Methodenartikel

Single-Molecule Analyse van Sf9 Purified Superprocessive Kinesin-3 Family Motoren

DOI:

10.3791/63837

⸱

27 juli 2022

 ,  ,  , 
1Discipline of Biological Engineering, Indian Institute of Technology Gandhinagar, 2Department of Biotechnology and Bioinformatics, Sambalpur University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie beschrijft de zuivering van KIF1A (1-393LZ), een lid van de kinesine-3-familie, met behulp van het Sf9-baculovirusexpressiesysteem. In vitro single-molecule en multi-motor zweefanalyse van deze gezuiverde motoren vertoonde robuuste motiliteitseigenschappen vergelijkbaar met motoren van zoogdiercellysaat. Sf9-baculovirussysteem is dus vatbaar voor expressie en zuivering van motoreiwit van belang.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een complexe cellulaire omgeving vormt een uitdaging voor de analyse van de beweeglijkheid van één molecuul. De vooruitgang in beeldvormingstechnieken heeft echter studies met één molecuul verbeterd en is enorm populair geworden bij het detecteren en begrijpen van het dynamische gedrag van fluorescerende moleculen. Hier beschrijven we een gedetailleerde methode voor in vitro single-molecule studies van kinesine-3 familie motoren met behulp van Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopie. Kinesine-3 is een grote familie die een cruciale rol speelt in cellulaire en fysiologische functies, variërend van intracellulair vrachttransport tot celdeling tot ontwikkeling. We hebben eerder aangetoond dat constitutief actieve dimerische kinesine-3-motoren een snelle en superprocessieve motiliteit vertonen met een hoge microtubule-affiniteit op het niveau van één molecuul met behulp van cellysaten die worden bereid door motor in zoogdiercellen tot expressie te brengen. Ons laboratorium bestudeert kinesine-3-motoren en hun regulerende mechanismen met behulp van cellulaire, biochemische en biofysische benaderingen, en dergelijke studies vereisen gezuiverde eiwitten op grote schaal. Expressie en zuivering van deze motoren met behulp van zoogdiercellen zou duur en tijdrovend zijn, terwijl expressie in een prokaryote expressiesysteem resulteerde in significant geaggregeerd en inactief eiwit. Om de beperkingen van bacteriële zuiveringssystemen en zoogdiercellysaat te overwinnen, hebben we een robuust Sf9-baculovirusexpressiesysteem opgezet om deze motoren tot expressie te brengen en te zuiveren. De kinesine-3 motoren zijn C-terminal gelabeld met 3-tandem fluorescerende eiwitten (3xmCitirine of 3xmCit) die zorgen voor verbeterde signalen en verminderde fotobleaching. In vitro single-molecule en multi-motor gliding analyse van Sf9 gezuiverde eiwitten tonen aan dat kinesine-3 motoren snel en superprocessief zijn, vergelijkbaar met onze eerdere studies met behulp van zoogdiercellysaten. Andere toepassingen die deze assays gebruiken, omvatten gedetailleerde kennis van oligomeercondities van motoren, specifieke bindingspartners die parallel lopen met biochemische studies en hun kinetische toestand.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een immens drukke celomgeving brengt veel uitdagingen met zich mee bij het sorteren van voorbestemde eiwitten en moleculen. Deze intense werklast van organisatie en spatiotemporale verdeling van moleculen in het cytoplasma wordt vergemakkelijkt door moleculaire motoren en cytoskeletale sporen. Moleculaire motoren zijn de enzymen die de energievaluta's zoals ATP hydrolyseren en die energie gebruiken tijdens beweging en krachtgeneratie1. Op basis van de aminozuursequentieovereenkomst worden kinesines gegroepeerd in 14 families en ondanks deze gelijkenis draagt elke motor uniek bij aan het functioneren van een cel. Kinesine-3-familiemotoren vormen een van de grootste, bestaande uit vijf subfamilies (KIF1, KIF13, KIF14, KIF16 en KIF28)2, geassocieerd met diverse cellulaire en fysiologische functies, waaronder blaasjestransport, signalering, mitose, nucleaire migratie en ontwikkeling 3,4,5. Stoornissen in kinesine-3 transportfunctie impliceren in veel neurodegeneratieve aandoeningen, ontwikkelingsstoornissen en kankerziekten 6,7,8,9.

Recent werk heeft aangetoond dat kinesine-3-motoren monomeren zijn, maar door lading geïnduceerde dimerisatie ondergaan en resulteren in een snelle en superprocessieve beweeglijkheid in vergelijking met conventionele kinesine 10,11,12,13. Hun biochemische en biofysische karakterisering heeft een grote hoeveelheid gezuiverde, actieve eiwitten nodig. Hun productie in het prokaryote expressiesysteem resulteerde echter in inactieve of geaggregeerde motoren, vermoedelijk als gevolg van incompatibele eiwitsynthese-, vouw- en modificatiemachines 14,15,16,17,18. Om dergelijke beperkingen te omzeilen en de opbrengst te verhogen, hebben we hier een robuust Sf9-baculovirusexpressiesysteem opgezet om deze motoren tot expressie te brengen en te zuiveren.

Het baculovirusexpressiesysteem gebruikt Sf9-insectencellijnen als gastheersysteem voor high-throughput eukaryote recombinante eiwitexpressie19,20. Baculovirus bezit een sterke polyhedrinepromotor die helpt bij heterologe genexpressie en de productie van oplosbare recombinante eiwitten17. Vanwege de kosteneffectiviteit, veilig te hanteren en de hoge hoeveelheid actieve eiwitexpressie, is het een krachtig hulpmiddel geworden21. Om een eiwit van belang uit te drukken, is een belangrijke stap het genereren van een recombinant bacmide. Omdat de commercieel verkrijgbare bacmidegeneratoren duur zijn en we met meer monsters zullen werken, hebben we een intern protocol ontwikkeld voor zowel grote als kleine inserts van kinesine-3-motoren in bacmiden. Sf9-gezuiverde kinesine-3-motoren werden gebruikt om in vitro single-molecule en multi-motor microtubule gliding eigenschappen te karakteriseren met behulp van total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopie. Motoren zijn C-terminaal gelabeld met 3-tandem fluorescerende moleculen (3xmCit) om verbeterd signaal en verminderde fotobleaching te bieden. Vanwege de verhoogde signaal-ruisverhouding, minder fototoxiciteit en selectieve beeldvorming van een zeer klein gebied dicht bij de coverslip, is TIRF-beeldvorming op grote schaal gebruikt om eiwitdynamica op het niveau van één molecuul in vivo en in vitro te visualiseren.

Deze studie bespreekt de zuivering van kinesine-3-motoren door gebruik te maken van sf9-baculovirusexpressiesysteem en in vitro single-molecule imaging en multi-motor zweefanalyse van motoren met behulp van TIRF-microscopie. Al met al toont deze studie aan dat de beweeglijkheidseigenschappen van Sf9-gezuiverde motoren identiek zijn aan die van motoren bereid uit zoogdiercellysaten. Daarom geloven we dat het Sf9-baculovirussysteem kan worden aangepast om elk motoreiwit van belang tot expressie te brengen en te zuiveren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Sf9-cultuur, transfectie en virusgeneratie

OPMERKING: Onderhoud Sf9-cellen in 30 ml Sf-900 / SFM-medium in 100 ml steriele, wegwerpbare conische kolf zonder antibioticum / antimycotisch bij 28 ° C. Houd de ophangingscultuur in een orbitale shaker op 90 rpm. Toevoer van CO2 en vochtigheidsonderhoud is niet vereist. Cellen worden meestal elke vierde dag gesubcultureerd door 0,5 x 106 cellen / ml in te enten om op de vierde dag 2,0 x 106 cellen / ml dichtheid te bereiken.

  1. P0-virusvoorraadgeneratie
    1. Voor transfectie, zaadcellen in een schaal van 35 mm met 4,5 x 105 cellen / ml samenvloeiing en handhaven op 28 ° C zonder schudden.
    2. Na 24 uur, zodra cellen zijn bevestigd en er gezond uitzien, gaat u verder met transfectie zoals hieronder beschreven.
      1. Buis A: Meng 1 μg bacmide DNA dat codeert voor constitutief actieve KIF1A(1-393LZ)-3xmCit-FLAG specifieke kinesine-3 motor met 100 μL niet-aangevulde Grace's media.
      2. Buis B: Meng 6 μL transfectiereagens met 100 μL niet-aangevulde Grace-media.
      3. Breng de inhoud van buis A voorzichtig over in buis B en meng grondig door op en neer te pipetteren (ongeveer 20 keer).
      4. Incubeer het mengsel gedurende ~ 45 minuten bij kamertemperatuur.
    3. Voeg na het voltooien van de incubatie 0,8 ml niet-aangevulde Grace-media toe aan het bovenstaande mengsel en meng langzaam door te pipetteren.
    4. Adem de Sf-900/SFM-media voorzichtig uit cellen (om eventuele sporen van serum te verwijderen die de transfectie-efficiëntie kunnen beïnvloeden).
    5. Voeg het transfectiemengsel uit stap 1.1.3 druppelsgewijs toe aan de bovenkant van de cellen en incubeer de plaat gedurende 6 uur bij 28 °C.
    6. Verwijder na de incubatie voorzichtig het transfectiemengsel, voeg 2 ml Sf-900/SFM-media toe en incubeer verder gedurende 48 uur bij 28 °C.
    7. Controleer op de expressie van het motoreiwit onder een omgekeerde fluorescentiemicroscoop. Het motoreiwit is gelabeld met een fluorescerend eiwit, mCitrine, een variant van geel fluorescerend eiwit.
      OPMERKING: Getransfecteerde cellen werden gevisualiseerd onder een omgekeerde microscoop uitgerust met differentieel interferentiecontrast (DIC) en epifluorescentieverlichting met een 20x objectief (200 keer vergroting), kwiklamp en een EM-CCD-camera. Controleer de efficiëntie van virusgeneratie en infectie door de expressie van mCitrien-gelabelde motoren in cellen te controleren door middel van mCitrien-excitatie en emissiefilterkubus. Controleer daarnaast op morfologische veranderingen van geïnfecteerde cellen, zoals vergrote cellen/kernen (figuur 1A-C).
    8. Nogmaals, controleer de cellen 72 h na infectie. Meestal beginnen cellen los te komen van het oppervlak (figuur 2).
    9. Als >5% van de cellen loskomt van het oppervlak, oogst de media met geïnfecteerde cellen in 1,5 ml steriele microcentrifugebuizen en spin gedurende 5 minuten bij 500 x g.
    10. Verzamel het supernatant en snap vries aliquots van 1 ml in vloeibare stikstof en bewaar als P0-voorraad bij -80 °C of gebruik het om P1-virusvoorraad te genereren.
  2. Generatie van P1-virusvoorraden
    1. Om de P0 baculovirus-voorraad verder te versterken en de eiwitexpressie te bevestigen, kweekt u Sf9-cellen in vloeibare suspensiecultuur.
    2. Voeg in een steriele erlenmeyer van 100 ml 10 ml Sf-900 / SFM-media toe met een celdichtheid van 2 x 106 cellen / ml en 1 ml P0-virusvoorraad. Incubeer bij 28 °C met constant schudden bij 90 tpm.
    3. Controleer na 72 uur infectie op de eiwitexpressie zoals eerder beschreven (stap 1.1.7). Als de eiwitexpressie goed is (>90% van de cellen vertoont een helder mCitrien fluorescentiesignaal) en significante celdood vertoont (ongeveer 10% -15%), draai dan de cellen in een steriele conische buis van 15 ml bij 500 x g gedurende 5 minuten.
    4. Verzamel het supernatant, vries aliquots van 1 ml (P1-bouillon) in vloeibare stikstof en bewaar het bij -80 °C of ga over tot grootschalige infectie en eiwitzuivering.
  3. Grootschalige infectie
    1. Infecteer voor grootschalige eiwitexpressie 30 ml van de suspensiecultuur bij 2 x 106 cellen / ml dichtheid met 1 ml P1-virusvoorraad en incubeer bij 28 ° C met constant schudden bij 90 tpm.
    2. Controleer na ~ 72 uur na infectie op de eiwitexpressie (in het algemeen wordt maximale eiwitexpressie bereikt tussen 65-75 uur na infectie).
    3. Als >90% van de cellen een helder fluorescerend signaal vertonen met minimale celdood (<5%), verzamel de cellen dan in een steriele conische buis van 50 ml en draai gedurende 15 minuten bij 500 x g bij 4 °C.
      OPMERKING: Er moet minimale celdood (<5%) zijn, omdat dode cellen de cellulaire inhoud in de media vrijgeven, wat leidt tot verlies van uitgedrukt eiwit.
    4. Gooi het supernatant weg, verzamel de celpellet en ga verder met eiwitzuivering.

2. Sf9 zuivering van kinesine-3 motoren

  1. Voeg aan de bovenstaande celpellet 3 ml ijskoude lysisbuffer (aanvullende tabel 1) toe, vers aangevuld met 5 mM DTT, 5 μg / ml aprotinine, 5 μg / ml leupeptine en 5 μg / ml PMSF en lyseer de cellen door 20-25 keer te pipetteren zonder luchtbellen te genereren. Voor alle buffersamenstellingen en reagentia wordt verwezen naar aanvullende tabel 1.
  2. Laat de cel lyseren op 150.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C.
  3. Verzamel het supernatant in een verse, steriele buis en meng met ~40 μL 50% anti-FLAG M2 affiniteitshars. Incubeer het mengsel gedurende 3 uur bij 4 °C met end-to-end tuimelen.
  4. Pelleteer na incubatie de FLAG-hars door gedurende 1 min bij 4 °C op 500 x g te draaien. Zuig het supernatant voorzichtig aan zonder de pellet te verstoren met een naald van 26 G en gooi het weg.
  5. Was de FLAG-harskorrel driemaal met ijskoude wasbuffer (aanvullende tabel 1) vers aangevuld met 2 mM DTT, 5 μg/ml aprotinine, 5 μg/ml leupeptine en 5 μg/ml PMSF. Pelleteer de kralen door in elke wasbeurt gedurende 1 min bij 4 °C op 500 x g te draaien.
  6. Giet na de derde wasbeurt de wasbuffer voorzichtig zoveel mogelijk af zonder de pellet te storen. Voeg voor eiwitelutie ~70 μL wasbuffer met 100 μg/ml FLAG-peptide toe aan de harspellet en incubeer 's nachts bij 4 °C met end-to-end tuimelen.
  7. Draai de hars de volgende dag op 500 x g gedurende 1 minuut bij 4 °C. Verzamel het supernatant met gezuiverd eiwit in een verse buis en vul aan met 10% glycerol. Vries aliquots van 5 μL in vloeibare stikstof in en bewaar bij -80 °C tot verder gebruik.
  8. Voer de SDS-PAGE-gel uit om de eiwitconcentratie en -opbrengst te bepalen. Samen met gezuiverd eiwit van belang, een standaard eiwitcontrole, worden BSA van bekende concentraties variërend van 0,2 μg, 0,4 μg, 0,6 μg, 0,8 μg en 1 μg geladen om een standaardcurve te genereren. Kleur de gel met Coomassie Brilliant blue (Figuur 3).
  9. Analyseer de gel met behulp van een ingebouwde gelkwantificeringstool in ImageJ-software. Meet eerst de bandintensiteit van bekende BSA-concentraties en genereer de standaardcurve. Meet vervolgens de intensiteit van de gezuiverde eiwitband en bepaal de eiwitconcentratie. Om dit te doen, opent u de Image J-software, klikt u op de optie Analyseren in de menubalk en selecteert u Gels in het vervolgkeuzemenu.

3. In vitro single-molecule motiliteitstest met behulp van Sf9-gezuiverde kinesine-3 motoren

OPMERKING: De Sf9-gezuiverde kinesine-3-motoren kunnen worden gebruikt om biochemische en biofysische eigenschappen te bestuderen, zoals ATP-omloopsnelheid, microtubule-affiniteit, snelheid, looplengte, stapgrootte en krachtgeneratie. Hier wordt een gedetailleerd protocol beschreven voor in vitro single-molecule motiliteitsanalyse van KIF1A (1-393LZ) met behulp van Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopie. Voor alle samenstelling van buffers en reagentia wordt verwezen naar aanvullende tabel 1.

  1. Microtubule polymerisatie
    1. Bereid in een voorgekoelde microcentrifugebuis van 0,5 ml een polymerisatiemengsel door pipetteer in de volgende volgorde: 12,0 μL BRB80-buffer, pH 6,9; 0,45 μL van 100 mM MgCl2, 1 μL van 25 mM GTP.
    2. Neem een aliquot van 10 mg/ml tubuline van 10 mg/ml, opgeslagen in vloeibare stikstof, ontdooi onmiddellijk en voeg toe aan het bovenstaande polymerisatiemengsel. Meng voorzichtig door 2-3 keer te pipetteren zonder luchtbellen te creëren.
      OPMERKING: Voer de bovenstaande stappen snel en strikt op ijs uit.
    3. Laat het bovenstaande mengsel 5 minuten op ijs staan.
      OPMERKING: Dit is een cruciale stap om denaturering van tubuline te voorkomen of om de vorming van korte microtubulizaden te voorkomen.
    4. Breng de buis over in een voorverwarmd warmteblok/waterbad van 37 °C en incubeer gedurende 30 minuten voor polymerisatie van microtubuli.
    5. Terwijl microtubuli polymeriseren, ontdooit u een aliquot P12-buffer en brengt u deze op kamertemperatuur.
    6. Voordat u 30 minuten incubatie voltooit, begint u met het voorbereiden van de MT-stabilisatiebuffer door 100 μL P12-buffer in een verse microcentrifugebuis te pipetteren. Voeg hieraan 1 μL 1 mM taxol toe en vortex het mengsel onmiddellijk.
      OPMERKING: Begin ongeveer 5 minuten voordat u de incubatie voltooit met het voorbereiden van de MT-stabilisatiebuffer in stap 3.1.4. Taxol stabiliseert de gepolymeriseerde microtubuli door zich te binden aan β-tubuline.
    7. Verwarm de stabilisatiebuffer van de microtubuli gedurende 2-3 minuten bij 37 °C en voeg deze voorzichtig toe aan de gepolymeriseerde microtubuli zonder het polymerisatiemengsel aan de onderkant te verstoren.
      OPMERKING: Het opwarmen van de stabilisatiebuffer brengt deze op dezelfde temperatuur als het polymerisatiemengsel.
    8. Tik of pipetteer het mengsel niet en incubeer verder bij 37 °C gedurende 5 min.
    9. Tik voorzichtig op het mengsel en meng het met een afgeschuinde gesneden punt (200 μL capaciteit) langzaam met behulp van de pipet.
      OPMERKING: Hanteer vanaf dit punt microtubuli altijd met een afgeschuinde gesneden punt om microtubule-afschuiving te voorkomen.
    10. Neem 10-15 μL gepolymeriseerde microtubuli in een stroomcel om de juiste microtubulepolymerisatie te controleren.
      OPMERKING: Men kan de ongelabelde microtubuli visualiseren met behulp van een DIC-microscopie-opstelling.
    11. Als microtubuli geconcentreerd zijn, verdun ze dan in P12-buffer aangevuld met 10 μM taxol.
  2. Voorbereiding van de motiliteitsstroomcelkamer
    1. Bereid een motiliteitskamer voor met een glazen schuif, dubbelzijdige tape en glazen afdekplaat (22 mm x 30 mm).
    2. Neem een glazen dia, plaats een druppel (~ 70 μL) gedeïoniseerd gedestilleerd water in het midden en veeg het af met een pluisvrij tissuepapier.
    3. Snijd twee stroken dubbelzijdige tape (~ 35 x 3 mm) en plak ze stevig parallel aan de glasschuif, waardoor een opening van ~ 4-5 mm tussen twee stroken overblijft om een smalle doorgang te creëren.
    4. Neem vervolgens een coverslip en voeg een druppel (~ 20 μL) gedeïoniseerd gedestilleerd water toe in het midden. Leg een strook pluisvrij lensreinigingspapier op de waterdruppel totdat het het water absorbeert. Schuif het vervolgens langzaam naar het ene uiteinde van de coverslip.
      LET OP: De coverslip moet volledig droog zijn. Er mag geen water zichtbaar zijn op de coverlip.
    5. Plaats de coverslip op de dubbelzijdige strips die op de glijbaan zijn geplakt en druk de coverslip gelijkmatig langs de strips om stevig te plakken.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de gereinigde kant van de coverlip naar de glazen schuif is gericht.
    6. Zorg ervoor dat dit samen een smalle kamer van 10-15 μL capaciteit creëert voor het uitvoeren van motiliteitstest (figuur 4A).
  3. In vitro single-molecule motiliteitstest
    OPMERKING: Om de op microtubule gebaseerde motiliteitseigenschappen van motoren met één molecuul te bestuderen, moeten microtubuli worden geadsorbeerd op het coverslipoppervlak in de motiliteitskamer.
    1. Verdun de gepolymeriseerde taxol-gestabiliseerde microtubuli in P12-buffer aangevuld met 10 μM taxol in 1:5 verhoudingen en meng door langzaam te pipetteren met een afgeschuinde punt.
    2. Houd de stromingskamer schuin (~15-20°). Laat 30 μL verdunde microtubule-oplossing door de stroomkamer stromen vanaf het bovenste uiteinde, terwijl een pluisvrij tissuepapier aan het onderste uiteinde wordt gehouden om de vloeistof te absorberen. Dit creëert een schuifkracht om de microtubuli in de stroomrichting uit te lijnen en helpt de microtubuli recht en parallel uit te lijnen.
    3. Laat een kleine druppel vloeistof aan beide uiteinden van de kamer achter en houd de stroomcel in een omgekeerde positie (deklip naar de bodem) in een gesloten, vochtige kamer om uitdroging van de motiliteitskamer te voorkomen.
    4. Laat het ~ 30 minuten zitten, zodat microtubuli adsorberen aan het oppervlak van de coverslip in de motiliteitskamer.
    5. Bereid ondertussen de blokkerende buffer voor door de 500 μL P12-BSA-buffer te mengen met 5 μL 1 mM taxol.
    6. Laat 40-50 μL blokkerende buffer stromen en incubeer de glijbaan in omgekeerde positie gedurende 10 minuten in een vochtige kamer.
    7. Bereid het motiliteitsmengsel door de volgende componenten in een steriele microcentrifugebuis met een capaciteit van 500 μL te pipetteren in de volgende volgorde: 25 μL P12-buffer met taxol, 0,5 μL van 100 mM MgCl2, 0,5 μL van 100 mM DTT, 0,5 μL 20 mg/ml glucoseoxidase, 0,5 μL 8 mg/ml Catalase, 0,5 μL van 2,25 M Glucose en 1,0 μL van 100 mM ATP.
      OPMERKING: Fluorescentie beeldvorming is op grote schaal gebruikt voor biologische toepassingen 22,23,24,25,26. Foto-excitatie van fluorescerende eiwitten genereert reactieve zuurstofsoorten (ROS), die fotobleaching van de fluorescerende eiwitten en schade aan de biologische monsters kunnen veroorzaken27,28. Zuurstofvangers zoals glucose, glucoseoxidase en catalase worden routinematig gebruikt in motiliteitstests om fotoschade te beperken en de bleektijd van fluorescerende eiwitten te verlengen.
    8. Voeg ten slotte 1 μL van de gezuiverde motor toe aan het bovenstaande beweeglijkheidsmengsel en meng goed voordat het in de motiliteitskamer stroomt.
    9. Sluit beide uiteinden van de motiliteitskamer af met vloeibare paraffine en beeld onmiddellijk onder TIRF-verlichting met behulp van 100X TIRF-objectief van 1,49 NA met 1,5x vergroting.
    10. Om het oppervlak van de coverslip scherp te stellen, moet u eerst focussen op een van de binnenranden van dubbelzijdige tape in de motiliteitskamer onder differentiële interferentiecontrast (DIC) verlichting.
      OPMERKING: Het heldere en ongelijke oppervlak zal zichtbaar zijn.
    11. Verplaats vervolgens de focus naar de beweeglijkheidskamer. Met behulp van fijnafstelling, focus het coverslip-oppervlak en zoek naar de microtubuli die op het coverslipoppervlak zijn geadsorbeerd.
    12. Zodra de microtubuli zijn scherpgesteld, schakelt u over naar TIRF-verlichting met een excitatielaser van 488 nm en past u de verlichtingsdiepte aan door de excitatiestraalhoek te wijzigen om de beste en uniforme TIRF-verlichting te krijgen (figuur 4B).
    13. Focus de individuele mCitrine-gelabelde motoren die processief langs het microtubule-oppervlak bewegen met een belichting van 100 ms en neem de beweging op met behulp van een EM-CCD-camera.
      OPMERKING: Hoewel de motiliteitstests werden uitgevoerd op ongelabelde microtubuli, kan de maximale intensiteit z-projectiefunctie worden gebruikt om de omtrek van de microtubule-track te onthullen. Bij voorkeur werden gebeurtenissen op lange microtubulesporen overwogen voor trackinganalyse.
    14. Volg handmatig de positie van de fluorescerend gelabelde individuele motoren die frame voor frame op lange microtubule-tracks lopen met behulp van een op maat geschreven plug-in in ImageJ (nih.gov) -software zoals eerder beschreven29.
    15. Genereer de histogrammen van snelheid en looptijd voor de motorpopulatie door het aantal gebeurtenissen in elke bak uit te zetten. Pas deze histogrammen aan op een enkele Gaussische piekfunctie om de gemiddelde snelheid en looptijd12 te verkrijgen (figuur 4C-E).

4. In vitro microtubule gliding assay

OPMERKING: Om het collectieve gedrag van kinesine-3-motoren te begrijpen, werd in vitro microtubule gliding assay uitgevoerd 18,30,31. Waar motoren in omgekeerde positie op de coverslip worden geïmmobiliseerd en bij het toevoegen van microtubuli in de kamer, landen microtubuli op motoren en glijden ze mee terwijl de motoren erop proberen te lopen (figuur 5A, B).

  1. Fluorescerende microtubule polymerisatie: Polymeriseer de microtubuli volgens het eerder beschreven protocol, behalve voor het mengen van rhodamine gelabeld tubuline (3 mg / ml) met ongelabeld tubuline (10 mg / ml) in een verhouding van 1: 10.
  2. Voeg na 30 minuten polymerisatie voorzichtig 30 μL voorverwarmde microtubulistabilisatiebuffer toe en incubeer verder gedurende 5 minuten bij 37 °C.
  3. Schuif vervolgens de microtubuli door te pipetteren met de capillaire laadpunt (~ 25-30 keer).
  4. Bereid de motiliteitsstroomkamer voor zoals eerder beschreven, laat 50 μL Sf9-gezuiverde GFP-nanolichamen stromen (2,5 μL van 100 nM verdund in 50 μL P12-buffer) en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur met de deklip naar beneden gericht in een vochtige kamer.
    OPMERKING: De motoren zijn C-terminaal gelabeld met mCitrine. GFP nanobodies worden gebruikt om de motoren te immobiliseren vanwege hun lage dissociatieconstante32.
  5. Blokkeer het afdekvlak door 50 μL blokbuffer in de stroomkamer te laten stromen om niet-specifieke eiwitadsorptie te voorkomen en incubeer verder gedurende 5 minuten.
  6. Bereid het motormengsel voor door 50 μL blokbuffer, 1 μL 100mM ATP en 5 μL 100 nM Sf9-gezuiverde kinesine-3 motoren te pipetteren. Meng voorzichtig voordat je in de kamer stroomt en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in een vochtige kamer.
  7. Was de kamer tweemaal met 50 μL P12 caseïne.
  8. Bereid in een steriele microcentrifugebuis het glijdende testmengsel in de volgende volgorde: 45 μL P12-caseïne met 10 μM taxol, 1 μL 100 mM ATP, 0,5 μL 8 mg/ml catalase, 0,5 μL 20 mg/ml glucoseoxidase, 0,5 μL 2,25 M glucose en 1 μL geschoren fluorescerende microtubuli. Meng de inhoud voorzichtig voordat u in de motiliteitskamer stroomt en sluit de uiteinden van de kamer af met vloeibare paraffinewas.
  9. Beeld microtubuli glijden onder TIRF-verlichting bij 100 ms belichting en leg de beelden vast met de aangesloten EM-CCD camera.
    OPMERKING: De gemiddelde microtubule glijsnelheid werd bepaald door handmatig ongeveer 100 individuele microtubuli frame voor frame te volgen met behulp van een op maat geschreven plug-in in ImageJ29. Bepaal de gemiddelde microtubule glijsnelheid door een histogram te genereren en aan te passen aan een Gaussische functie (figuur 5C,D).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om actieve en functionele recombinante motoreiwitten op grote schaal tot expressie te brengen en te zuiveren met behulp van de Sf9-baculovirusexpressie, heeft het systeem de generatie van virale deeltjes nodig die stabiel een coderende sequentie dragen om Sf9-cellen te infecteren. Om dit te bereiken, werden Sf9-cellen getransfecteerd met recombinant bacmide dat codeert voor KIF1A (1-393LZ) -3xmCit-FLAG. Na 72 uur vertoonde een significante populatie cellen expressie van groen fluorescerend eiwit (mCitrine) met vergrote c...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het Sf9-baculovirus expressiesysteem is een van de meest veelzijdige en succesvolle methoden voor high-throughput eiwitproductie 19,36,37. Het posttranslationele modificatievermogen van Sf9-cellen is sterk vergelijkbaar met het zoogdiersysteem15. Een aanzienlijk nadeel van het gebruik van dit systeem is dat het traag en gevoelig is voor verontreiniging. Een van de meest kritieke stappen is efficiënte infe...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen tegenstrijdige financiële belangen aan te geven.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

V.S. en P.S. bedanken Prof. Kristen J. Verhey (University of Michigan, Ann Arbor, MI, USA) en Prof. Roop Mallik (Indian Institute of Technology Bombay (IITB), Mumbai, India) voor hun onvoorwaardelijke steun gedurende het onderzoek. P.S. bedankt Dr. Sivapriya Kirubakaran voor haar steun gedurende het hele project. V.S. erkent financiering via DBT (Grant No.: BT/PR15214/BRB/10/1449/2015 en BT/RLF/Re-entry/45/2015) en DST-SERB (Grant No.: ECR/2016/000913). P.K.N erkent ICMR voor financiering (Subsidie nr. 5/13/13/2019/NCD-III). P.S. erkent financiering uit DST (Grant No.: SR/WOS-A/LS-73/2017). D.J.S erkent fellowship van IIT Gandhinagar.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Sf9 cultuur en transfectiematerialen
anti-FLAG M2 affiniteitBiolegend651502Voor eiwitzuivering
AprotinineSigmaA6279Voor eiwitzuivering
CellfectinInvitrogen10362100Voor Sf9 transfectie
DTTSigmaD5545Voor motiliteitstests en eiwitzuivering
FLAG-peptideSigmaF3290Voor eiwitzuivering
GlycerolSigmaG5516Om het eiwit te bevriezen
HEPESSigmaH3375Voor Sf9 lysis buffer
IGEPAL CA 630SigmaI8896Voor Sf9 lysis buffer
KClSigmaP9541Voor bufferbereiding
LeupeptineSigmaL2884Voor eiwitzuivering
MgCl2SigmaM2670Voor bufferbereiding
NaClSigmaS7653Voor lysis buffer
PMSFSigmaP7626Voor eiwitzuivering
Sf9-cellenVriendelijk geschenk van Dr. Thomas Pucadyil (Indian Institute of Science Education and Research, Pune, India).Voor baculovirus expressie en eiwitzuivering
Sf9 cultuurflessenThermo Scientific4115-0125Voor suspensiecultuur
Sf-900/SFM medium (1X)Thermo Scientific10902-096 -500mlVoor het kweken van Sf9-cellen
SucroseSigmaS1888Voor het bereiden van lyseringsbuffer voor Sf9-cellen
Unsupplemented Grace’s mediaThermo Scientific11595030 -500mlVoor Sf9 transfectie
Microtubule polymerisatie en enkele molecuul assaymaterialen
ATPSigmaA2647Voor motiliteits- en glijtest
BSASigmaA2153Voor het blokkeren van de motiliteitskamer
CatalaseSigmaC9322Voor motiliteits- en glijtest
DMSOSigmaD5879Voor het oplossen van Rhodamine
EGTASigma3777Voor bufferbereiding
GlucoseSigmaG7021Voor motiliteits- en glijtest
Glucose oxidaseSigmaG2133Voor motiliteits- en glijtest
GTPSigmaG8877Voor microtubuluspolymerisatie
KOHSigmaP1767Voor het bereiden van PIPES buffer pH 6.9
PIPESSigmaP6757Voor het bereiden van motiliteits- en glijtest buffers
Microtubulus glijtestmaterialen
26G  naaldDispovanVoor het schuiven van microtubuli
CaseïneSigmaC3400Voor microtubulus glijtest
GFP nanolichamenGift van Dr. Sivaraj Sivaramakrishnan (University of Minnesota, USA)Voor het bevestigen van motoren aan de dekglas
RhodamineThermo Scientific46406Voor het bereiden van het labelen van tubuline
Microscoop en andere instrumenten
0,5ml, 1,5 en 2-ml microcentrifugebuizenEppendorfVoor Sf9 cultuur en zuivering
10ml  wegwerpbare steriele pipettenEppendorfVoor Sf9 cultuur en zuivering
10ul, 200ul, 1ml micropipettipsEppendorfVoor Sf9 cultuur en zuivering
15ml conische buizenEppendorfVoor Sf9 cultuur en zuivering
35mm celcultuur schaalCole Palmer15179-39Voor Sf9 cultuur
BalansSartorious0,01g-300g
Benchtop orbial schuddende incubatorREMIVoor Sf9 suspensiecultuur bij 28oC
CameraEMCCD Andor iXon Ultra 897Voor TIRF beeldvorming en acquisitie
Dubbelzijdig plakbandScotchVoor het maken van de motiliteitskamer
GlasdekglasFisherfinest12-548-5Agrootte; 22X30
GlasplaatjeBlue StarVoor het maken van de motiliteitskamer
VerwarmingsblokNeuationOm paraffine was te smelten
Omgekeerde microscoopNikon Eclipse Ti- UOm eiwitexpressie te controleren
Lasers488nm (100mW)Voor TIRF beeldvorming
Vloeibare stikstofVoor monster bevriezing en opslag
Microcapillaire laadtipEppendorfEP022491920Voor het schuiven van microtubuli
MicroscoopNikon Eclipse Ti2-E met DIC set upVoor TIRF beeldvorming
Mini spinGenetix, BiotechAsia Pvt.LtdVoor snel draaien
Objectief100X TIRF objectief met 1,49NA olie-immersieVoor TIRF beeldvorming
Optima UltraCentrifuge XEBeckman CoulterVoor eiwitzuivering
ParafilmEppendorf
pH-meterCorningCoring 430Om de pH aan te passen
Pipette-boyVWRVoor Sf9 cultuur en zuivering
Sorvall Legend Micro 21Thermo ScientificVoor eiwitzuivering
Sorvall ST8R centrifugeThermo ScientificEiwitzuivering
ThermoMixerEppendorfVoor microtubuluspolymerisatie
Ultracentrifuge rotorBeckman coulterSW60Ti rotor
Ultracentrifugebuizen

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vale, R. D. The molecular motor toolbox for intracellular transport. Cell. 112, 467-480 (2003).
  2. Miki, H., Okada, Y., Hirokawa, N. Analysis of the kinesin superfamily: insights into structure and function. Trends in Cell Biology. 15 (9), 467-476 (2005).
  3. Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease. Neuron. 68 (4), 610-638 (2010).
  4. Hirokawa, N., Takemura, R. Molecular motors and mechanisms of directional transport in neurons. Nature Reviews Neuroscience. 6 (3), 201-214 (2005).
  5. Patel, N. M., et al. KIF13A motors are regulated by Rab22A to function as weak dimers inside the cell. Scientific Advances. 7 (6), (2021).
  6. Franker, M. A., Hoogenraad, C. C. Microtubule-based transport - basic mechanisms, traffic rules and role in neurological pathogenesis. Journal of Cellular Science. 126, Pt 11 2319-2329 (2013).
  7. Gunawardena, S., Anderson, E. N., White, J. Axonal transport and neurodegenerative disease: vesicle-motor complex formation and their regulation. Degernative Neurological and Neuromuscular Disease. 4, 29-47 (2014).
  8. Rath, O., Kozielski, F. Kinesins and cancer. Nature Reviews Cancer. 12 (8), 527-539 (2012).
  9. Wang, Z. Z., et al. KIF14 promotes cell proliferation via activation of Akt and is directly targeted by miR-200c in colorectal cancer. International Journal of Oncology. 53 (5), 1939-1952 (2018).
  10. Guo, S. K., Shi, X. X., Wang, P. Y., Xie, P. Run length distribution of dimerized kinesin-3 molecular motors: comparison with dimeric kinesin-1. Scientific Reports. 9 (1), 16973(2019).
  11. Scarabelli, G., et al. Mapping the processivity determinants of the Kinesin-3 motor domain. Biophysical Journal. 109 (8), 1537-1540 (2015).
  12. Soppina, V., et al. Dimerization of mammalian kinesin-3 motors results in superprocessive motion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (15), 5562-5567 (2014).
  13. Soppina, V., Verhey, K. J. The family-specific K-loop influences the microtubule on-rate but not the superprocessivity of kinesin-3 motors. Molecular Biology Cell. 25 (14), 2161-2170 (2014).
  14. Soppina, V., et al. Kinesin-3 motors are fine-tuned at the molecular level to endow distinct mechanical outputs. BMC Biology. , (2022).
  15. Korten, T., Chaudhuri, S., Tavkin, E., Braun, M., Diez, S. Kinesin-1 Expressed in insect cells improves microtubule in vitro gliding performance, long-term stability and guiding efficiency in nanostructures. IEEE Transactions on Nanobioscience. 15 (1), 62-69 (2016).
  16. Schmidt, F. R. Recombinant expression systems in the pharmaceutical industry. Applied Microbiology and Biotechnology. 65 (4), 363-372 (2004).
  17. Kurland, C., Gallant, J. Errors of heterologous protein expression. Current Opinions in Biotechnology. 7 (5), 489-493 (1996).
  18. Tao, L., Scholey, J. M. Purification and assay of mitotic motors. Methods. 51 (2), 233-241 (2010).
  19. Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nature Biotechnology. 23 (5), 567-575 (2005).
  20. Felberbaum, R. S. The baculovirus expression vector system: A commercial manufacturing platform for viral vaccines and gene therapy vectors. Biotechnology Journal. 10 (5), 702-714 (2015).
  21. Kumar, N., Pandey, D., Halder, A. Trends in Insect Molecular Biology and Biotechnology. Kumar, D., Gong, C. , Springer International Publishing. 163-191 (2018).
  22. Nagano, T. Development of fluorescent probes for bioimaging applications. Proceedings of the Japan Academy. Series B. Physical and Biological Sciences. 86 (8), 837-847 (2010).
  23. Hassan, M., Klaunberg, B. A. Biomedical applications of fluorescence imaging in vivo. Comparative Medicine. 54 (6), 635-644 (2004).
  24. Yang, Z., Samanta, S., Yan, W., Yu, B., Qu, J. Super-resolution microscopy for biological imaging. Advances in Experimental Medicine and Biology. 3233, 23-43 (2021).
  25. Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
  26. Waters, J. C. Live-cell fluorescence imaging. Methods in Cell Biology. 114, 125-150 (2013).
  27. Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores. Photochemistry and Photobiology. 90 (2), 448-454 (2014).
  28. Wojtovich, A. P., Foster, T. H. Optogenetic control of ROS production. Redox Biology. 2, 368-376 (2014).
  29. Cai, D., Verhey, K. J., Meyhofer, E. Tracking single Kinesin molecules in the cytoplasm of mammalian cells. Biophysical Journal. 92 (12), 4137-4144 (2007).
  30. Bohm, K. J., Stracke, R., Baum, M., Zieren, M., Unger, E. Effect of temperature on kinesin-driven microtubule gliding and kinesin ATPase activity. FEBS Letters. 466, 59-62 (2000).
  31. Porter, M. E., et al. Characterization of the microtubule movement produced by sea urchin egg kinesin. The Journal of Biological Chemistry. 262 (6), 2794-2802 (1987).
  32. Muyldermans, S. Nanobodies: natural single-domain antibodies. Annual Review of Biochemistry. 82, 775-797 (2013).
  33. Verma, S., Kumar, N., Verma, V. Role of paclitaxel on critical nucleation concentration of tubulin and its effects thereof. Biochemical and Biophysical Research Communications. 478 (3), 1350-1354 (2016).
  34. Parness, J., Horwitz, S. B. Taxol binds to polymerized tubulin in vitro. Journal of Cell Biology. 91 (2), 479-487 (1981).
  35. Schiff, P. B., Fant, J., Horwitz, S. B. Promotion of microtubule assembly in vitro by taxol. Nature. 277 (5698), 665-667 (1979).
  36. Kato, T., Kageshima, A., Suzuki, F., Park, E. Y. Expression and purification of human (pro)renin receptor in insect cells using baculovirus expression system. Protein Expression and Purification. 58 (2), 242-248 (2008).
  37. Liu, F., Wu, X., Li, L., Liu, Z., Wang, Z. Use of baculovirus expression system for generation of virus-like particles: successes and challenges. Protein Expression and Purification. 90 (2), 104-116 (2013).
  38. Terpe, K. Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Applied Microbiology and Biotechnology. 60 (5), 523-533 (2003).
  39. Huang, S. T., et al. Liposomal paclitaxel induces fewer hematopoietic and cardiovascular complications than bioequivalent doses of Taxol. International Journal of Oncology. 53 (3), 1105-1117 (2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Kinesine 3 motorenSf9 zuiveringbaculovirusexpressieTIRF microscopiemotiliteit van motorprote nenmicrotubuli glijdenaffiniteitszuiveringfluorescent eiwitlabelingin vitro reconstitutie

Gerelateerde artikelen