Moleculaire en immunologische technieken in een genetisch gemanipuleerd muismodel van gastro-intestinale stromale tumor

Samenvatting

Het doel van dit manuscript is om het Kit^V558Δ/+ muismodel en technieken voor succesvolle dissectie en verwerking van muismonsters te beschrijven.

Samenvatting

Gastro-intestinale stromale tumor (GIST) is het meest voorkomende menselijke sarcoom en wordt meestal aangedreven door een enkele mutatie in de KIT-receptor. Voor alle tumortypen zijn talloze muismodellen ontwikkeld om de volgende generatie kankertherapieën te onderzoeken. In GIST gebruiken de meeste in vivo studies echter xenograft muismodellen die inherente beperkingen hebben. Hier beschrijven we een immunocompetent, genetisch gemanipuleerd muismodel van gastro-intestinale stromale tumor met een Kit^{V558Δ / +} -mutatie. In dit model wordt mutant KIT, het oncogen dat verantwoordelijk is voor de meeste GISTs, aangedreven door zijn endogene promotor die leidt tot een GIST die het histologische uiterlijk en immuuninfiltraat nabootst dat wordt gezien in menselijke GISTs. Bovendien is dit model met succes gebruikt om zowel gerichte moleculaire als immuuntherapieën te onderzoeken. Hier beschrijven we het fokken en onderhouden van een Kit^V558Δ/+ muizenkolonie. Daarnaast beschrijft dit artikel de behandeling en verkrijging van GIST, drainerende mesenteriale lymfeklier en aangrenzende blindedarm in Kit^{V558Δ / +} -muizen, evenals monstervoorbereiding voor moleculaire en immunologische analyses.

Inleiding

GIST is het meest voorkomende sarcoom bij mensen met een incidentie van ongeveer 6.000 gevallen in de Verenigde Staten van Amerika¹. GIST lijkt afkomstig te zijn van de gastro-intestinale pacemakercellen die de interstitiële cellen van Cajal worden genoemd en wordt meestal aangedreven door een enkele mutatie in de tyrosinekinase KIT of PDGFRA². Chirurgie is de steunpilaar van de behandeling voor GIST en kan curatief zijn, maar patiënten met een gevorderde ziekte kunnen worden behandeld met de tyrosinekinaseremmer (TKI), imatinib. Sinds de introductie meer dan 20 jaar geleden heeft imatinib het behandelingsparadigma in GIST getransformeerd, waardoor de overleving bij gevorderde ziekte is verbeterd van 1 naar meer dan 5 jaar ^3,4,5. Helaas is imatinib zelden curatief vanwege verworven KIT-mutaties, dus nieuwe behandelingen zijn nodig voor deze tumor.

Muismodellen zijn een belangrijk onderzoeksinstrument bij het onderzoek naar nieuwe therapieën bij kanker. Meerdere subcutane xenograft- en patiënt-afgeleide xenograftmodellen zijn ontwikkeld en onderzocht in GIST ^6,7. Immunodeficiënte muizen vertegenwoordigen echter niet volledig menselijke GIST, omdat GISTs differentiële immuunprofielen hebben, afhankelijk van hun oncogene mutatie, en het veranderen van de gastro-intestinale tumormicro-omgeving verbetert de effecten van TKI-therapie ^8,9. De Kit^V558Δ/+ muis heeft een heterozygote kiembaandeletie in Kit exon 11, die codeert voor het juxtamembrane domein, de meest gemuteerde plaats in menselijke GIST¹⁰. Kit^V558Δ/+ muizen ontwikkelen een enkele cecale GIST met 100% penetrantie, en tumoren hebben vergelijkbare histologie, moleculaire signalering, immuuninfiltratie en respons op therapie als menselijke GIST 8,11,12,13. Hier beschrijven we het fokken, behandelen en isoleren en verwerken van monsters in Kit^{V558Δ / +} muizen voor gebruik in moleculair en immunologisch onderzoek in GIST.

Protocol

Alle muizen werden gehuisvest onder pathogeenvrije omstandigheden aan de Universiteit van Pennsylvania volgens nih-richtlijnen en met goedkeuring van de Universiteit van Pennsylvania IACUC. Euthanasie werd uitgevoerd volgens de standaard operationele procedures van de University of Pennsylvania Laboratory Animal Resources.

1. Kit^V558Δ/+ muizen fokken

1. Steek de Kit^V558Δ/+ muizen meer dan 10 keer terug op een C57BL/6J achtergrond met behulp van C57BL/6J muizen. Om dit te doen, fokt u de mannelijke Kit^{V558Δ / +} -muizen met vrouwelijke C57BL / 6J-muizen in een verhouding van 1: 2.
   OPMERKING: Het homozygote Kit^{V558Δ/V558Δ} genotype is dodelijk in de baarmoeder. Het is mogelijk om vrouwelijke Kit^V558Δ/+ muizen te fokken met mannelijke C57BL/6J muizen, maar de worpgrootte is ongeveer de helft van die van vrouwelijke wildtype C57BL/6J muizen. Bovendien produceren vrouwelijke Kit^V558Δ/+ muizen beperkte nesten na de leeftijd van 4 maanden.
2. Genotypeer de pups op de leeftijd van 7-14 dagen door teenknippen om de aanwezigheid van het Kit^V558Δ/+ genotype te bevestigen. Gebruik de voorwaartse primer: TCTCCTCCAGAAACCCATGTATGAA; verslaggever 1: CCTCGACAACCTTCCA; omgekeerde primer: TTGCGTCGGGTCTATGTAAACAT; en verslaggever 2: TCTCCTCGACCTTCCA voor genotypering.

2. Kit^V558Δ/+ muisbehandeling

1. Leeftijd en geslacht komen overeen met de Kit^V558Δ/+muizen voorafgaand aan de behandeling. Gebruik de leeftijds- en geslachtsgematchte muizen in cohorten, omdat tumoren van vrouwelijke Kit^{V558Δ / +} -muizen groter zijn dan die bij mannelijke muizen. Behandel de muizen op 8-12 weken oud, waarna tumoren worden vastgesteld (figuur 1).
2. Geef tyrosinekinaseremmers oraal of via intraperitoneale (i.p.) injectie; Kit^V558Δ/+ tumoren zijn gevoelig voor tyrosinekinaseremmers. Geef imatinib in een dosis van 600 mg/l in drinkwater of i.p. injecties van 45 mg/kg tweemaal daags. Meet de gewichtsvermindering van de tumor met behulp van digitale weegschalen na dissectie van de tumor zoals weergegeven in stap 3, wat ongeveer 50% is na 1 week en 80% na 4 weken na behandeling met imatinib (figuur 2).

3. Kit^V558Δ/+ muis orgaan oogst

1. Euthanaseer muizen door CO₂ narcose met een stroomsnelheid van 60% kamervolume per minuut. Laat muizen minstens 2 minuten in de kamer nadat de ademhaling is gestopt en voer vervolgens cervicale dislocatie uit om de dood te bevestigen.
2. Steriliseer alle instrumenten, draag handschoenen tijdens de procedure en onderhoud een steriel veld. Bereid de huid voor met 70% ethanol. Maak een verticale incisie van 2 cm in het midden met een schaar en ga de buikholte in. Lyseer scherp eventuele intra-abdominale verklevingen.
3. Volg de onderstaande stappen om de drainerende mesenteriale lymfeklier te verwijderen.
   1. Identificeer de blindedarm en til het mesenterium superieur op. Ongeveer halverwege de basis van het colon mesenterium, identificeer de mesenteriale lymfeklier en ontleed deze scherp. De lymfeklier is gebroken wit en ongeveer 0,5 cm x 0,5 cm groot.
   2. Verdeel lymfeklierweefsel in derden voor eiwitisolatie, histologie en eencellige suspensie, indien nodig. Voor eencellige suspensies plaatst u lymfeklierweefsel in 20 ml serumvrije media (RPMI) en houdt u het ijs aan.
4. Voor isolatie van de GIST en blindedarm, volgt u de onderstaande stappen.
   1. De blindedarm in Kit^V558Δ/+ muizen wordt grotendeels vervangen door een GIST. Deel de ileocolic-overgang zorgvuldig van de basis van de tumor. Om de blindedarm te verzamelen, deelt u de dikke darm opnieuw, 2 cm proximaal aan de basis van de tumor.
   2. Bij 50%-60% van de Kit^V558Δ/+ muizen bevat de kop van de tumor een kap van cecal weefsel, die meestal sereuze vloeistof bevat, maar zelden pus kan bevatten (figuur 3). Ontleed het dopweefsel scherp weg van het tumorweefsel.
   3. Verdeel tumorweefsel en / of blindedarm in derden voor eiwitisolatie, histologie en eencellige suspensie, indien nodig. Voor eencellige suspensies plaatst u tumorweefsel of blindedarm in HBSS met 2% FCS, genoeg om het monster te bedekken en op ijs te houden.

4. Western blot analyse van GIST weefsel

1. Bereid weefsellysisbuffer met 50 mM TrisHCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% niet-rijpend wasmiddel, 2 mM Na₃VO₄, 1 mM PMSF, 10 mM NaF en 20 μl/ml proteïnaseremmermengsel.
2. Bereid een 1x Tris-gebufferde zoutoplossing met 1% Tween 20 (TBST) door 1800 ml gedeïoniseerd water, 2 ml Tween 20 en 200 ml 10x Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) te combineren.
3. Resuspensie weefsel uit stap 3.4.3 in een FACS-buis in 5 ml / g weefsellysisbuffer en homogeniseer tweemaal met een mechanische homogenisator bij 15.000 tpm gedurende 15 s op ijs. Incubeer lysaat gedurende 30 minuten op ijs.
4. Breng lysaat over in een microcentrifugebuis van 1,5 ml. Centrifugeer met maximale snelheid gedurende 20 minuten bij 4 °C. Breng supernatant over in een nieuwe microcentrifugebuis.
5. Voer lysaten uit op een 4% tot 15% gradiëntgel en breng vervolgens over naar een nitrocellulosemembraan, zoals beschreven in¹⁴.
6. Was het membraan eenmaal in 1x TBS gedurende 5 minuten en blokkeer vervolgens het membraan in 5% melk gedurende 1 uur. Nogmaals, was het membraan eenmaal in 1x TBS gedurende 10 minuten.
7. Incubeermembraan in primair antilichaam verdund 1:1000 in 5% BSA bij 4 °C 's nachts. Wasmembraan 3x in 1x TBST gedurende 10 min elk. Incubeervlek met secundair antilichaam verdund 1:2500 in 2,5% melk gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
8. Was het membraan eenmaal in 1x TBS gedurende 5 min. Voeg voldoende HRP-substraat toe om het membraan te bedekken, meestal 200-500 μL, en gebruik een digitale imager om chemiluminescentie te detecteren en te kwantificeren.

5. Immunohistochemie van GIST-weefsel

1. Fixeer weefsel uit stap 3.3.2 of 3.4.3 in 4% paraformaldehyde bij 4 °C 's nachts. Bewaar weefsel in 70% EtOH tot het klaar is voor verwerking. Inbouw- en sectieblokken met een dikte van 5 μm op glasplaten, zoals beschreven^15,16.
2. Volledige immunohistochemische detectie met behulp van een basis immunodetectiekit, zoals eerder beschreven¹⁷.

6. Eencellige suspensie van mesenteriale lymfeklier

1. Giet RPMI-media met lymfekliermonster uit stap 3.3.2 over een filter van 100 μm. Verplaats het filter naar een nieuwe conische 50 ml en pureer lymfeklier met het zachte uiteinde van een plastic spuit van 3 ml. Wasfilter met 20 ml RPMI-media.
2. Centrifugeer het filtraat bij 450 x g bij 4 °C gedurende 5 min. Aspirateer het supernatant.
3. Resuspendeer pellet in 20 ml van 1% FBS in PBS (kraalbuffer) en giet over een filter van 40 μm. Verzamel het celfiltraat. Tel cellen met behulp van een hemocytometer.
4. Centrifugeer het filtraat bij 450 x g bij 4 °C gedurende 5 min. Aspirateer het supernatant. Resuspenderen in kraalbuffer op 6 x 10⁷ cellen/ml voor flowcytometrie.

7. Eencellige suspensie van GIST

1. Bereid collagenasebuffer voor door 250 mg collagenase IV, één tablet EDTA-vrije proteaseremmer en 100 μL DNase I toe te voegen aan 50 ml HBSS. Draai gedurende 10 minuten op kamertemperatuur totdat het is opgelost.
2. Doe GIST in een steriele schaal en voeg 2,5 ml collagenasebuffer toe. Gehakt tumor met behulp van een steriel scalpel en schaar totdat de tumor in fijne fragmenten is. Gebruik een pipet met grote boring om de tumor en collagenase in een buis van 50 ml te aspirateren.
3. Incubeer in een schudincubator bij 100 tpm bij 37 °C gedurende 30 min. Blusreactie met 2 ml FBS.
4. Giet collagenase met GIST-monster over een filter van 100 μm en pureer tumor met het zachte uiteinde van een plastic spuit van 3 ml en verzamel in een buis van 50 ml. Wasfilter met 20 ml HBSS. Centrifugeer het filtraat bij 450 x g, 4 °C gedurende 5 min. Aspirateer het supernatant.
5. Resuspendeer de pellet in 20 ml kraalbuffer en giet over een filter van 40 μm. Verzamel het filtraat en tel cellen met behulp van een hemocytometer. Centrifugeer het filtraat bij 450 x g, 4 °C gedurende 5 min. Aspirateer het supernatant. Resuspenderen in kraalbuffer op 6 x 10⁷ cellen/ml voor flowcytometrie.

8. Eencellige suspensie van blindedarm

1. Bereid collagenasebuffer voor zoals in stap 7.1. Splits met behulp van een schaar de blindedarm in de lengterichting om het binnenste slijmvlies bloot te leggen. Snijd in secties van 0,5 cm en plaats in een buis van 50 ml met 5 ml HBSS met 2% FBS. Schud krachtig gedurende 30 s, centrifugeer op 450 x g gedurende 20 s en adem vervolgens het supernatant op.
2. Voeg 5 ml HBSS toe met 2 mM EDTA. Incubeer in een schudinmachine bij 37 °C bij 100 tpm gedurende 15 minuten. Centrifugeer bij 450 x g gedurende 20 s. Aspirateer het supernatant.
3. Voeg 5 ml HBSS toe. Schud krachtig gedurende 30 s, centrifugeer op 450 x g gedurende 20 s en adem vervolgens het supernatant op. Herhaal dit nogmaals.
4. Voeg 5 ml collagenasebuffer toe. Incubeer in een schudincubator bij 37 °C gedurende 30 min bij 100 tpm. Schud krachtig om de 10 minuten. Blusreactie met 2 ml FBS.
5. Giet collagenase met blindedarmmonster over een filter van 100 μm en pureer met het zachte uiteinde van een plastic spuit van 3 ml. Wasfilter met 20 ml HBSS. Filtraat verzamelen.
6. Centrifugeer het filtraat bij 450 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Aspirateer het supernatant. Resuspendeer pellet in 20 ml kraalbuffer en giet over een filter van 40 μm. Verzamel filtraat en tel cellen met behulp van een hemocytometer.
7. Centrifugeer het filtraat bij 450 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Aspirateer het supernatant. Resuspenderen in kraalbuffer op 6 x 10⁷ cellen/ml voor flowcytometrie.

Resultaten

Het Kit^V558Δ/+ muismodel maakt het mogelijk om therapieën te onderzoeken in een immunocompetent muismodel. Kit^V558Δ/+ muizen hebben een gemiddelde levensduur van 8 maanden als gevolg van progressieve darmobstructie (figuur 4). Tumoren van Kit^V558Δ/+ muizen drukken canonieke markers van GIST uit, waaronder de tyrosinekinase KIT en het transmembraankanaal DOG1 (fi...

Discussie

Het Kit^V558Δ/+ muismodel is een krachtig onderzoeksinstrument in de moleculaire en immunologische analyse van GIST. Hoewel de fokstrategie een enkele kruising vereist, vereist het gebruik van Kit^{V558Δ / +} muiscohorten in experimenten die de tumorrespons analyseren, uitgebreide fokkerij. Muizen moeten leeftijds- en geslachtsgematcht zijn om vergelijkbare tumorgewichten te garanderen, en 10% van de muizen sterft vóór de leeftijd van 8 weken wanneer tumoren worden vastgesteld. Minder ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
100 micron filter	EMSCO	1194-2360
1x RBC lysis buffer	Life Technologies	00-4333-57
3mL syringe	Thermo Fisher Scientific/BD Biosciences	14823435
4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 µl	Bio-Rad	4561083
4% Paraformaldehyde Solution	Thermo Fisher Scientific	AAJ19943K2
40 micron filter	EMSCO	1194-2340
5M NaCl	Sigma Aldrich	S6546
70 micron filter	EMSCO	1194-2350
AKT antibody (C67E7)	Cell Signaling	4691
C57BL/6J mice	The Jackson Laboratory
Collagenase IV	Sigma Aldrich	C5138
Complete mini edta free protease inhibitor	Thomas Scientific	C852A34
Countess II Automated Cell Counter	Thermo Fisher Scientific
Disposable Scalpels	Thermo Fisher Scientific/Exel International	14-840-00
Dnase I	Thomas Scientific	C756V81
Dog1 antibody	abcam	ab64085
EDTA	Sigma Aldrich	E9884
ERK antibody (p44/42)	Cell Signaling	9102
FBS	Thomas Scientific	C788U23
FIJI software	FIJI		https://imagej.net/software/fiji
Fisherbrand 850 Homogenizer	Thermo Fisher Scientific	15-340-169
HBSS	University of Pennsylvania Cell Center
Imatinib mesylate	Selleck Chemicals	S1026
KIT antibody (D13A2)	Cell Signaling	3074
KitV558Δ/+ Genotyping	Transnetyx
Microcentrifuge tubes (1.5mL)	Thermo Fisher Scientific	05-408-129
Mouse on Mouse Immunodetection Kit, Basic	Vector Laboratories	BMK-2202
Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 µm	Rio-Rad	1620145
Nonfat Dry Milk	Thermo Fisher Scientific	NC9121673
Nonidet P 40 Substitute	Sigma Aldrich	74385
p-AKT antibody (S473)	Cell Signaling	4060
p-ERK antibody (p44/42)	Cell Signaling	9101
p-KIT antibody (Y719)	Cell Signaling	3391
PMSF Protease Inhibitor	Thermo Fisher Scientific	36978
Proeinase K	Thermo Fisher Scientific	BP170050
Round-Bottom Polystyrene Test (FACS) Tubes	Falcon/Thermo Fisher Scientific	14-959-2A
RPMI	University of Pennsylvania Cell Center
Sodium fluoride (NaF)	Sigma Aldrich	201154
Sodium orthovanadate (Na3VO4)	Sigma Aldrich	S6508
SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate	Thermo Fisher Scientific	34076
TBS buffer (10x)	University of Pennsylvania Cell Center
Tissue culture dish (100mm2)	Thermo Fisher Scientific/Falcon	08-772E
TrisHCL	Thermo Fisher Scientific	BP1757500
Tween 20	Rio-Rad	1706531
vivaCT 80 platform	Scanco medical