Dynamische lichtverstrooiingsanalyse voor de bepaling van de deeltjesgrootte van ijzer-koolhydraatcomplexen

Samenvatting

Dynamische lichtverstrooiing (DLS) is naar voren gekomen als een geschikte test voor het evalueren van de deeltjesgrootte en verdeling van intraveneus toegediende ijzer-koolhydraatcomplexen. De protocollen missen echter standaardisatie en moeten worden aangepast voor elk geanalyseerd ijzer-koolhydraatcomplex. Dit protocol beschrijft de toepassing en speciale overwegingen voor de analyse van ijzersucrose.

Samenvatting

Intraveneus toegediende ijzer-koolhydraat nanodeeltjescomplexen worden veel gebruikt om ijzertekort te behandelen. Deze klasse omvat verschillende structureel heterogene nanodeeltjescomplexen, die een variërende gevoeligheid vertonen voor de omstandigheden die vereist zijn voor de beschikbare methoden om deze agentia fysisch-chemisch te karakteriseren. Momenteel zijn de kritische kwaliteitskenmerken van ijzer-koolhydraatcomplexen nog niet volledig vastgesteld. Dynamische lichtverstrooiing (DLS) is naar voren gekomen als een fundamentele methode om de intacte deeltjesgrootte en -verdeling te bepalen. Er zijn echter nog steeds uitdagingen met betrekking tot de standaardisatie van methodologieën in laboratoria, specifieke aanpassingen die nodig zijn voor individuele ijzer-koolhydraatproducten en hoe de grootteverdeling het best kan worden beschreven. Belangrijk is dat de gebruikte verdunningsmiddelen en seriële verdunningen moeten worden gestandaardiseerd. De grote variatie in benaderingen voor monstervoorbereiding en gegevensrapportage beperkt het gebruik van DLS voor de vergelijking van ijzer-koolhydraatmiddelen. Hierin beschrijven we een robuust en gemakkelijk reproduceerbaar protocol om de grootte en grootteverdeling van het ijzer-koolhydraatcomplex, ijzersucrose, te meten met behulp van de Z-gemiddelde en polydispersiteitsindex.

Inleiding

IJzersucrose (IS) is een colloïdale oplossing bestaande uit nanodeeltjes bestaande uit een complex van een polynucleaire ijzer-oxyhydroxide kern en sucrose. IS wordt op grote schaal gebruikt om ijzertekort te behandelen bij patiënten met een breed scala aan onderliggende ziektetoestanden die orale ijzersuppletie niet verdragen of voor wie oraal ijzer niet effectief is¹. IS behoort tot de geneesmiddelenklasse van complexe geneesmiddelen zoals gedefinieerd door de Food and Drug Administration (FDA), een klasse van geneesmiddelen met een complexe chemie die evenredig is met biologicals². De regelgevende evaluatie van complexe geneesmiddelen kan aanvullende orthogonale fysisch-chemische methoden en/of preklinische of klinische studies vereisen om follow-on complexe geneesmiddelen nauwkeurig te vergelijken ^3,4. Dit is belangrijk omdat verschillende studies hebben gemeld dat het gebruik van IS versus een vervolgproduct van IS niet dezelfde klinische resultaten oplevert. Dit onderstreept het belang van het gebruik van nieuwe en orthogonale karakteriseringstechnieken die geschikt zijn voor het detecteren van verschillen in de fysisch-chemische eigenschappen tussen IS-producten ^5,6.

De nauwkeurige opheldering van de grootte en grootteverdeling van IS is van klinisch belang, omdat deeltjesgrootte een belangrijke invloedrijke factor is in de snelheid en omvang van opsonisatie - de eerste kritieke stap in de biodistributie van deze complexe geneesmiddelen ^7,8. Zelfs kleine variaties in de deeltjesgrootte en deeltjesgrootteverdeling zijn gerelateerd aan veranderingen in het farmacokinetische profiel van ijzeroxide nanodeeltjescomplexen ^9,10. Een recente studie van Brandis et al. toonde aan dat de deeltjesgrootte gemeten door DLS significant verschilde (14,9 nm ± 0,1 nm versus 10,1 nm ± 0,1 nm, p < 0,001) bij het vergelijken van een referentiegeneesmiddel en een generiek natriumijzergluconaatproduct, respectievelijk¹¹. De consistente batch-to-batch kwaliteit, veiligheid en werkzaamheid van ijzer-koolhydraatproducten zijn volledig afhankelijk van de opschaling van het productieproces en potentiële productiedrift moet zorgvuldig worden overwogen⁹. Het productieproces kan resulteren in resterende sucrose, en dit zal variëren op basis van de fabrikant¹². Eventuele wijzigingen in de variabelen van het productieproces kunnen leiden tot significante veranderingen in het uiteindelijke complexe geneesmiddel met betrekking tot de structuur, complexe stabiliteit en in vivo dispositie⁹.

Om de consistentie van geneesmiddelen te beoordelen en het in vivo gedrag van het geneesmiddel te voorspellen, zijn hedendaagse orthogonale analytische methodologieën vereist om de fysisch-chemische eigenschappen van complexe nanogeneesmiddelen te bepalen. Er is echter een gebrek aan standaardisatie van methodologieën, wat kan resulteren in een hoge mate van interlaboratoriumvariatie in resultaatrapportage¹³. Ondanks de erkenning van deze uitdagingen door de mondiale regelgevende instanties en de wetenschappelijke gemeenschap¹⁴, blijven de meeste fysisch-chemische kenmerken van IS slecht gedefinieerd en is de volledige aanvulling van kritieke kwaliteitskenmerken in de context van beschikbare regelgevingsrichtsnoeren niet gedefinieerd¹⁵. De concept-productspecifieke richtlijnen van de FDA voor ijzer-koolhydraatcomplexen suggereren DLS als een procedure om de grootte- en grootteverdeling van opvolgproducten te evalueren^16,17.

Verschillende publicaties hebben gedetailleerde DLS-protocollen om IS-nanodeeltjesafmetingen^13,18 te bepalen. Omdat de parameters voor monstervoorbereiding, procedureomstandigheden, instrumentatie en instrumentatie-instelling echter verschillen tussen de gepubliceerde methoden, kunnen de DLS-resultaten niet rechtstreeks worden vergeleken bij gebrek aan een gestandaardiseerde methode om de resultaten te interpreteren^13,18. De diversiteit in methodologieën en benaderingen voor gegevensrapportage beperkt de passende evaluatie van deze kenmerken voor vergelijkende doeleinden¹⁹. Belangrijk is dat veel van de DLS-protocollen die eerder zijn gepubliceerd om IS te evalueren, geen rekening houden met het effect van de diffusie van sucrose in de suspensie als gevolg van de aanwezigheid van vrije sucrose, waarvan is aangetoond dat het de Z-gemiddelde berekende hydrodynamische stralen van de nanodeeltjes in colloïdale oplossingen ten onrechte verhoogt^13,18. Het huidige protocol heeft tot doel de methodologie voor het meten van de deeltjesgrootte en -verdeling van IS te standaardiseren. De methode is hiervoor ontwikkeld en gevalideerd.

Protocol

1. Bediening van de machine

1. Opstarten van de machine en software
   OPMERKING: Aanvullende figuur S1A-D beschrijft de stappen voor het opstarten van de machine en software.
   1. Schakel het instrument ten minste 30 minuten voordat u de metingen start in en start vervolgens de pc.
   2. Dubbelklik op het pictogram van de instrumentsoftware om het programma te starten.
   3. Voer de gebruikersnaam en het wachtwoord in het inlogvenster in. Zorg ervoor dat elke gebruiker een eigen account heeft.
   4. Wacht tot alle drie de zwarte balken in de rechterbenedenhoek groen oplichten, wat aangeeft dat het apparaat klaar is voor gebruik.
   5. In het geval van lange perioden van inactiviteit, wanneer de gebruiker automatisch is uitgelogd, klikt u onder Beveiliging op Inloggen en voert u het wachtwoord opnieuw in.
2. Een meetbestand maken
   OPMERKING: Aan het begin van elke meetdag wordt een nieuw meetbestand gemaakt. Alle metingen worden vermeld en opgeslagen in het meetbestand. Voor meer informatie over deze procedure, zie aanvullende figuur S2A-B.
   1. Maak een nieuw meetbestand door te klikken op Bestand | Nieuw | Meetbestand. Selecteer in het geopende venster de opslaglocatie en geef het meetbestand een naam . Bevestig de details door op Opslaan te klikken.
   2. Om een bestand te openen, klikt u op Bestand | Openen | Meetbestand. Selecteer het meetbestand in het geopende venster, bevestig de details door op Openen te klikken, selecteer de bestandsnaam en klik op Opslaan.
3. De resultaten afdrukken
   1. Druk de resultaten van de systeemgeschiktheidstest (SST) (zie stap 1.5) en de gemiddelde waarde van de monstermeting af of sla deze op volgens aanvullende figuur S3.
   2. Markeer de meting(en) in de recordweergave van het meetbestand.
   3. Klik met de rechtermuisknop op Batch afdrukken en wacht tot er weer een klein venster wordt geopend.
   4. Selecteer het PSD-intensiteitsrapport uit de keuzes en bevestig het door op OK te klikken.
4. Algemene procedure om een meting te starten
   OPMERKING: De procedure voor het starten van een meting wordt beschreven in aanvullende figuur S4A-D. Volg het onderstaande pad voor het vereiste eenheidsparameterbestand (aangeduid als SOP):
   1. Selecteer de vereiste SOP in de vervolgkeuzelijst. Aangezien de meest recent gebruikte SOP's in de lijst worden weergegeven, selecteert u, als een oudere SOP nodig is, Bladeren naar SOP, en bevestigt u door op de groene pijl te klikken. Zodra de opslaglocatie van de SOP's wordt geopend, gaat u verder met stap 1.4.2.
      OPMERKING: Voor details over de belangrijke systeemparameters die specifiek zijn voor ijzerscharose (bijvoorbeeld de evenwichtstijd van een verzwakker), zie tabel 1.
   2. Maak in het geopende venster de vereiste vermeldingen onder Voorbeeldnaam en Notities. Bevestig door op OK te klikken en wacht tot het meetvenster automatisch wordt geopend.
   3. Start de meting door op de groene startknop te klikken.
   4. Zodra aan het einde van de meting een akoestisch signaal klinkt, sluit u het meetvenster .
5. Meting van de systeemgeschiktheidstest (SST)
   OPMERKING: Raak het onderste deel van de cuvette (meetzone) niet aan. Meet aan het begin en aan het einde van de reeks de deeltjesstandaard van 20 nm.
   1. Vul ~ 1 ml van de onverdunde deeltjesstandaard in een polystyreencuvet en sluit af met het deksel.
      OPMERKING: De verdunde standaard bereid in stap 1.5.1 kan gedurende 1 maand worden gebruikt.
   2. Sluit na het vullen de cuvette en controleer op luchtbellen. Verwijder luchtbellen door lichtjes op de cuvette te tikken.
   3. Plaats de cuvette in de celhouder van het instrument met de pijlmarkering naar voren gericht en sluit het deksel van de meetkamer.
   4. Laad de eenheidsparameter SOP en voer de volgende gegevens in het startvenster in:
      Voorbeeld naam: SST 20 nm deeltjesstandaard
      Voeg vervolgens een opmerking toe: identificatienummer en vervaldatum van de standaard
   5. Start de meting.
   6. Na het einde van de meting, wanneer het akoestische signaal klinkt, sluit u het meetvenster.
   7. Druk het verslag af (zie punt 1.1.3).
      OPMERKING: De SST wordt doorgegeven als de deeltjesgrootte Z-gemiddelde overeenkomt met de waarde van het analysecertificaat ± 10%.
6. Meting van de ijzersucroseoplossing
   1. Pipetteer 0,5 ml van een IS-oplossing met een ijzergehalte van 2% m/V in een maatkolf van 25 ml en vul tot de streep met water met weinig deeltjes (bv. vers gedeïoniseerd en gefilterd [poriegrootte 0,2 μm]); deze oplossing bevat 0,4 mg Fe/ml.
      OPMERKING: De monstervoorbereiding in stap 1.6.1. Met deze specifieke verdunning werd tijdens de methodeontwikkeling vastgesteld en dit werd bepaald als de optimale verdunning voor dit doel.
   2. Voor de voorafgaande reiniging vult u de polystyreencuvette ongeveer 3/4 vol met de bereide meetoplossing, draait u voorzichtig rond en leegt u deze vervolgens zo volledig mogelijk.
      OPMERKING: Raak het onderste deel van de cuvette (meetzone) niet aan en vermijd luchtbellen door de cuvette niet te schudden.
   3. Pipetteer voor de meting 1 ml van de meetoplossing in de cuvette en doe er een deksel op.
   4. Controleer de meetoplossing in de cuvette op luchtbellen. Als er luchtbellen zijn, verwijder deze dan door lichtjes op de cuvette te tikken.
7. De meting uitvoeren
   1. Plaats de plastic cuvette met de meetoplossing in het apparaat met de pijlmarkering naar voren gericht en sluit het deksel.
   2. Laad de parameter SOP (zie stap 1.4.1) en voer de volgende gegevens in het startvenster in:
      Voorbeeldnaam: Batchnummer
   3. Start de meting.
   4. Na het einde van de meting, wanneer het akoestische signaal klinkt, sluit u het meetvenster .
   5. Bereken de gemiddelde waarde van de zes afzonderlijke metingen volgens aanvullende figuur S5. Markeer de afzonderlijke metingen in de recordweergave van het metingsbestand, klik met de rechtermuisknop op Gemiddeld resultaat maken, voeg de naam van de gemiddelde waarde toe onder Voorbeeldnaam en bevestig door op OK te klikken.
   6. Wacht tot de software een nieuwe record aan het einde van de lijst heeft gemaakt en zoek naar de ingevoerde naam en het gemiddelde resultaat in die record.
   7. Druk het rapport af (zie stap 1.1.3).

Resultaten

De beschreven methode werd gevalideerd volgens ICH Q2(R1)²⁰, waarbij testoplossingen onder wisselende omstandigheden werden gemeten. De precisie was slechts 0,5% RSD voor de Z-gemiddelde grootte, terwijl een maximum van 3,5% RSD werd berekend voor de PDI. De gemiddelde resultaten van verschillende analisten en dagen verschilden slechts met 0,4% voor de Z-gemiddelde grootte en 1,5% voor de PDI. De statistieken werden berekend op basis van 12 metingen uitgevoerd door twee analisten op verschillende ...

Discussie

DLS is een fundamentele test geworden voor het bepalen van de grootte en grootteverdeling van nanodeeltjes voor toepassingen in de ontwikkeling van geneesmiddelen en de evaluatie van regelgeving. Ondanks de vooruitgang in DLS-technieken bestaan er nog steeds methodologische uitdagingen met betrekking tot de selectie van verdunningsmiddelen en monstervoorbereiding, die vooral relevant zijn voor ijzer-koolhydraatcomplexen in colloïdale oplossingen. Belangrijk is dat DLS-methoden voor ijzer-koolhydraat nanogeneesmiddelen no...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Equipment
Zetasizer Nano ZS	Malvern	NA	uitgerust met Zetasizer software 7.12, Helium Neon laser (633 nm, max. 4 mW) en 173° backscattering geometrie
Materials
Disposable plastic cuvettes
LLG-Disposable plastic cells	LLG labware	LLG-Küvetten, Makro, PS; Bestelnummer 9.406011
low-particle water			(Het gebruik van vers gedeïoniseerd en gefilterd (poriegrootte 0.2 μm) water wordt aanbevolen).
Microlitre pipette
Venofer 100 mg/5 mL	Vifor Pharma
Volumetric flask 25 mL
Nanosphere	Thermo	3020A	Particle Standard
Software
Origin Pro v.8.5	Origin Lab Corporation