical Research Center for Oral Diseases, Shaanxi Clinical Research Center for Oral Diseases, Department of Oral and Maxillofacial Surgery, School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, 2College of Life Sciences, Northwest University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Het huidige protocol beschrijft een efficiënte procedure voor het isoleren en kweken van mesenchymale stamcellen uit het menselijk mandibulaire beenmerg met behulp van de hele beenmergtherapietherapiemethode. De gekweekte cellen werden geïdentificeerd door middel van celproliferatietesten, flowcytometrie en inductie van multilineagedifferentiatie.

Samenvatting

Menselijke mesenchymale stamcellen (hMSC's) hebben een groot potentieel aangetoond bij botregeneratie, immuunmodulatie en de behandeling van refractaire chronische ziekten. Er zijn recentelijk verschillende oorsprongen gevonden om hMSC's te verkrijgen, terwijl beenmerg nog steeds als de belangrijkste bron werd beschouwd. Van beenmerg afgeleide MSC's (BMSC's) van verschillende donorbotplaatsen hebben verschillende kenmerken als gevolg van micro-omgevingsfactoren. Studies hebben aangetoond dat BMSC's van maxillofaciaal bot grotere proliferatieve en osteogene capaciteiten kunnen hebben dan BMSC's van lange botten of de darmbeenkam. En maxillofaciale BMSC's werden geschikter geacht voor stamceltherapie in de maxillofaciale weefsels. De onderkaak, vooral het opgaande ramalgebied met voldoende merg, was een haalbare donorplaats voor het oogsten van BMSC's. Deze studie beschreef een protocol voor het oogsten, isoleren en kweken van menselijke mandibulaire beenmerg-afgeleide MSC's (hmBMSC's). Verder werd immunofenotypering van hmBMSC's, proliferatietesten en in vitro inductie van osteogene, adipogene en chondrogene differentiatie uitgevoerd om de gekweekte cellen te identificeren. Het toepassen van dit protocol kan de onderzoekers helpen om met succes voldoende hmBMSC's van hoge kwaliteit te verkrijgen, wat nodig is voor verder onderzoek naar de biologische functie, micro-omgevingseffecten en klinische toepassingen.

Inleiding

Menselijke mesenchymale stamcellen (hMSC's) zijn multipotente cellen die kunnen worden gedifferentieerd in verschillende celtypen, zoals osteocyten, adipocyten en chondrocyten uit de mesodermale afstamming, hepatocyten en pancreocyten uit de endodermale afstamming en neurocyten uit de ectodermale afstamming1. hMSC's hebben dus een groot potentieel getoond bij weefselregeneratie. Bovendien zijn hMSC's krachtige immunomodulatoren die de micro-omgeving in de gastheerweefsels kunnen reguleren en chronische refractaire ziekten effectief kunnen behandelen2. Daarom zijn hMSC's veel gebruikt in celtherapie van klinische studies. Daarom is het belangrijk om op een gemakkelijke manier met succes voldoende hMSC's van hoge kwaliteit te verkrijgen.

Sinds hMSC's voor het eerst werden gerapporteerd in het beenmerg, zijn er veel alternatieve MSC-bronnen gevonden, zoals vetweefsel, synoviumvloeistof, skeletspieren, vruchtwater, baarmoederslijmvlies, tandweefsel en navelstreng 1,3. Beenmerg blijft echter de belangrijkste bron van hMSC's voor de meeste preklinische en klinische studies, en van beenmerg afgeleide MSC's (BMSC's) worden als standaard gebruikt voor het vergelijken van MSC's uit andere bronnen4. Al jaren zijn de darmbeenkam of lange botten (het scheenbeen en het dijbeen) de meest populaire anatomische locaties voor het verkrijgen van beenmerg 1,5. De bekkenkam of lange botten hebben echter een andere embryonale oorsprong en ontwikkelingspatronen in vergelijking met de maxillofaciale botten 5,6. Veel klinische, laboratorium- en ontwikkelingsstudies hebben aangetoond dat BMSC's van verschillende oorsprong plaatsspecifieke eigenschappen vertoonden, en de getransplanteerde BMSC's behouden de eigenschappen van de donorplaats na implantatie op de ontvangende plaats 5,6,7,8,9. Vanuit het perspectief van de ontwikkelingsoorsprong ontstaan de maxillofaciale weefsels, zoals de bovenkaak, onderkaak, dentine, alveolair bot, pulpa en parodontale ligament, uitsluitend uit neurale lijstcellen. Daarentegen worden de darmbeenkam en de lange botten gevormd door mesoderm. Bovendien worden onderkaken gemaakt door intramembraneuze ossificatie, terwijl axiale en appendiculaire skeletten endochondrale verbening ondergaan. Bovendien hebben sommige klinische studies, in vergelijking met de darmbeenkam en de lange botten, aangetoond dat maxillofaciale beenmerg-afgeleide hMSC's een betere cellulaire proliferatieve activiteit en differentiatievermogen hadden 6,8. Daarom wordt verwacht dat BMSC's uit de maxillofaciale gebieden een betere keuze zijn voor de regeneratie van maxillofaciaal weefsel en de behandeling van maxillofaciale chronische refractaire ziekten.

De onderkaak is samengesteld uit tweelaagse dikke corticale botten met poreus beenmerg ertussen, zodat het de kracht van het kauwen kan laden. Daarom wordt de onderkaak, met name het opgaande ramalgebied, meestal gebruikt als donorplaats om autologe bottransplantaten te verkrijgen bij craniomaxillofaciale operaties10. En bij operaties zoals mandibulaire sagittale gespleten ramus-osteotomie en mandibulaire hoekverkleiningsplastiek, moeten delen van de mandibulaire corticale en het poreuze bot worden verwijderd om een aangename gezichtscontour te krijgen. Die weggegooide massieve botten kunnen een potentiële hulpbron zijn voor hMSC's. Er zijn echter maar weinig gepubliceerde studies die het protocol beschrijven om snel te isoleren en hoogwaardige menselijke mandibulaire beenmerg-afgeleide MSC's (hmBMSC's) te kweken.

De huidige studie maakt gebruik van een gemodificeerde methode voor therapietrouw van het hele beenmerg om een betrouwbaar en reproduceerbaar protocol te introduceren voor de isolatie en kweek van hmBMSC's. En de stamcellen werden geïdentificeerd door middel van flowcytometrische immunofenotypering van MSC's, proliferatietesten en inductie van multilineagedifferentiatie. Het toepassen van deze standaardprocedure kan de onderzoekers helpen bij het verkrijgen van hoogwaardige MSC's uit menselijk mandibulaire beenmerg, wat belangrijk is bij verdere studies naar de biologische functie, micro-omgevingseffecten en klinische toepassingen.

Protocol

De procedure voor het oogsten van menselijke mandibulaire botmonsters werd goedgekeurd door de Ethische Commissie van de School of Stomatology, de Vierde Militaire Medische Universiteit. De studie volgde de ethische richtlijnen van de Verklaring van Helsinki uit 1975. Alle donoren voor deze studie werden geïnformeerd over de mogelijke risico's en de doelstellingen van de studie. De leeftijd van de donoren varieerde tussen 18-40 jaar en er waren geen gendervooroordelen. Van alle menselijke deelnemers werd schriftelijke toestemming verkregen.

1. Voorbereiding van de operatie

  1. Selecteer de juiste donateur.
    1. Selecteer de patiënten als donoren die van plan zijn operaties te ondergaan, zoals mandibulaire setback na sagittale gespleten ramusosteotomie en mandibulaire hoekverkleiningsplastiek.
  2. Bereid de conserveringsoplossing voor.
    1. Vul 30 ml fosfaatbufferzoutoplossing (1x PBS) aan met 1% penicilline en streptomycine in een steriele en enzymvrije centrifugebuis van 50 ml op de dag voor de operatie. Bewaar het in de koelkast bij 4 °C.
    2. Plaats op de dag van de operatie de centrifugebuis met conserveringsoplossing in een koelbox en bewaar deze 1 uur voor de operatie in de operatiekamer.
  3. Steriliseer de instrumenten om het beenmerg te isoleren op de dag voor de operatie, inclusief schaar, pincet en messen bij 120 °C en een druk van 0,27 MPa gedurende 20 minuten.
  4. Bereid α-MEM-kweekmedium voor door minimaal essentieel medium alfa (α-MEM) te mengen met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline en streptomycine.
  5. Bereid een osteogeen differentiatiemedium voor door α-MEM-kweekmedium te mengen met 50 mM ascorbinezuur, 10 mM β-glycerolfosfaat en 0,1 mM dexamethason (zie materiaaltabel).
  6. Bereid adipogeen differentiatiemedium A door α-MEM-kweekmedium te mengen met 1 mM dexamethason, 0,2 mM indomethacine, 10 μg/ml insuline en 0,5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) (zie materiaaltabel).
  7. Bereid adipogeen differentiatiemedium B voor door α-MEM-kweekmedium te mengen met 10 μg/ml insuline.
  8. Bereid chondrogene differentiatiemedium door Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium te mengen met hoge glucose (HG-DMEM) en 100 nM dexamethason, 100 g/ml natriumpyruvaat, 25 mg/ml vitamine C, 40 mg/ml proline, 10 ng/ml TGF-β3 en 1% ITS (zie materiaaltabel).
    OPMERKING: Het osteogene, adipogene en chondrogene differentiatiemedium kan in eigen huis worden bereid, zoals hierboven vermeld. In de huidige studie werden echter in de handel verkrijgbare kits hiervoor gebruikt (zie materiaaltabel).

2. Het oogsten van menselijk mandibulaire beenspecimen

  1. Bestudeer vóór de operatie zorgvuldig de driedimensionale geautomatiseerde tomografische scanbeelden en de chirurgische simulatieplanning van de donoren (Figuur 1).
  2. Selecteer de onderkaakplaats die de donor van plan is tijdens een operatie te verwijderen en die rijk is aan poreus bot met beenmerg als donorplaats.
  3. Desinfecteer en drapeer de patiënt voordat u hem opereert.
  4. Reseceer de geselecteerde donorplaats van de onderkaak met behulp van het ultrasone osteotoomblad (zie materiaaltabel), waarbij inferieure alveolaire zenuwbeschadiging en beschadiging van het donorbot worden vermeden.
  5. Plaats de onderkaakbotmonsters zo snel mogelijk in de conserveringsoplossing (stap 1.2).
  6. Plaats de conserveringsoplossing met botmonsters in een koelbox totdat de isolatie van MSC's in het laboratorium begint.
    OPMERKING: De isolatie van MSC's moet zo snel mogelijk na het oogsten worden gestart om de levensvatbaarheid van de cellen te behouden. Als de isolatie van MSC's niet onmiddellijk kan worden uitgevoerd, kan de conserveringsoplossing met botmonsters worden bewaard in een koelbox of maximaal 2 uur in de koelkast worden bewaard bij 4 °C.

3. Isolatie en cultivatie van menselijke mBMSC's

  1. Haal de botmonsters uit de conserveringsoplossing en dompel ze 5 minuten in 1x PBS met 1% penicilline en streptomycine op een schone bank van de laminaire flowkast.
    OPMERKING: Deze stap is bedoeld om het bloedstolsel en de resterende orale vloeistoffen weg te spoelen en het micro-organisme verder te elimineren omdat de mond geen volledig steriele omgeving is. Vóór celisolatie en teelt, handen wassen en desinfecteren met alcohol en steriele wegwerphandschoenen en -maskers dragen.
  2. Reinig het aanhangende zachte weefsel en de bloedvlek op het botoppervlak met behulp van steriel nat gaasje.
  3. Vul een steriel kweekschaaltje van 6 cm met 5 ml α-MEM kweekmedium.
  4. Leg het bot in de steriele kweekschaal en snijd het in kleine stukjes (bijna 2-3 mm3 volume) met een gesteriliseerd mes of schaar.
    OPMERKING: Houd de botmonsters vast met een pincet om te voorkomen dat u in uw vinger snijdt.
  5. Aspireer α-MEM kweekmedium in de kweekschaal met een steriele wegwerpspuit van 1 ml.
  6. Steek de spuitnaald met α-MEM-kweekmedium diep in de beenmergholte van de poreuze botmonsterstukken.
  7. Spoel het beenmerg met de spuit in de kweekschaal vanaf alle kanten van de stukjes botmonster, minstens 5-10 keer per kant.
  8. Herhaal stap 3.5-3.7 totdat alle stukjes botmonster zuiver wit worden om ervoor te zorgen dat zoveel mogelijk beenmerg in het kweekmedium wordt gespoeld.
    NOTITIE: De totale bedrijfstijd van de bovenstaande stappen van 3.1-3.8 moet binnen 30 minuten op ijs worden geregeld.
  9. Verwijder alle stukjes botmonster en gooi ze weg met een pincet. Verwijder andere kleine fragmenten met behulp van een celfilter met een poriegrootte van 70 μm.
  10. Schud de kweekschaal zachtjes om de gespoelde cellen gelijkmatig te verdelen.
  11. Plaats de kweekschaal in een celincubator en kweek de cellen bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2 .
  12. Controleer op de derde kweekdag de celmorfologie en groeistatus onder een lichtmicroscoop. Verwijder de helft van het kweekmedium zonder aanhangende cellen en weefselfragmenten; voeg 3 ml vers α-MEM kweekmedium toe.
  13. Verwijder op teeltdag 7 al het kweekmedium en voeg 5 ml vers α-MEM kweekmedium toe.
  14. Ververs vervolgens de α-MEM kweekmedium elke 3 dagen.
  15. Controleer elke dag de celmorfologie en groei.
    OPMERKING: Wanneer de primaire celculturen (P0) na 7-80 dagen cultuur 70%-10% samenvloeiing bereiken, voert u de celpassage uit.

4. Cel passage

  1. Verwijder bij 70%-80% samenvloeiing al het kweekmedium van P0-cellen. Was de kweekschaal twee keer voorzichtig met 1x PBS om het restmateriaal te reinigen.
  2. Voeg 1 ml 0,25% trypsine met 0,02% EDTA toe aan de kweekschaal om de cellen te verteren. Schud de kweekschaal zachtjes om ervoor te zorgen dat de trypsine gelijkmatig wordt verdeeld. Zet de kweekschaal 3 minuten op 37 °C.
  3. Controleer de cellen onder de microscoop. Wanneer 70%-80% van de cellen wordt samengetrokken en afgerond, voeg dan 2 ml α-MEM-kweekmedium toe om de spijsverteringsreactie te stoppen.
  4. Blaas voorzichtig meerdere keren met een pipet op het schaaloppervlak om de cellen naar beneden te blazen.
  5. Breng de celsuspensie over in een centrifugebuis van 15 ml. Centrifugeer de celsuspensie bij 200 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  6. Gooi het bovenstaande weg en breng de cellen opnieuw in suspensie met α-MEM-kweekmedium. Zaai P0-cellen in kweekkolven (25 cm) voor expansie met een splitsingsverhouding van 1:2. De eerste passagecellen werden P1-cellen genoemd.
  7. Wanneer de P1-cellen 70%-80% samenvloeiing bereiken, herhaalt u de celpassage volgens de stappen van 4.1-4.6. De cellen van de tweede generatie werden P2-cellen genoemd.
  8. Verander de expansiesplitsingsverhouding in 1:3 na de celpassage van de derde generatie.
  9. Gebruik P3- tot P5-cellen om identificatie-experimenten uit te voeren.

5. Cytometrische flowanalyse

  1. Verteer P3 tot P5 MSC's met 0,25% trypsine met 0,02% EDTA, volgens de stappen 4.1-4.5.
  2. Gooi het bovenstaande weg en suspendeer de cellen opnieuw in 1x PBS met een concentratie van 1 x 106 cellen/ml.
  3. Breng de cellen over in microcentrifugebuisjes met 100 μL celsuspensie per buisje.
  4. Voeg immunogelabelde monoklonale anti-menselijke antilichamen van muizen toe aan de microcentrifugebuisjes.
    OPMERKING: Voor de huidige studie werden fycoerythrine (PE)-geconjugeerd antilichaam tegen CD45, fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)-geconjugeerd antilichaam tegen CD90, CD34 en CD44 gebruikt 4,11 (zie materiaaltabel), en de verdunningen van de antilichamen waren allemaal 1:100. De verdunningen van antilichamen moeten de instructies van de fabrikant volgen. PBS wordt gediend als controle.
  5. Incubeer de antilichamen en PBS-controle bij kamertemperatuur in het donker gedurende 30 minuten.
  6. Centrifugeer de buisjes 5 minuten op 800 x g bij kamertemperatuur. Gooi de suspensie weg en suspendeer de cellen opnieuw in 0,5 ml 1x PBS. Herhaal deze stap twee keer.
  7. Laad de buisjes in de flowcytometer (zie materiaaltabel). Tel de fluorescentie-gelabelde celaantallen met behulp van een flowcytometer met een minimum van 10.000 gebeurtenissen.
    OPMERKING: Het is beter om het celtellingsproces van de flowcytometer onmiddellijk na de immunofluorescentie-etiketteringsprocedure te starten. Als dit niet het geval is, moeten de cellen worden gefixeerd in 1% paraformaldehyde, in het donker bij 4 °C worden bewaard en het proces binnen 24 uur worden voltooid.

6. Test op celproliferatie

  1. Gebruik P3-cellen om de celproliferatietest uit te voeren. Verwerk P3 MSC's met 0,25% trypsine, volgens de stappen 4.1-4.5.
  2. Gooi het bovenstaande weg en breng de cellen opnieuw in suspensie met α-MEM-kweekmedium.
  3. Tel het celaantal met een hemocytometer en zaai de cellen op kweekplaten met 96 putjes met een dichtheid van 3 x 103 cellen per putje, in totaal 35 putjes, 5 putjes voor elke teldag (op dag 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7). Ververs het kweekmedium van cellen elke 3 dagen.
  4. Gooi op elke teldag α-MEM-kweekmedium van de bepaalde vijf putjes voor de bepaalde teldag weg en voeg vervolgens 100 μl kweekmedium en 10 μl CCK-8-oplossing toe (zie tabel met materialen). Incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C.
  5. Plaats de kweekplaten in een microplaatspectrofotometer (zie Materiaaltabel) en meet de optische dichtheidswaarde van vijf putjes voor elke teldag (in totaal 7 teldagen) bij een golflengte van 450 nm. Gebruik vijf putjes van het kweekmedium zonder cellen als lege plekken.
  6. Noteer de optische dichtheidswaarde van elk putje, bereken de gemiddelde waarde en standaarddeviatie van vijf putjes voor elke teldag en zet de celgroeicurve 5,12 uit.

7. Differentiatie van meerdere lijnen

  1. Voer osteogene differentiatie-inductie uit volgens de onderstaande stappen.
    1. Verteer de P3-cellen met trypsine volgens de stappen 4.1-4.5. Zaai de cellen op 2 x 105 cellen/cm2 in een plaat met 6 putjes. Voeg 2,5 ml α-MEM kweekmedium per putje toe.
    2. Wanneer de cellen 60%-70% samenvloeiing bereiken, verandert u het kweekmedium in het osteogene inductiemedium (stap 1.5). Vervang vervolgens het inductiemedium elke 3 dagen.
    3. Controleer de cellen elke 3 dagen na inductie onder een microscoop. Observeer de celmorfologie en zoek naar voor de hand liggende mineralisatieknooppunten.
    4. Voer na 7 dagen inductie de alkalische fosfatase (ALP)-kleuring uit om de verkalking van cellen te evalueren.
    5. Gebruik 1x PBS om de cellen twee keer voorzichtig te wassen. Voeg 4% paraformaldehyde toe om de cellen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur te fixeren. Gebruik vervolgens 1x PBS om de cellen twee keer te wassen.
    6. Voeg ALP-kleuringsoplossing toe (zie Materiaaltabel) en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
      OPMERKING: Verschillende soorten ALP-kleuringsoplossing kunnen de cellen kleuren met verschillende kleuren, zoals donkergrijs, rood en blauw. In dit protocol werden de cellen blauw gekleurd. De incubatietijd kan worden verlengd als de kleurkleur niet duidelijk is. Sommige ALP-oplossingskleuringskits kunnen giftig zijn; Lees de gebruiksaanwijzing zorgvuldig door voor gebruik, draag handschoenen en een masker tijdens het experiment en was de handen zorgvuldig na gebruik.
    7. Was de cellen met water om de ALP-kleuringsreactie te stoppen. Bekijk blauw gepigmenteerde korrels in de cellen onder een lichtmicroscoop en maak de foto's. Gebruik de Image J-software om de kleuringsgraad kwantitatief te analyseren.
    8. Voer een rode kleuring van alizarine uit (zie Tabel met materialen) om de mineralisatiecapaciteit van de cellen te evalueren.
      OPMERKING: Voor de hand liggende vorming van mineralisatieknopen van de gedifferentieerde cellen is meestal te zien na 21 dagen inductie.
    9. Gebruik 1x PBS om de cellen twee keer voorzichtig te wassen. Voeg vervolgens 4% paraformaldehyde toe om de cellen gedurende 30 minuten op kamertemperatuur te fixeren.
    10. Was de cellen twee keer met 1x PBS, voeg 0,1% alizarine rode kleuringsoplossing toe (zie Tabel met materialen) en incubeer gedurende 20 min. Nogmaals, was de cellen twee keer met 1x PBS.
    11. Observeer de rode knobbeltjes tussen gefixeerde cellen onder een lichtmicroscoop, die calciumafzettingen van osteogene differentiatie van gekweekte cellen aangeven, en maak de foto's.
    12. Om de hoeveelheid alizarinerood te kwantificeren, voegt u 10% cetylpyridiniumchloride (CPC, zie materiaaltabel) toe aan de rood gekleurde cellen van alizarine en incubeert u gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
    13. Zuig 50 μl van de CPC-oplossing op en meet de optische dichtheid (OD) bij een golflengte van 540 nm met behulp van een microplaatspectrofotometer.
  2. Voer adipogene differentiatie-inductie uit.
    1. Zaai de P3-cellen in een plaat met 6 putjes met behulp van de hierboven beschreven procedure (stap 7.1).
    2. Wanneer de cellen 80%-90% samenvloeien, verandert u het kweekmedium in adipogeen differentiatiemedium A (stap 1.6).
    3. Incubeer de cellen met adipogeen differentiatiemedium A bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2 gedurende 3 dagen.
    4. Verander het inductiemedium in adipogeen differentiatiemedium B (stap 1.7) en incubeer gedurende 1 dag.
    5. Verander het medium terug naar adipogeen differentiatiemedium A en incubeer gedurende 3 dagen. Vervang vervolgens gedurende 1 dag door medium B. Herhaal deze cyclus 3-5 keer totdat lipidedruppels onder de microscoop te zien zijn.
      OPMERKING: De lipidedruppels zijn ongeveer 21 dagen na inductie te zien.
    6. Gebruik het adipogene differentiatiemedium B om de cellen nog 7 dagen te kweken; Vervolgens zijn grote en ronde lipidedruppels onder de microscoop te zien. Ververs het medium B elke 3 dagen.
    7. Verwijder het inductiemedium en gebruik 1x PBS om de cellen voorzichtig te wassen. Voeg vervolgens 4% paraformaldehyde toe om de cellen gedurende 10 minuten op kamertemperatuur te fixeren.
    8. Was de cellen twee keer met 1x PBS; incubeer de cellen vervolgens gedurende 15 minuten met olierode O-kleuringsoplossing (1 ml per putje, zie materiaaltabel). Nogmaals, was de cellen twee keer met 1x PBS.
    9. Plaats de cellen onder een microscoop en observeer de rode lipidedruppels om de adipogenese van gedifferentieerde cellen te evalueren.
  3. Voer chondrogene differentiatie-inductie uit.
    1. Verteer de P3-cellen en breng ze over in een centrifugebuis van 15 ml met een celnummer van 5 x 105.
    2. Centrifugeer de buis op 250 x g gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur. Gooi het bovenstaande weg door de bovenste oplossing voorzichtig te decanteren.
    3. Voeg 0,5 ml chondrogenisch differentiatiemedium (stap 1.8) toe aan de buis om de cellen opnieuw te suspenderen en centrifugeer de buis opnieuw op 150 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Herhaal deze stap twee keer.
    4. Draai de dop van de centrifugebuis los om de luchtverversing te vergemakkelijken. Plaats de buis in de incubator en induceer de cellen met 0,5 ml chondrogene differentiatiemedium bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2 .
    5. Houd de centrifugebuis stabiel zonder deze binnen 24 of 48 uur te verwijderen of te schudden, totdat de cellen beginnen te pilleren. Veeg tegen de bodem van de centrifugebuis om de celpellet in het differentiatiemedium te laten zweven (stap 1.5).
    6. Vernieuw het chondrogene differentiatiemedium elke 3 dagen met een pipet. Vermijd het wegzuigen van de celpellet.
    7. Induceer de cellen ten minste gedurende 21 dagen totdat de pellet aanspoort tot een diameter van 2 mm.
    8. Was de korrel met 1x PBS en fixeer deze gedurende 30 minuten met 4% paraformaldehyde. Na dehydratatie en paraffine-inbedding13, snijdt u de pellet met een dikte van 3 μm met behulp van een microtoom (zie materiaaltabel).
    9. Zet de secties op glasplaten. Kleur de objectglaasjes aan met Alcian blauwe oplossing (zie Materiaaltabel) gedurende 1 uur bij 37 °C. Was de bevlekte dia's met water. Plaats de objectglaasjes onder een lichtmicroscoop en maak foto's van het blauw gekleurde zure mucopolysaccharide, wat wijst op kraakbeenweefsels.

Resultaten

Een mandibulair botmonster werd met succes bij de patiënt verzameld. En de tijd van het snijden met het ultrasone osteotoommes tot het plaatsen van het botfragment in de centrifugebuis is ongeveer 5 minuten. Geen van de mogelijke complicaties trad op in en na de resectieprocedure, waaronder schade aan de inferieure alveolaire zenuw of tandwortel, infectie, vasculaire ruptuur en bloeding, slijmvliesletsel, accidentele botbreuk, enz. De hmBMSC's werden met succes gekweekt, gepasseerd en gedifferentieerd zonder besmetting.

In de huidige studie werden veel aangehangende cellen onder de microscoop gezien op de derde dag na de eerste kweek. Op de zevende dag waren de meeste aanhangende cellen al aan de kweekschaal gehecht. Normaal gesproken bereikten de gekweekte cellen 70%-80% samenvloeiing na 7-9 dagen na de eerste kweek. Na passage werd meestal gedacht dat de P3-cellen gezuiverde MSC's waren, die een spoelvormige, plastisch hechtende en fibroblastachtige morfologie vertoonden (Figuur 2). En de identificatie-experimenten werden uitgevoerd in P3- tot P5-cellen. Bij celproliferatietest nam de celgroeisnelheid snel toe vanaf de derde dag van de kweek en de verhoogde snelheid vertraagde op dag 6 (Figuur 2).

Volgens de definitie van de International Society for Cellular Therapy hebben MSC's een positieve en negatieve expressie van bepaalde oppervlaktemoleculen. In deze studie toonde de flowcytometrische analyse van kweekcellen een positieve expressie van CD44, CD90 en een negatieve expressie van CD45, CD34, wat consistent is met de definitie 4,11 (Figuur 3). In de experimenten met het differentiatievermogen van meerdere lijnen vertoonden de gekweekte cellen een sterk osteogene, adipogene en chondrogene differentiatievermogen. Na 7 dagen osteogene inductie kwam de extracellulaire matrix calciumafzetting onder de microscoop tevoorschijn. Na 21 dagen osteogene inductie vertoonden de gekweekte cellen duidelijke mineralisatieknopen en waren de knopen rood gekleurd met alizarinerode kleuring (Figuur 4). Voor adipogenese werden na 21 dagen adipogene inductie veel opgehoopte ronde lipidedruppeltjes gezien die rood gekleurd waren door olie-rood-O-kleuring in het cytoplasma (Figuur 4). Na 21 dagen van chondrogene differentiatie-inductie kunnen de dia's van de celpellets die kraakbeenachtig weefsel met kraakbeenlacune vertonen, blauw worden gekleurd (Figuur 4).

figure-results-1
Figuur 1: Selectie van de donorplaats op 3D CT-beeld. (A) 3D CT-beeld van de donoronderkaak van een 21-jarige vrouwelijke patiënt. (B) Chirurgische simulatie van de bilaterale sagittale gespleten ramus osteotomie van de onderkaak. (C) Chirurgische planning toont de terugslag van een gespleten onderkaak. (D) 3D CT-beeld van het corticale bot (het doorschijnende deel), het poreus bot dat rijk is aan beenmerg en de inferieure alveolaire zenuw (rood) op basis van verschillende CT-waarden, die de chirurgen kunnen helpen bij het selecteren van de donorplaats en het voorkomen van zenuwbeschadiging. Poreus bot chips werden geoogst uit de regio in de zwarte rechthoek. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Microscopische morfologie en groeicurve van P3 menselijke onderkaak-afgeleide beenmergstamcellen (hmBMSC's). (A-C) Spoelvormige, plastisch hechtende en fibroblastachtige morfologie van P3 hmBMSC's (schaalbalk = respectievelijk 200 μm, 100 μm, 50 μm voor A, B, C). (D) De celgroeicurve toonde aan dat de groeisnelheid van hmBMSC's snel toenam vanaf de derde dag van de kweek en de groeisnelheid vertraagde op de zesde dag van de kweek. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Antigeenexpressie op het celoppervlak op hmBMSC's werd gedetecteerd door middel van flowcytometrie. Flowcytometrie-analyse toonde aan dat hmBMSC's negatief waren voor CD45 (A) en CD44 (C), positief voor CD44 (B) en CD90 (D). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Osteogene, adipogene en chondrogene differentiatie van hmBMSC's. (A) ALP-kleuring van hmBMSC's na 7 dagen kweek zonder osteogene differentiatie-inductie (schaalbalk = 100 μm). (B) ALP-kleuring van hmBMSC's na 7 dagen osteogene differentiatie-inductie (schaalbalk = 100 μm). (C) Kwantitatieve resultaten van ALP die een positief gebied kleurt (***P < 0,001). (D) Alizarinerode kleuring van hmBMSC's zonder osteogene differentiatie (schaalbalk = 100 μm). (E) De vorming van duidelijke mineralisatieknopen kan worden gezien na 21 dagen osteogene differentiatie van hmBMSC's, en het kan rood worden gekleurd met alizarinerode kleuring (schaalbalk = 100 μm). (F) Kwantitatieve resultaten van alizarinerode kleuring (***P < 0,001). (G) Olierode O-kleuring van hmBMSC's zonder adipogene differentiatie (schaalbalk = 50 μm); (H) Ronde lipidedruppels werden gezien na 21 dagen adipogene differentiatie van hmBMSC's, en de lipidedruppels waren rood gekleurd met olierode O-kleuring (schaalbalk = 50 μm). (I) De kleuring van Alcianblauw was positief na 21 dagen chondrogene differentiatie-inductie (schaalbalk = 50 μm). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Onlangs is de hMSC-therapie veelbelovend gebleken bij weefselregeneratie en de behandeling van vele refractaire ziekten, zoals immuundisfunctieziekten, systemische hematologische aandoeningen, kankers of trauma, in tal van klinische onderzoeken 1,14,15,16,17. Van de verschillende bronnen van MSC's blijft beenmerg de meest gebruikte en gemakkelijk toegankelijke bron. We gebruikten menselijke mandibulaire porcellulaire botchips om BMSC's met succes te kweken met behulp van de hele beenmergtherapiemethode die in dit protocol wordt beschreven. Tot op heden zijn er vier hoofdbenaderingen om stamcellen uit het beenmerg te isoleren, waaronder de hele beenmergtherapietherapiemethode, de dichtheidsgradigingcentrifugatiemethode, de fluorescerende celsorteermethode en de magnetisch geactiveerde celsorteermethode10. De hele methode voor therapietrouw van het beenmerg is eenvoudig, gemakkelijk te bedienen, goedkoop en kan grote hoeveelheden aanhangende cellen krijgen. De beperking van deze methode was echter de lage zuiverheid van primair gekweekte BMSC's, die werden gemengd met hematopoëtische cellen en fibroblasten. Na het regelmatig verversen van het kweekmedium van primaire cellen, werden de niet-aanhangende hematopoëtische cellen samen met het afgedankte medium weggegooid. Ook kunnen de fibroblasten worden opgeruimd door celpassage en waren P3-cellen sterk gezuiverde BMSC's. P0 tot P2 cellen kunnen dus niet gebruikt worden voor celtherapie, wat betekent dat er extra tijd nodig was om de stamcellen te zuiveren. Met behulp van fluorescerende celsortering en magnetisch geactiveerde celsorteermethoden kan men meer gezuiverde BMSC's krijgen, terwijl de twee methoden duur zijn en een lange selectietijd de levensvatbaarheid van cellen kan aantasten11. Om te bewijzen dat de gekweekte cellen MSC's waren, verwezen we naar de definitie van menselijke MSC's voorgesteld door het Mesenchymale and Tissue Stem Cell Committee van de International Society for Cellular Therapy, die plastisch aanhangend karakter, positieve en negatieve expressie van bepaalde fenotypes, zoals CD45, CD90 enzovoort, en multilineagedifferentiatievermogenomvatte18.

In de meeste onderzoeken waren dijbenen en darmbeenderen de belangrijkste bronnen van BMSC's, vergeleken met maxillofaciale beenderen, zoals de onderkaak en de bovenkaak 9,16. De locatiespecifieke karakteristiektheorie van hBMSC's in recente studies toonde echter aan dat hBMSC's uit verschillende botten verschillende karakters hadden in differentiatievermogen, proliferatieve activiteit, osteogenese en immuniteit 6,8. Het locatiespecifieke verschil kan verband houden met verschillende embryologische oorsprongen, aanpassing aan functionele eisen op elke skeletlocatie, micro-omgeving, lokale vasculaire toevoer, hormonale effecten, enz. Bovendien toonden studies aan dat getransplanteerd darmbeen binnen 6 maanden na het bottransplantaat sneller verticaal verlies vertoonde dan het kaakbot8. Anders hebben studies aangetoond dat de proliferatieve activiteit van MSC's uit het mandibulaire merg superieur was aan die van het darmbeenmerg 5,8,19,20. En dit proliferatieve activiteitsverschil werd toegeschreven aan de kenmerken dat de onderkaak meer bloedtoevoer en een snellere botomzettingssnelheid had dan het darmbeen 5,6,8. Studies toonden ook aan dat BMSC's uit de onderkaak een hoger niveau van Runx-2 en OCN tot expressie brachten dan die van dijbenen, en het osteogene vermogen van BMSC's uit de onderkaak was gelijk aan of hoger dan die van dijbenen en darmbeen 5,19,21. De hechting aan het titaniumvermogen van hmBMSC's bleek ook sterker te zijn dan BMSC's uit dijbenen, wat suggereerde dat hmBMSC's geschikter waren voor gebruik in orale implantologie5. Bovendien bleek uit een 3 jaar durende klinische studie om het alveolaire defect te reconstrueren dat het geregenereerde bot van MSC's uit de tandpulp bestond uit een volledig compact bot met een hogere matrixdichtheid, terwijl de hm BMSC's sponsachtig bot regenereerden vergelijkbaar met normale menselijke alveolaire botstructuur22. Concluderend waren hmBMSC's ideale therapeutische stamcellen voor maxillofaciale regeneratie en andere ziekten vanwege dezelfde embryologische oorsprong en hun superieure eigenschappen.

De onderkaak heeft echter minder beenmerg dan dijbenen en darmbeen, dus het is belangrijk om voldoende beenmerg en BMSC's uit de onderkaak te halen voor klinisch gebruik. Menselijke darmbeenaspiraten kunnen grote hoeveelheden beenmerg verkrijgen om MSC's te isoleren. Onderzoekers gebruikten de mandibulaire aspiraten ook om MSC's te verkrijgen, terwijl de initiële opbrengst van de MSC's uit mandibulaire aspiraten drie keer lager was dan die van darmbeenaspiraten21. Er waren extra incisies nodig om voldoende beenmergaspiraties in de onderkaak te verzamelen, wat extra chirurgisch trauma toevoegde. Bovendien hebben studies aangetoond dat het proliferatieve potentieel van de MSC's uit onderkaakbotchips superieur kan zijn aan die van onderkaakmergaspiraten 8,21. Daarom werden in deze studie de afgedankte onderkaak poreuze botchips gebruikt om MSC's te isoleren. Omdat beide zijden van de onderkaak zijn opgenomen in sagittale gespleten ramusosteotomie of mandibulaire hoekverkleiningsplastiek, kunnen we zonder extra schade voldoende onderkaakmerg van de patiënten krijgen. Onlangs is computerondersteunde technologie op grote schaal gebruikt in orale en maxillofaciale chirurgie om het chirurgische effect te verbeteren en chirurgische complicaties te verminderen23. Om letsel aan de onderkaak en zenuw tijdens het oogsten van het beenmerg van de onderkaak te voorkomen, werd het 3D CT-beeld van de onderkaak van de donor verkregen en werd de chirurgische planning van de donoren geanalyseerd om de donorplaatsen te bepalen en om chirurgische simulatie in het onderzoek te implementeren; Geen van de chirurgische complicaties trad dus op. Het ultrasone osteotoommes, een weefselspecifiek apparaat waarmee chirurgen nauwkeurige osteotomieën kunnen maken en tegelijkertijd aangrenzend zacht weefsel24 kunnen beschermen, werd ook gebruikt om letsel aan zacht weefsel te voorkomen en de verkregen beenmergactiviteit te behouden.

Samenvattend beschreef deze studie een betrouwbaar, eenvoudig, veilig en goedkoop protocol om adequate menselijke mandibulaire MSC's te isoleren en te kweken, die kunnen worden gebruikt in celtherapieën van tand- en kaakfaciale weefsels.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De studie werd ondersteund door de National Natural Sciences Foundation of China (nr. 81903249) en het Natural Science Basic Research Program van de provincie Shaanxi (nr. 2019JQ-701, nr. 2022JZ-50).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
4% ParaformaldehydePlantChemMedPC-00005
Adipogenic differentiatiemediumOriCell, Cyagen BiosciencesHUXMX-90031
Alcian blauw oplossingOriCell, Cyagen BiosciencesALCB-10001
AlcoholMackline809056
Alizarine rood kleuringsoplossingSolarbioG1452
ALP kleuringsoplossingBeijing ComWin Biotech Co.,Ltd.CW0051S
AutoclaafALP Co., Ltd., JapanCL-40L
CCK-8 oplossingYeasen Biotech Co., Ltd.40203ES80
Celfilter (70 μm poriëngrootte)BD Biosciences352350
CelincubatorThermo Fisher Scientific41334177
CentrifugeEppendorf5805ZP761456
Centrifugebuis (50 mL, 15 mL)Sangon BiotechF600888-9001
CetylpyridiniumchlorideAladdinH108696
Chondrogenesis differentiatiemediumOriCell, Cyagen BiosciencesHUXMX-90041
Schone werktafel/Laminaire stroomkastBIOBASEBBS-DDS00030
Kweekschotel (6 cm)Thermo150462
Kweekkolven (25 cm)Thermo156367
Kweekplaten (96-put, 6-put)Corning-Costar352350
Sterile wegwerphandschoenen en -maskersSangon BiotechF516018-9001;F516038-9001
Sterile wegwerpspuit (1 mL)Shaanxi longkangxin Medical Instrument Co., Ltd1.00009E+11
Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium met hoge glucose (HG-DMEM)HycloneSH30022.01B
EDTASolarbioE8040-500g
Foetaal bovien serum (FBS)PlantChemMedPC-00001
Flow cytometerBeckman CoulterEPICS XL
Fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)-geconjugeerd muis monoklonaal anti-mens antilichaam tegen CD34Biolegend343503
Fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)-geconjugeerd muis monoklonaal anti-mens antilichaam tegen CD44Biolegend338804
Fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)-geconjugeerd muis monoklonaal anti-mens antilichaam tegen CD90Biolegend328108
HemocytometerKoraba30119480698
IJsboxSangon BiotechF615002-0001
Image J softwareNational Institute of Mental Health
LichtmicroscoopOLYMPUSIX71-2L20944
MicrocentrifugebuisjesSangon BiotechF601620-0010
MicroplaatspectrofotometerBioTek-EPOCH259091
MicrotoomFeica1003001
Mimics softwareMaterialise
Minimum essentieel medium alfa (α-MEM)HycloneSH30265.01
Oil red O kleuringsoplossingSolarbioG1261
Osteogene differentiatiemediumOriCell, Cyagen BiosciencesHUXMA-90021
Penicilline en streptomycinePlantChemMedPC-86115
Fosfaat bufferoplossing (PBS)PlantChemMedPC-00003
Phycoerythrine (PE)-geconjugeerd muis monoklonaal anti-mens antilichaam tegen CD45Biolegend304008
PipetSORFA320511
ProPlan CMF 3.0Materialise
Schaar, pincet en messenShanghai Jinzhong Surgical instrument Co., LtdZJA030,YAA110,J11010
Steriele natte gaasHENAN PIAOAN GROUP Co., Ltd
TrypsineGibco17075029
Ultrasonische osteotoomboogStryker Instruments5450-815-107

Referenties

  1. Ullah, I., Subbarao, R. B., Rho, G. J. Human mesenchymal stem cells - current trends and future prospective. Bioscience Reports. 35 (2), 1-8 (2015).
  2. Brown, C., et al. Mesenchymal stem cells: Cell therapy and regeneration potential. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 13 (9), 1738-1755 (2019).
  3. Trohatou, O., Maria, G. R. Mesenchymal stem/stromal cells in regenerative medicine: Past, present, and future. Cellular Reprogramming. 19 (4), 217-224 (2017).
  4. Heo, J. S., Choi, Y., Kim, H. S., Kim, H. O. Comparison of molecular profiles of human mesenchymal stem cells derived from bone marrow, umbilical cord blood, placenta and adipose tissue. International Journal of Molecular Medicine. 37 (1), 115-125 (2016).
  5. Li, C. J., Wang, F. F., Zhang, R., Qiao, P. Y., Liu, H. C. Comparison of proliferation and osteogenic differentiation potential of rat mandibular and femoral bone marrow mesenchymal stem cells in vitro. Stem Cells and Development. 29 (11), 728-736 (2020).
  6. Lloyd, B., et al. Similarities and differences between porcine mandibular and limb bone marrow mesenchymal stem cells. Archives of Oral Biology. 77 (5), 1-11 (2017).
  7. Yamaza, T., et al. Mouse mandible contains distinctive mesenchymal stem cells. Journal of Dental Research. 90 (3), 317-324 (2011).
  8. Akintoye, S. O., et al. Skeletal site-specific characterization of orofacial and iliac crest human bone marrow stromal cells in same individuals. Bone. 38 (6), 758-768 (2006).
  9. Mendi, A., Ulutürk, H., Ataç, M. S., Stem Yılmaz, D. cells for the oromaxillofacial area: Could they be a promising source for regeneration in dentistry. Advances in Experimental Medicine and Biology. 11 (44), 101-121 (2019).
  10. Hong, Y. Y., et al. Isolation and cultivation of mandibular bone marrow mesenchymal stem cells in rats. Journal of Visualized Experiments. (162), e61532(2020).
  11. Chu, D. T., et al. An update on the progress of isolation, culture, storage, and clinical application of human bone marrow mesenchymal stem/stromal cells. International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 708(2020).
  12. Yu, Y. J., et al. Activation of mesenchymal stem cells promotes new bone formation within dentigerous cyst. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 476(2020).
  13. Sadeghipour, A., Babaheidarian, P. Making formalin-fixed, paraffin embedded blocks. Methods in Molecular Biology. 1897, 253-268 (2019).
  14. Mathiasen, A. B., et al. marrow-derived mesenchymal stromal cell treatment in patients with ischaemic heart failure: final 4-year follow-up of the MSC-HF trial. European Journal of Heart Failure. 22 (5), 884-892 (2020).
  15. Maqsood, M., et al. Adult mesenchymal stem cells and their exosomes: Sources, characteristics, and application in regenerative medicine. Life Sciences. 01 (256), 118002(2020).
  16. Reinders, M. J., et al. Autologous bone marrow-derived mesenchymal stromal cell therapy with early tacrolimus withdrawal: The randomized prospective, single-center, open-label TRITON study. American Journal of Transplantation: Official Journal of the American Society of Transplantation and the American Society of Transplant Surgeons. 21 (9), 3055-3065 (2021).
  17. Shi, H. Y., et al. marrow-derived mesenchymal stem cells promote Helicobacter pylori-associated gastric cancer progression by secreting thrombospondin-2. Cell Proliferation. 54 (10), 13114(2021).
  18. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  19. Aghaloo, T. L., et al. Osteogenic potential of mandibular vs. long-bone marrow stromal cells. Journal of Dental Research. 89 (11), 1293-1298 (2010).
  20. Dong, W. J., et al. Phenotypic characterization of craniofacial bone marrow stromal cells: unique properties of enhanced osteogenesis, cell recruitment, autophagy, and apoptosis resistance. Cell and Tissue Research. 358 (1), 165-175 (2014).
  21. Lee, B. K., Choi, S. J., Mack, D., Oh, S. H. Isolation of mesenchymal stem cells from the mandibular marrow aspirates. Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology, and Endodontics. 112 (6), 86-93 (2011).
  22. Giuliani, A., et al. Three years after transplants in human mandibles, histological and in-line holotomography revealed that stem cells regenerated a compact rather than a spongy bone: biological and clinical implications. Stem Cells Translational Medicine. 2 (4), 316-324 (2013).
  23. Chen, Y. W., et al. Computer-assisted surgery in medical and dental applications. Expert Review of Medical Devices. 18 (7), 669-696 (2021).
  24. Gilles, R., Couvreur, T., Dammous, S. Ultrasonic orthognathic surgery: enhancements to established osteotomies. International Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 42 (8), 981-987 (2013).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Beenmerg MSC smandibulaire beenmergisolatie van stamcellenstamcelcultuurimmunofenotyperingosteogene differentiatieadipogene differentiatiechondrogene differentiatiemaxillofaciale stamcellen
Video binnenkort beschikbaar
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.