Het huidige protocol stelt een peritoneale dialyse (PD) muismodel vast van chloorhexidinegluconaat (CG) -geïnduceerde peritoneale fibrose. Het huidige model is eenvoudig en gemakkelijk te gebruiken in vergelijking met andere PD-diermodellen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een muizenmodel van chloorhexidine gluconaat-geïnduceerde peritoneale schade
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Peritoneale fibrose is een belangrijke complicatie van peritoneale dialyse (PD). Om dit probleem te onderzoeken en aan te pakken, is een geschikt diermodel van PD vereist. Het huidige protocol stelt een chloorhexidinegluconaat (CG) geïnduceerd peritoneale fibrosemodel vast dat de toestand van een patiënt met PD nabootst. Peritoneale fibrose werd geïnduceerd door intraperitoneale injectie van 0,1% CG in 15% ethanol gedurende 3 weken (om de andere dag toegediend), voor een totaal van negen keer bij mannelijke C57BL / 6-muizen. Peritoneale functionele tests werden vervolgens uitgevoerd op dag 22. Nadat de muizen waren geofferd, werden het pariëtale peritoneum van de buikwand en het viscerale peritoneum van de lever geoogst. Ze waren dikker en fibrotischer wanneer ze microscopisch werden geanalyseerd na de trichrome kleuring van Masson. De ultrafiltratiesnelheid nam af en glucosemassatransport duidde op een CG-geïnduceerde toename van de peritoneale permeabiliteit. Het aldus vastgestelde PD-model kan toepassingen hebben bij het verbeteren van PD-technologie, dialyse-werkzaamheid en het verlengen van de overleving van de patiënt.
Inleiding
Peritoneale dialyse (PD) is een vorm van niervervangende therapie. PD heeft echter problemen die niet kunnen worden opgelost. Langdurige PD-behandeling kan bijvoorbeeld peritoneale schade veroorzaken, wat uiteindelijk leidt tot ultrafiltratiefalen en stopzetting van de behandeling 1,2,3,4,5,6. Peritoneale fibrose is een van de ernstigste complicaties 7,8. Peritoneale fibrose wordt gekenmerkt door de afzetting en accumulatie van extracellulaire matrix binnen het interstitium, en neo-angiogenese en vasculopathie van het peritoneum 9,10.
De belangrijkste oorzaken van deze peritoneale veranderingen zijn terugkerende peritonitis en niet-biocompatibiliteit van het dialysaat, die hyperosmotisch, hoge glucose, lage pH en accumulatie van glucoseafbraakproducten zijn11,12. Daarom kunnen geschikte dierexperimentele modellen onderzoekers helpen de fysiologische en pathologische veranderingen van het peritoneum tijdens PD-therapie beter te bestuderen. Daarom is het opzetten van een PD-model voor dieren belangrijk voor het verbeteren van PD-technologie en dialyse-effectiviteit en het verlengen van de overleving van de patiënt. Deze studie was gericht op het genereren van een PD-muismodel door intraperitoneale (i.p.) injectie van chloorhexidinegluconaat (CG), zoals eerder beschreven13,14. Dit PD-muismodel is eenvoudig, gemakkelijk te gebruiken en haalbaar in vergelijking met andere PD-diermodellen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle muisexperimenten werden goedgekeurd door het Laboratory Animal Center van het E-DA Hospital / I-Shou University en werden behandeld volgens de "Guide for the Care and Use of Laboratory Animals" (NRC, USA 2011). Mannelijke C57BL/6 muizen, 7-8 weken oud, werden gebruikt voor de huidige studie.
1. Chemische bereiding
- Bereid de chemische irriterende stof door 0,1% chloorhexidinegluconaat (CG, zie materiaaltabel) te verdunnen in 15% ethanol.
2. Behandeling van dieren
- Wijs drie muizen toe als controlegroep. Voer intraperitoneale injectie (i.p.) uit van 1 ml / kg 0,9% normale zoutoplossing (NS) om de andere dag gedurende 3 weken, voor een totaal van negen keer.
- Wijs drie muizen toe aan de peritoneale fibrosegroep. Induceer peritoneale fibrose met chloorhexidinegluconaat (CG) door ip-injecties van 0,1% CG in 15% ethanol (stap 1.1) toe te dienen in een dosis van 12,5 μL/g lichaamsgewicht. Voer dit om de andere dag uit gedurende 3 weken, voor een totaal van negen keer.
3. Peritoneale functietests (gemodificeerde peritoneale evenwichtstest)
- Bereid een dialyseoplossing met 4,25% glucose. Trek 0,5 ml dialysaatmonster met een spuit en controleer vervolgens de glucoseconcentratie in het dialysaatmonster.
OPMERKING: De glucoseconcentratie wordt bepaald volgens de hexokinase/G6PD-methode. Dialysaatmonsters werden benaderd voor L-type Glu 2-assay en onderzocht met een biochemische analysator (zie Tabel met materialen). Dit is de initiële glucoseconcentratie van dialysaten. - Verdoof de muizen door intramusculaire injectie van Zoletil en Xylazine (bereid in een volumeverhouding van 1:2, zie tabel met materialen) in een dosis van 20 μL/20 gw. Gebruik bovendien veterinaire zalf op de ogen om uitdroging onder anesthesie te voorkomen.
- Voer i.p. instillatie van de dialyseoplossing uit (2 ml/20 g lichaamsgewicht).
- Beoordeel en verifieer na 30 minuten de diepte van de anesthesie met gebrek aan teenknijpreflex. Voer vervolgens een verticale incisie uit in de middellijn van de buik (onder het xiphoid-proces), open vervolgens de buik van de muis en verzamel de intraperitoneale vloeistof met een spuit (gedefinieerd als "volume 1"). Meet vervolgens het gewicht van een schoon en droog katoen en plaats het katoen in de buikholte van de muizen om de resterende intraperitoneale vloeistof te absorberen. Meet ten slotte het katoengewicht opnieuw.
OPMERKING: De gewichtstoename van katoen is gelijk aan het gewicht van de resterende intraperitoneale vloeistof. Reken vervolgens om naar het verkregen volume (soortelijk gewicht: 1 g/cm3; gedefinieerd als "volume 2"). Het uiteindelijke dialysaatvolume is volume 1 plus volume 2. - Gebruik 0,5 ml dialysaatmonster (einddialysaat) om de glucoseconcentratie te meten. Dit is de uiteindelijke glucoseconcentratie van dialysaten.
- Bereken de netto ultrafiltratie met behulp van de formule15:
- Bereken de peritoneale permeabiliteit met behulp van de volgende formule15:
4. Weefselvoorbereiding van de buikwandspier en lever en histologische analyse
- Offer de muizen op via hartpunctie (flebotomie)3,16.
- Snijd de buikwand (1 cm x 1 cm) en totale hepatectomie. Fixeer de buikwand en leverweefsels van de muizen 's nachts in 10% neutraal gebufferd formaline.
- Bereid 3 μm dikke paraffinesecties van de buikwandspier en lever voor en voer histologische analyse uit volgens eerder gepubliceerd rapport17.
- Evalueer het pariëtale peritoneum van de buikwand en het viscerale peritoneum van de leveroppervlakken van de muizen met behulp van morfometrie18.
- Voer statistische analyses uit met behulp van statistieken en grafische software (zie Materiaaltabel). Druk alle gegevens uit als gemiddelde ± SD en analyseer op statistische significantie met behulp van een t-test19. Definieer waarden met P < 0,05 als significante resultaten.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
In figuur 1A,B was het pariëtale peritoneum van de buikwand aanzienlijk dikker en fibrotischer onder Masson's trichrome kleuring17, wat aangeeft dat in de CG-blootgestelde groep peritoneale fibrose ernstiger is dan in de controlezoutgroep (NS). In figuur 2A,B was het viscerale peritoneum van de leveroppervlakken ook aanzienlijk dikker en fibrotischer, wat bewijst dat in de CG-blootgestelde groep peritoneale fibrose ernsti...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In deze studie wordt een muis PD-model gepresenteerd door i.p. injectie van CG, en de resultaten toonden peritoneale fibrose en functionele achteruitgang in dit model, dat de toestand van de PD-patiënt nabootste.
Er zijn verschillende kritieke stappen in het protocol. Ten eerste moet voor het uitvoeren van een i.p. injectie van CG of NS de buikwandhuid van de muis worden opgepakt met een tang om door punctie geïnduceerde intraperitoneale orgaanschade te voorkomen. Ten tweede, bij het verzamele...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
We bedanken Shin-Han Tseng oprecht voor de kritische discussie en gedeeltelijke uitvoering van het onderzoek. Deze studie werd ondersteund door EDAHP110003 en NCKUEDA110002 van de Research Foundation of E-DA Hospital en de National Cheng Kung University, Taiwan.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 0.9% Normal Saline | Y F CHEMICAL CORP., New Taipei City, Taiwan | - | |
| 10% neutraal gebufferde formaline | Taiwan Burnett International Co., Ltd., Taipei City, Taiwan | 00002A | |
| Automatische biochemische analyzer | Hitachi Ltd., Tokyo, Japan | Labospect Series 008 | voor het bepalen van glucoseconcentratie |
| Chlorhexidine digluconaat oplossing, 20% in H2O | Sigma-Aldrich, MO, USA | C9394 | verdund tot 0,1% met 15% ethanol voor injectie |
| Ethanol | Avantor Performance Materials, LLC, PA, USA | BAKR8006-05 | verdund tot 15% met fysiologische zoutoplossing voor werkconcentratie |
| Glucose (Dianeal) | Baxter International, Inc., IL, USA | FNB9896 | Commerciële dialyseoplossing (4,25%) |
| GraphPad Prism 8.0 | GraphPad Software, Inc., CA, US | ||
| L-type Glu 2-assay | FUJIFILM Wako, Japan | 461-32403 | |
| Xylazine 20 | Juily Pharmaceutical Co., Ltd., New Taipei City, Taiwan | - | |
| Zoletil 50 | Virbac Laboratories, Carros, Frankrijk | - |
Referenties
- Han, S. H., et al. Improving outcome of CAPD: twenty-five years' experience in a single Korean center. Peritoneal Dialysis International. 27 (4), 432-440 (2007).
- Kawaguchi, Y., Hasegawa, T., Nakayama, M., Kubo, H., Shigematu, T. Issues affecting the longevity of the continuous peritoneal dialysis therapy. Kidney International Supplements. 62, 105-107 (1997).
- Lee, Y. C., et al. Vitamin D can ameliorate chlorhexidine gluconate-induced peritoneal fibrosis and functional deterioration through the inhibition of epithelial-to-mesenchymal transition of mesothelial cells. BioMed Research International. 2015, 595030(2015).
- Nakamoto, H., Kawaguchi, Y., Suzuki, H. Is technique survival on peritoneal dialysis better in Japan. Peritoneal Dialysis International. 26 (2), 136-143 (2006).
- Schaefer, F., Klaus, G., Muller-Wiefel, D. E., Mehls, O. Current practice of peritoneal dialysis in children: results of a longitudinal survey. Mid European Pediatric Peritoneal Dialysis Study Group (MEPPS). Peritoneal Dialysis International. 19, Suppl 2 445-449 (1999).
- Woodrow, G., Turney, J. H., Brownjohn, A. M. Technique failure in peritoneal dialysis and its impact on patient survival. Peritoneal Dialysis International. 17 (4), 360-364 (1997).
- Schmidt, D. W., Flessner, M. F. Pathogenesis and treatment of encapsulating peritoneal sclerosis: basic and translational research. Peritoneal Dialysis International. 28, Suppl 5 10-15 (2008).
- Augustine, T., Brown, P. W., Davies, S. D., Summers, A. M., Wilkie, M. E. Encapsulating peritoneal sclerosis: clinical significance and implications. Nephron Clinical Practice. 111 (2), 149-154 (2009).
- Di Paolo, N., Nicolai, G. A., Garosi, G. The peritoneum: from histological studies to mesothelial transplant through animal experimentation. Peritoneal Dialysis International. 28, Suppl 5 5-9 (2008).
- Fusshoeller, A. Histomorphological and functional changes of the peritoneal membrane during long-term peritoneal dialysis. Pediatric Nephrology. 23 (1), 19-25 (2008).
- Goffin, E. Peritoneal membrane structural and functional changes during peritoneal dialysis. Seminars in Dialysis. 21 (3), 258-265 (2008).
- Ito, T., Yorioka, N. Peritoneal damage by peritoneal dialysis solutions. Clinical and Experimental Nephrology. 12 (4), 243-249 (2008).
- Io, K., et al. SAHA suppresses peritoneal fibrosis in mice. Peritoneal Dialysis International. 35 (3), 246-258 (2015).
- Yoh, K., Ojima, M., Takahashi, S. Th2-biased GATA-3 transgenic mice developed severe experimental peritoneal fibrosis compared with Th1-biased T-bet and Th17-biased RORgammat transgenic mice. Experimental Animals. 64 (4), 353-362 (2015).
- Karl, Z. J. T., et al. Peritoneal Equilibration Test. Peritoneal Dialysis International. 7 (3), 138-148 (1987).
- Lee, Y. C., et al. The clinical implication of vitamin D nanomedicine for peritoneal dialysis-related peritoneal damage. International Journal of Nanomedicine. 14, 9665-9675 (2019).
- Goldner, J. A. Modification of the masson trichrome technique for routine laboratory purposes. The American Journal of Pathology. 14 (2), 237-243 (1938).
- Cheng, F. Y., et al. Novel application of magnetite nanoparticle-mediated vitamin D3 delivery for peritoneal dialysis-related peritoneal damage. International Journal of Nanomedicine. 16, 2137-2146 (2021).
- Ross, A., Willson, V. L. Basic and Advanced Statistical Tests: Writing Results Sections and Creating Tables and Figures. , SensePublishers. 13-16 (2017).
- Suga, H., et al. Preventive effect of pirfenidone against experimental sclerosing peritonitis in rats. Experimental and Toxicologic Pathology. 47 (4), 287-291 (1995).
- Ishii, Y., et al. An experimental sclerosing encapsulating peritonitis model in mice. Nephrology Dialysis Transplantation. 16 (6), 1262-1266 (2001).
- Nishino, T., et al. Antisense oligonucleotides against collagen-binding stress protein HSP47 suppress peritoneal fibrosis in rats. Kidney International. 64 (3), 887-896 (2003).
- Mishima, Y., et al. Enhanced expression of heat shock protein 47 in rat model of peritoneal fibrosis. Peritoneal Dialysis International. 23 (1), 14-22 (2003).
- Kushiyama, T., et al. Effects of liposome-encapsulated clodronate on chlorhexidine gluconate-induced peritoneal fibrosis in rats. Nephrology Dialysis Transplantation. 26 (10), 3143-3154 (2011).
- Nishino, T., et al. Involvement of lymphocyte infiltration in the progression of mouse peritoneal fibrosis model. Renal Failure. 34 (6), 760-766 (2012).
- Lua, I., Li, Y., Pappoe, L. S., Asahina, K. Myofibroblastic conversion and regeneration of mesothelial cells in peritoneal and liver fibrosis. The American Journal of Pathology. 185 (12), 3258-3273 (2015).
- Kitamura, M., et al. Epigallocatechin gallate suppresses peritoneal fibrosis in mice. Chemico-Biological Interactions. 195 (1), 95-104 (2012).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
