Elektroporatie van plasmide-DNA in skeletspieren is een haalbare methode om genexpressie te moduleren zonder de spiercontractiliteit bij muizen in gevaar te brengen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Elektroporatie van plasmide-DNA in de skeletspieren van de muis
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Voorbijgaande genexpressiemodulatie in muizenskeletspieren door plasmide-elektroporatie is een nuttig hulpmiddel voor het beoordelen van normale en pathologische fysiologie. Overexpressie of knockdown van doelgenen stelt onderzoekers in staat om individuele moleculaire gebeurtenissen te manipuleren en zo de mechanismen die van invloed zijn op spiermassa, spiermetabolisme en contractiliteit beter te begrijpen. Bovendien stelt elektroporatie van DNA-plasmiden die fluorescerende tags coderen onderzoekers in staat om veranderingen in subcellulaire lokalisatie van eiwitten in skeletspieren in vivo te meten. Een belangrijke functionele beoordeling van de skeletspieren omvat de meting van spiercontractiliteit. In dit protocol tonen we aan dat hele spiercontractiliteitsstudies nog steeds mogelijk zijn na plasmide-DNA-injectie, elektroporatie en genexpressiemodulatie. Het doel van deze instructieprocedure is om de stapsgewijze methode van DNA-plasmide-elektroporatie in de skeletspieren van muizen te demonstreren om de opname en expressie in de myofiberen van de tibialis anterieure en extensor digitorum longusspieren te vergemakkelijken, evenals om aan te tonen dat de contractiliteit van de skeletspier niet wordt aangetast door injectie en elektroporatie.
Inleiding
Plasmide DNA-elektroporatie in skeletspieren in vivo is een belangrijk hulpmiddel voor het beoordelen van veranderingen in de skeletspierfysiologie en moleculaire signalering door genexpressie te moduleren in een verscheidenheid aan fysiologische en pathofysiologische omstandigheden 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Experimentele genoverdracht in de skeletspieren werd al in 1990 aangetoond door Wolff et al., waarbij zowel RNA als DNA met succes werden overgedragen zonder elektroporatie, en luciferase-expressie gedurende ten minste 2 maanden werd gehandhaafd10. De relatief lage transfectie-efficiëntie met alleen injectie is problematisch, en Aihara en Miyazaki toonden in 1998 een verhoogde genoverdracht met elektroporatie door een pCAGGS-IL-5-construct in de tibialis anterieure (TA) spier te elektropoderen en serum IL-5 expressie11 te meten. Sinds die tijd hebben veel studies de werkzaamheid van verschillende DNA-concentraties, volumes en elektroporatieparameters onderzocht om maximale genoverdrachtsefficiëntie te garanderen. Mir et al. testten verschillende elektroporatieparameters, waaronder spanning, pulsgetal, pulsduur en frequentie, evenals DNA-concentratie, en stelden vast dat een grotere spanning, pulsgetal en DNA-concentratie allemaal bijdroegen aan een verhoogde elektroporatie-efficiëntie12. Een belangrijk voorbehoud bij een hoge elektroporatiespanning is dat, hoewel het een verhoogde DNA-opname in myofiberen vergemakkelijkt, het ook spierschade veroorzaakt, wat de resultaten kan verstoren. Schertzer et al. toonden aan dat elektroporatie bij 200 V schade veroorzaakte in ongeveer 50% van de myofiberen 3 dagen na elektroporatie, terwijl slechts 10% van de myofiberen beschadigd was bij 50 V13. We hebben rekening gehouden met de variabelen die van invloed zijn op efficiënte DNA-overdracht versus spierschade en ontdekten dat een spanning van 125 V per centimeter remklauwbreedte voldoende is om effectieve genoverdracht te bereiken.
Analyse van het dwarsdoorsnedegebied van spiervezels en de contractiliteit van de hele spier na elektroporatie zijn belangrijke aspecten van de methode voor het meten van veranderingen in spiergrootte en -functie als gevolg van genmodulatie. Wij en anderen hebben eerder aangetoond dat elektroporatie van controlevectoren alleen geen afname van het myofibergebied veroorzaakt. Het groene fluorescerende eiwit (EGFP) construct was een nuttige fluorescerende indicator van DNA-transfectie in deze studies13,14. Een aantal studies hebben de in situ contractiliteit van de TA na elektroporatie onderzocht en vonden wisselende resultaten. Eén studie toonde aan dat 75 V /cm elektroporatie ongeveer 30% vermindering van de tetanische kracht veroorzaakte 3 dagen na elektroporatie, en 7 dagen na elektroporatie was de tetanische kracht terug op het controleniveau, terwijl 50 V / cm elektroporatie kracht13,15 niet in gevaar bracht. Een andere studie toonde aan dat er een verlies van 30% van tetanische kracht was 3 uur na 180 V / cm elektroporatie, die na 7 dagen herstelde tot de schijnkrachtniveaus16.
In de volgende gedetailleerde procedure demonstreren we injectie en elektroporatie van een pcDNA3-EGFP plasmide in de TA- en extensor digitorum longus (EDL) spieren van muizen. We tonen ook aan dat deze methode geen invloed heeft op de contractiliteit van de hele spieren van EDL. Het doel is om een efficiënte opname van plasmide in myofiberen aan te tonen zonder functieverlies te veroorzaken.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle experimenten met dieren werden uitgevoerd aan het Penn State College of Medicine, goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van Penn State University, en uitgevoerd in overeenstemming met de ethische normen die zijn vastgelegd in de Verklaring van Helsinki van 1964 en de latere wijzigingen ervan. Voor deze procedure werden 12 weken oude vrouwelijke C57BL/6-muizen gebruikt. Alle chirurgische hulpmiddelen werden geautoclaveerd voor steriliteit voorafgaand aan experimenten.
1. TA en EDL injectie/elektroporatie voorbereiding
OPMERKING: Deze stappen zijn identiek voor TA- en EDL-injectie/ elektroporatievoorbereiding.
- Purify expressie plasmide constructen tot een concentratie van 1 μg/μL verdund in steriele PBS voorafgaand aan het experiment. Voor deze procedure werd een in de handel verkrijgbare endotoxinevrije zuiveringskit gebruikt om pcDNA3-EGFP (GFP) of pcDNA3 lege vector (controle) te zuiveren.
- Bereken de plasmideconcentratie om te zorgen voor een adequaat injectievolume (TA 50 μg DNA in 50 μL steriel PBS; EDL 10 μg DNA in 10 μL steriele PBS) en aliquot monsters.
- Programmeer de elektroporatorinstellingen door het keuzewiel te gebruiken en het wiel in te drukken om de parameters als volgt te kiezen: Modus - LV, Spanning - 12,5 V / mm (aan te passen op het moment van injectie), pulslengte - 20 ms, aantal pulsen - 5, interval - 200 ms, polariteit - unipolair.
- Verdoof de muizen met isofluraangas. Plaats de muizen in een inductiedoos met 5% isofluraan. Bevestig het chirurgische vlak van anesthesie door de afwezigheid van de teenknijpenreflex met behulp van een tang en verlaag isofluraan tot 2% onderhoudsdosis. Breng muizen over naar een geschikte neuskegel die rust op een circulerende waterplaat bij 37 °C voor de rest van de procedure.
- Verwijder het haar van beide achterpoten met behulp van kleine tondeuses. Schrob de onderste ledematen met afwisselend 70% ethanol/betadine om het injectiegebied te ontsmetten.
2. TA-injectie/elektroporatie
- Met de muis in rugligging, lokaliseer de TA-pees zichtbaar door de huid aan de zijkant van het onderbeen. Gebruik een microspuit van 50 μL met een afneembare naald van 30 G en steek de naald 1-2 mm superieur aan de myotendineuze overgang in een ondiepe hoek van 5° totdat de naald het superieure uiteinde van de spier bereikt.
OPMERKING: Injectie in het midden van de spier is het doel. - Druk de zuiger langzaam in terwijl u de naald langzaam langs het injectiepad intrekt om 50 μL plasmide-oplossing af te leveren. De spier moet opzwellen.
- Stel de timer in op 1 min en meet de dikte van het been bij de TA. Afhankelijk van de grootte van de muis kan dit van 5-10 mm zijn. Stel de remklauwelektroden in op de gemeten dikte en stel de elektroporatorspanning in op 12,5 V/mm.
- Plaats na 1 minuut de remklauwelektroden rond de onderste ledemaat. De elektroden moeten goed zitten, maar niet te strak. Lever 5 blokgolfpulsen, met intervallen van 20 ms en 200 ms (de spier moet bij elke puls trillen).
- Herhaal dit met de alternatieve ledemaat met behulp van de controlevector.
- Haal de muis uit de narcose en laat hem herstellen op een verwarmingskussen dat is ingesteld op 37 °C. Eenmaal hersteld, brengt u de muis terug naar zijn kooi.
3. EDL-injectie/elektroporatie
- Met de muis in rugligging, lokaliseer het scheenbeen voorste kam visueel en door zachte palpatie.
- Maak met behulp van een scalpel een ondiepe incisie door de huid aan de laterale kant van de voorste kuif van het scheenbeen 5 mm inferieur aan de knie tot 2 mm superieur aan de TA myotendineuze overgang.
- Gebruik een kleine schaar om de fascia stomp te ontleden, waardoor de TA-spier wordt blootgesteld.
- Nogmaals, met behulp van stompe dissectie met een schaar, scheidt u de TA-spier voorzichtig van het scheenbeen door de spier zijdelings te trekken, waardoor de EDL wordt blootgesteld. Kleine, gebogen tangen kunnen worden gebruikt om de TA tijdens de procedure vrij te houden van de EDL.
- Gebruik een microspuit van 50 μL met een afneembare naald van 30 G en steek de naald in de lengterichting in de EDL totdat de naald het superieure uiteinde van de spier bereikt.
- Druk de zuiger langzaam in terwijl u de naald langzaam langs het injectiepad intrekt om 10 μL van de plasmide-oplossing te injecteren (spier moet opzwellen).
- Stel een timer in voor 1 min en meet de dikte van het been bij de EDL. Afhankelijk van de grootte van de muis kan dit van 5-10 mm zijn. Stel de remklauwelektroden in op de gemeten dikte en stel de elektroporatorspanning in op 12,5 V/mm.
- Plaats na 1 minuut de remklauwelektroden rond de onderste ledemaat. De elektroden moeten goed zitten, maar niet te strak. Lever 5 blokgolfpulsen, met intervallen van 20 ms en 200 ms (spier moet bij elke puls trillen).
- Sluit de incisie met behulp van wegwerp 4/0 niet-absorbeerbare nylon hechtingen.
- Herhaal dit met de alternatieve ledemaat of laat de ledemaat onaangeroerd als absolute controle.
- Haal de muis uit de narcose en laat hem herstellen op een verwarmingskussen dat is ingesteld op 37 °C. Dien een geschikt subcutaan analgeticum toe onmiddellijk na de operatie en 12-24 uur na de operatie. Eenmaal hersteld, brengt u de muis terug naar zijn kooi.
OPMERKING: Eerdere studies hebben een spiercontractiliteitstekort in de TA aangetoond onmiddellijk na elektroporatie en dat contractiel herstel optreedt in de loop van 3 dagen13,15. Om deze reden wordt de analyse van zowel de TA- als de EDL-spieren voor histologie, eiwitexpressie of spiercontractiliteit 3-10 dagen na elektroporatie uitgevoerd. Langdurige expressie van EGFP is waargenomen tot 3 weken na de procedure13.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Elektroporatie om genoverdracht in skeletspieren te vergemakkelijken is een nuttige techniek die wordt gebruikt om veranderingen in de spierfysiologie te evalueren. We hebben een gedetailleerde, stapsgewijze procedure gedemonstreerd om efficiënte genoverdracht in zowel de TA- als de EDL-spieren te bereiken. Verschillen in transfectie-efficiëntie treden op als gevolg van een aantal variabelen. Onder deze variabelen zijn elektroporatieparameters (pulsen, spanning, pulsduur, enz.), genconstructgrootte en concentratie / volu...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In vivo genoverdracht in skeletspieren versterkt door elektroporatie is een nuttig en relatief eenvoudig hulpmiddel voor het moduleren van eiwitexpressie in spieren. We hebben de stappen getoond die nodig zijn om een efficiënte genoverdracht in de EDL- en TA-spieren te bereiken en hebben aangetoond dat contractiliteitsmeting van de EDL levensvatbaar is na de procedure. Deze techniek vereist geen meer gecompliceerde virale vectoren en maakt de vergelijking mogelijk van getransfecteerde en niet-getransfecteerde sp...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
B.A.H. en D.L.W. claimen geen belangenconflicten.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 4-0 Nylon suture (non-absorbable) | Ethicon | 662G | Sutuur om huid incisie te sluiten |
| 50µl Hamilton-spuit | Hamilton | 80501 | microspuit |
| C57BLl/6NHsd muizen | Envigo | 044 | 12 weken oude vrouwelijke muizen gebruikt voor experimenten |
| Caliper Elektrode | BTX | 45-0102 | 1.0cm x 1.0cm roestvrij staal |
| Dynamische Spier Controle Data Acquisitie/analyse | Aurora Scientific | 605A | Software gebruikt voor spiercontractiliteitsmeting en -analyse |
| ECM 830 Elektroporatie Systeem | BTX | 45-0662 | elektroporatietoestel |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | Plasmid zuiveringskit |
| Extra Smalle Schaartjes | Fine Science Tools | 14088-10 | Schaar voor scherpe dissectie |
| Kracht Transducer | Aurora Scientific | 407A | Om kracht van EDL te meten |
| Micro-Masquito Hemastats | Fine Science Tools | 13010-12 | Hemastats voor het vernaaien |
| pcDNA3.1 zoogdier expressie vector | Fisher Scientific | V79020 | Controle Vector |
| pcDNA3-EGFP expressie plasmide | Addgene | 13031 | Plasmiede voor GFP expressie |
| Semken gebogen pincetten | Fine Science Tools | 11009-13 | Pincet voor chirurgie |
| Chirurgische bladen roestvrij staal no. 10 | Becton Dickinson | 37 1210 | Scalpelbladen |
| Tissue-Tek O.C.T. media | VWR | 25608-930 | Bevroren media voor histologie |
| Wheat Germ Agglutinin- Texas Red | Thermo-Fisher Scientific | W21405 | Membraankleuring voor spierdoorsnede |
Referenties
- Dodd, S., Hain, B., Judge, A. Hsp70 prevents disuse muscle atrophy in senescent rats. Biogerontology. 10, 605-611 (2009).
- Dodd, S. L., Gagnon, B. J., Senf, S. M., Hain, B. A., Judge, A. R. Ros-mediated activation of NF-kappaB and Foxo during muscle disuse. Muscle and Nerve. 41 (1), 110-113 (2010).
- Dodd, S. L., Hain, B., Senf, S. M., Judge, A. R. Hsp27 inhibits IKKβ-induced NF-κB activity and skeletal muscle atrophy. The FASEB Journal. 23 (10), 3415-3423 (2009).
- Hain, B. A., Dodd, S. L., Judge, A. R. IkappaBalpha degradation is necessary for skeletal muscle atrophy associated with contractile claudication. American Journal of Physiology Regulatory, Integregrative and Comparative Physiology. 300 (3), 595-604 (2011).
- Houston, F. E., et al. Heat shock protein 70 overexpression does not attenuate atrophy in botulinum neurotoxin type A-treated skeletal muscle. Journal of Applied Physiology. 119 (1), 83-92 (2015).
- Reed, S. A., Sandesara, P. B., Senf, S. M., Judge, A. R. Inhibition of FoxO transcriptional activity prevents muscle fiber atrophy during cachexia and induces hypertrophy. The FASEB Journal. 26 (3), 987-1000 (2012).
- Senf, S. M., Dodd, S. L., McClung, J. M., Judge, A. R. Hsp70 overexpression inhibits NF-kappaB and Foxo3a transcriptional activities and prevents skeletal muscle atrophy. The FASEB Journal. 22 (11), 3836-3845 (2008).
- Blaveri, K., et al. Patterns of repair of dystrophic mouse muscle: studies on isolated fibers. Developmental Dynamics. 216 (3), 244-256 (1999).
- Fewell, J. G., et al. Gene therapy for the treatment of hemophilia B using PINC-formulated plasmid delivered to muscle with electroporation. Molecular Therapy. 3 (4), 574-583 (2001).
- Wolff, J. A., et al. Direct gene transfer into mouse muscle in vivo. Science. 247 (4949), 1465-1468 (1990).
- Aihara, H., Miyazaki, J. Gene transfer into muscle by electroporation in vivo. Nature Biotechnology. 16 (9), 867-870 (1998).
- Mir, L. M., et al. High-efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (8), 4262-4267 (1999).
- Schertzer, J. D., Plant, D. R., Lynch, G. S. Optimizing plasmid-based gene transfer for investigating skeletal muscle structure and function. Molecular Therapy. 13 (4), 795-803 (2006).
- Hain, B. A., Xu, H., Waning, D. L. Loss of REDD1 prevents chemotherapy-induced muscle atrophy and weakness in mice. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 12 (6), 1597-1612 (2021).
- Schertzer, J. D., Lynch, G. S. Plasmid-based gene transfer in mouse skeletal muscle by electroporation. Methods in Molecular Biology. 433, 115-125 (2008).
- Roche, J. A., et al. Physiological and histological changes in skeletal muscle following in vivo gene transfer by electroporation. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 301 (5), 1239-1250 (2011).
- Hain, B. A., et al. Zoledronic Acid Improves Muscle Function in Healthy Mice Treated with Chemotherapy. Journal of Bone and Mineral Research. 35 (2), 368-381 (2020).
- Hain, B. A., et al. REDD1 deletion attenuates cancer cachexia in mice. Journal of Applied Physiology. 131 (6), 1718-1730 (2021).
- Hain, B. A., Xu, H., Wilcox, J. R., Mutua, D., Waning, D. L. Chemotherapy-induced loss of bone and muscle mass in a mouse model of breast cancer bone metastases and cachexia. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle Rapid Communications. 2 (1), (2019).
- Waning, D. L., et al. Excess TGF-beta mediates muscle weakness associated with bone metastases in mice. Nature Medicine. 21, 1262-1271 (2015).
- Bonetto, A., Andersson, D. C., Waning, D. L. Assessment of muscle mass and strength in mice. Bonekey Reports. 4, 732(2015).
- Senf, S. M., Dodd, S. L., Judge, A. R. FOXO signaling is required for disuse muscle atrophy and is directly regulated by Hsp70. American Journal of Physiology Cell Physiology. 298 (1), 38-45 (2010).
- Rana, Z. A., Ekmark, M., Gundersen, K. Coexpression after electroporation of plasmid mixtures into muscle in vivo. Acta Physiologica. 181 (2), 233-238 (2004).
- Sokolowska, E., Blachnio-Zabielska, A. U. A Critical Review of Electroporation as A Plasmid Delivery System in Mouse Skeletal Muscle. Integrative Journal of Molecular Science. 20 (11), (2019).
- Molnar, M. J., et al. Factors influencing the efficacy, longevity, and safety of electroporation-assisted plasmid-based gene transfer into mouse muscles. Molecular Therapy. 10 (1), 447-455 (2004).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
