Hier bieden we een gedetailleerde procedure voor de productie, zuivering en kwantificering van high-titer recombinant Newcastle disease virus. Dit protocol levert consequent > 6 × 109 plaquevormende eenheden/ml op, wat virushoeveelheden oplevert die geschikt zijn voor in vivo dierstudies. Aanvullende kwaliteitscontroletests om de veiligheid in vivo te waarborgen, worden beschreven.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Productie van High-titer Recombinant Newcastle Disease Virus uit Allantoic Fluid
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Newcastle disease virus (NDV), ook bekend als aviaire orthoavulavirus serotype-1, is een negatief zintuig, enkelstrengs RNA-virus dat zowel als een oncolytisch virus als een viraal gevectord vaccin is ontwikkeld. NDV is een aantrekkelijk therapeutisch en profylactisch middel vanwege het gevestigde omgekeerde geneticasysteem, krachtige immunostimulerende eigenschappen en een uitstekend veiligheidsprofiel. Bij toediening als een oncolytisch virus of een viraal gevectoreerd vaccin, lokt NDV een robuuste antitumor- of antigeenspecifieke immuunrespons uit, waardoor zowel de aangeboren als de adaptieve armen van het immuunsysteem worden geactiveerd.
Gezien deze wenselijke kenmerken is NDV geëvalueerd in tal van klinische onderzoeken en is het een van de best bestudeerde oncolytische virussen. Momenteel zijn er twee geregistreerde klinische onderzoeken met NDV: een evaluatie van een recombinant NDV-gevectoreerd vaccin voor SARS-CoV-2 (NCT04871737), en een tweede evaluatie van een recombinant NDV dat codeert voor Interleukine-12 in combinatie met Durvalumab, een antiPD-L1-antilichaam (NCT04613492). Om verdere vooruitgang van deze veelbelovende virale vector mogelijk te maken, zijn vereenvoudigde methoden nodig voor het genereren van high-titer, in vivo-grade, recombinant NDV (rNDV).
Dit artikel beschrijft een gedetailleerde procedure voor het versterken van rNDV in gespecificeerde pathogeenvrije (SPF) embryonale kippeneieren en het zuiveren van rNDV uit allantoïsche vloeistof, met verbeteringen om verlies tijdens zuivering te verminderen. Ook inbegrepen zijn beschrijvingen van de aanbevolen kwaliteitscontroletests, die moeten worden uitgevoerd om het gebrek aan verontreinigingen en virusintegriteit te bevestigen. Over het algemeen maakt deze gedetailleerde procedure de synthese, zuivering en opslag van high-titer, in vivo-grade, recombinant, lentogeen en mesogene NDV mogelijk voor gebruik in preklinische studies.
Inleiding
Newcastle Disease Virus, ook bekend als Avian Orthoavulavirus-1, is een omhuld aviair paramyxovirus met het potentieel om zowel als een oncolytisch virus of een viraal gevectord vaccin 1,2,3,4,5,6,7 te worden gebruikt. Meest recent is NDV ontworpen om het spike-eiwit van SARS-CoV-2 tot expressie te brengen, gekarakteriseerd als een effectief intranasaal vaccin in muis- en hamsteruitdagingsmodellen 7,8,9<....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Al het werk met betrekking tot het gebruik van dieren werd goedgekeurd door de University of Guelph Animal Care Committee in overeenstemming met de Canadian Council on Animal Care. Alle werkzaamheden worden uitgevoerd in een BioSafety Level 2 (BSL2) laboratorium in Canada waar mesogene NDV een Risicogroep 2 Pathogeen is. Alle stappen die betrokken zijn bij de versterking en zuivering van NDV moeten worden uitgevoerd in een type IIA biologische veiligheidskast voor veiligheids- en steriliteitsdoeleinden.
1. Versterking van NDV met behulp van gespecificeerde pathogeenvrije embryonale kippeneieren
- Inenting van SPF-em....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Allantoïsche vloeistof oogsten
Omdat allantoïsche vloeistof wordt geoogst uit embryonale kippeneieren, moet het er helder en transparant uitzien. Als de vloeistof ondoorzichtig en geel lijkt, duidt dit op de aanwezigheid van verontreinigingen. Opname van deze allantoïsche vloeistof tijdens de zuivering zal het zuiveringsproces belemmeren, omdat de druk snel zal stijgen en 10 psi zal overschrijden, wat resulteert in het afschuiven van het virus en het verlies van infectieus virus. Allantoïsche vloeisto.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Virussen die in preklinisch onderzoek als therapeutisch middel worden gebruikt, moeten sterk worden gezuiverd om toxiciteit te voorkomen wanneer ze in vivo worden toegediend 15. Als onvoorziene agentia of verontreinigingen niet worden verwijderd, kan dit leiden tot ernstige bijwerkingen die het therapeutische effect van het virale middel tenietdoen28. Aangezien NDV wordt geproduceerd in embryonale kippeneieren, zijn er verschillende verontreinigende ei-eiwitten, zo.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.
Dankbetuigingen
J.G.E.Y was de ontvanger van een Ontario Veterinary College PhD Scholarship en een Ontario Graduate Scholarship. Dit werk werd gefinancierd door Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grants aan SKW (grant #304737) en LS (grant #401127).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 0.25% Trypsin | HyClone | SH30042.02 | |
| 1 mL Slip-Tip Syringe | BD | 309659 | |
| 10 mL Luer-Lok Syringe | BD | 302995 | |
| 10% Povidone Iodine Solution | LORIS | 109-08 | |
| 15 mL Conical Tubes | Thermo-Fisher | 14955240 | |
| 18G x 1 1/2 in Blunt Fill Needle | BD | 305180 | |
| 18G x 1 1/2 in Precision Glide Needle | BD | 305196 | |
| 25 G x 5/8 in Needle | BD | 305122 | |
| 2-Mercaptoethanol | Thermo-Fisher | 03446I-100 | |
| 30% Acrylamide/Bis Solution 37.5:1 | BioRad | 1610158 | |
| 4% Paraformaldehyde-PBS | Thermo-Fisher | J19943-K2 | |
| 5 mL Luer-Lok Syringe | BD | 309646 | |
| 96 Well Tissue Culture Plate - Flat Bottom | Greiner Bio One | 655180 | |
| Acetic Acid, Glacial | Thermo-Fisher | A38-212 | |
| Agarose | Froggabio | A87-500G | |
| Alexa-Fluor 488 Goat-Anti-Mouse | Invitrogen | A11001 | |
| Allegra X-14 Centrifuge | Beckman Coulter | B08861 | |
| Ammonium Persulfate | BioRad | 161-0700 | |
| Bleach (5%) | Thermo-Fisher | 36-102-0599 | |
| Broad, unserrated tipped forceps | Thermo-Fisher | 09-753-50 | |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | 114405-25G | |
| Centramate Cassette Holder | PALL | CM018V | |
| ChemiDoc XRS+ | BioRad | 1708265 | |
| CO2 Incubator | Thermo-Fisher | ||
| Coomassie Brilliant Blue R-259 | Thermo-Fisher | BP101-50 | |
| DF1 Cells | ATCC | CRL-12203 | |
| Diet Gel Recovery | ClearH2O, INC | 72-01-1062 | |
| Digital 1502 Sportsman Egg Incubator | Berry Hill | 1502W | |
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125-500G | |
| Egg Candler | Berry Hill | A46 | |
| Ethanol (70%) | Thermo-Fisher | BP82031GAL | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) solution, pH 8.0, 0.5 M in H2O | Thermo-Fisher | BP2482-500 | |
| Female Threaded Tee fittings, nylon, 1/8 in NPT(F) | Cole-Parmer | 06349-50 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 12483-020 | |
| Fine Point High Precision Forceps | Thermo-Fisher | 22-327379 | |
| Fluorescent Microscope | ZEISS AXIO | Niet nodig als er geen IFA wordt uitgevoerd of als NDV geen fluorescent eiwit codeert | |
| Freeze Dry System Freezone 4.5 | LABCONCO | ||
| GiBOX Gel Imager | Syngene | Beeldvorming van agarose gels | |
| Glycerol | Thermo-Fisher | G33-1 | |
| Glycine | Thermo-Fisher | BP381-5 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcriptase Kit | Thermo-Fisher | 4368814 | |
| High Glucose Dulbecco's Modified Essential Medium | Cytiva | SH30022.01 | |
| Humidity Kit | Berry Hill | 3030 | |
| Iodixanol | Sigma-Aldrich | D1556 | 60% (w/v) oplossing van iodixanol in water (steriele) |
| L-Lysine Monohydrochloride | Sigma-Aldrich | 62929-100G-F | |
| Male and Female Luer-Lok a 1/8 in national pipe thread, NPT | Cole-Parmer | 41507-44 | |
| Masterflex L/S Digital Drive | Cole-Parmer | RK-07522-20 | Peristaltische pomp met digitaal display |
| Masterflex L/S Easy Load Pump Head for Precision Tubing | Cole-Parmer | RK-07514-10 | |
| Masterflex Silicon tubing (Platinum) L/S 16 | Cole-Parmer | 96420-16 | BioPharm Platinum-Cured Silicone |
| MC Pro 5 Thermocycler | Eppendorf | EP950040025 | |
| Methanol | Thermo-Fisher | A412-4 | |
| Mini Protean Tetra Cell | BioRad | 1658000EDU | SDS-PAGE cast en draaiende apparaat |
| Mouse-Anti-NDV | Novus Biologicals | NBP2-11633 | Clone 6H12 |
| Normal Goat Serum | Abcam | AB7481 | |
| NP-40 | Thermo-Fisher | 85124 | |
| Omega Membrane LV Centramate Cassette, 100K | PALL | OS100T02 | |
| Optima XE-90 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| OWL Easycast B1A Mini Gel Electrophoresis System | Thermo-Fisher | B1A | |
| PBS 10X Solution | Thermo-Fisher | BP399-20 | |
| Poly(Ethylene Glycol) Average Mn 20,000 | Sigma-Aldrich | 81300-1KG | |
| PowePac 300 | BioRad | Model 1655050 - voor agarose gel elektroforese | |
| Q5 High Fidelity 2X Master Mix | New England Biolabs | M0492S | |
| QIA Amp Viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52904 | |
| RedSafe | Thermo-Fisher | 50999562 | |
| Slide-a-lyzer Dialysis Cassette (Extra Strength), 10,000 MWCO 0.5-3 mL | Thermo-Fisher | 66380 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Thermo-Fisher | BP166-500 | |
| Sodium Hydroxide (Pellets) | Thermo-Fisher | S318-10 | |
| Specific pathogen free |
Referenties
- Kim, S. H., Samal, S. K. Newcastle disease virus as a vaccine vector for development of human and veterinary vaccines. Viruses. 8 (7), (2016).
- Kortekaas, J., et al. Rift Valley fever virus immunity provided by a paramyxovirus vaccine vector. V....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
