Method Article

Cryo-elektronentomografie Gegevensverzameling op afstand en subtomogrammiddeling

DOI:

10.3791/63923

⸱

July 12th, 2022

 ,  ,  , 
1Electron Bio-Imaging Centre, Diamond Light Source Ltd, Harwell Science & Innovation Campus, 2Division of Structural Biology, Wellcome Trust Centre for Human Genetics, University of Oxford, 3Chinese Academy of Medical Sciences Oxford Institute, University of Oxford

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het huidige protocol beschrijft cryo-elektronentomografie op afstand met hoge resolutie data-acquisitie met behulp van Tomo5 en daaropvolgende gegevensverwerking en subtomogrammiddeling met behulp van emClarity. Apoferritine wordt als voorbeeld gebruikt om gedetailleerde stapsgewijze processen te illustreren om een cryo-ET-structuur met een resolutie van 2,86 Å te bereiken.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cryo-elektronentomografie (cryo-ET) is de laatste jaren in een stroomversnelling geraakt, vooral sinds de introductie van directe elektronendetectoren, verbeterde geautomatiseerde acquisitiestrategieën, voorbereidende technieken die de mogelijkheden uitbreiden van wat de elektronenmicroscoop met hoge resolutie kan fotograferen met behulp van cryo-ET en nieuwe subtomogrammiddelingssoftware. Bovendien is data-acquisitie steeds gestroomlijnder geworden, waardoor het voor veel gebruikers toegankelijker is geworden. De SARS-CoV-2-pandemie heeft de externe cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) gegevensverzameling verder versneld, vooral voor cryo-EM met één deeltje, in veel faciliteiten wereldwijd, waardoor gebruikers tijdens de pandemie ononderbroken toegang hebben tot state-of-the-art instrumenten. Met de recente ontwikkelingen in Tomo5 (software voor 3D-elektronentomografie) is cryo-ET-gegevensverzameling op afstand robuust en gemakkelijk te hanteren vanaf elke locatie ter wereld. Dit artikel is bedoeld om een gedetailleerde walk-through te bieden, te beginnen met de gegevensverzamelingsopstelling in de tomografiesoftware voor het proces van een (externe) cryo-ET-gegevensverzamelingssessie met gedetailleerde probleemoplossing. Het (remote) dataverzamelingsprotocol wordt verder aangevuld met de workflow voor structuurbepaling bij near-atomaire resolutie door subtomogrammiddeling met emClarity, met apoferritine als voorbeeld.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cryogene elektronenmicroscopie (cryo-EM) is algemeen bekend om een renaissanceperiode te hebben meegemaakt, waardoor het een kern en centraal bruikbaar hulpmiddel in de structurele biologie werd. De ontwikkeling en het gebruik van directe elektronendetectoren 1,2,3, verbeterde microscopen en elektronenbronnen 3,4,5, verbeteringen in automatisering/doorvoer 6,7,8,9 en computationele vooruitgang in analyse van enkele deeltjes 10,11,12,13 ,14 en tomografie 15,16,17 zijn allemaal gedeeltelijk verantwoordelijk voor het recente succes van de techniek. Deze technologische drivers hebben het vermogen van cryo-EM ontwikkeld om biologische macromoleculaire structuren op te lossen onder cryogene en inheemse omstandigheden. De resoluties die gemakkelijk te verkrijgen zijn, zijn voldoende voor atomair nauwkeurige modellering en hebben de techniek naar de voorgrond van de structurele biologie arena gebracht. Een reductionistische benadering van het uitdrukken en zuiveren van een biologisch doelwit van belang is al lang succesvol gebleken in macromoleculaire kristallografie (MX) voor fundamenteel biologisch onderzoek, medicijnontdekking en translationele wetenschap. In dezelfde aanpak kan cryo-EM nu resultaten leveren die parallel lopen met MX-studies met hoge resolutie. Het huidige grote succes in de cryo-EM-tak van de structurele biologie wordt single particle analysis (SPA) genoemd, waarbij 2D-projectiebeelden worden verkregen die typisch zijn voor een gezuiverd eiwitmonster18 om duizenden weergaven van een biologisch macromolecuul te verkrijgen19. Deze afbeeldingen (1) bevatten informatie uit een reeks weergaven die de oriëntaties van het doelwit in de 3D-ruimte volledig weergeven en (2) leggen de objectconformatie heterogeniteit vast, die later kan worden gescheiden en onderzocht.

Een alternatieve benadering voor het verkrijgen van deze 2D-projectiebeelden van biologische monsters, zelfs in situ en zonder zuivering, is cryo-elektronentomografie (cryo-ET). Cryo-ET maakt een reeks beelden van hetzelfde object onder gekantelde hoeken door het monster mechanisch te roteren. De 2D-projecties verzameld in SPA, die de hoekige poses van het molecuul van belang vertegenwoordigen, worden dus inherent verzameld als onderdeel van het cryo-ET-beeldvormingsexperiment20. Tomografische tilt-reeksen worden vervolgens gereconstrueerd tot een tomogram dat 3D-representaties van de afgebeelde macromoleculaire complexen bevat. De aard van tomografische gegevensverzameling vermindert tot op zekere hoogte de afhankelijkheid van middeling om een volledige 3D-weergave van een molecuul uit een verzameling 2D-afbeeldingen te bereiken. Vanwege de huidige faseontwerpen wordt het monster echter meestal gekanteld van −60° tot +60°, waardoor er een ontbrekende wig21 aan informatie overblijft in de tomografische 3D-reconstructie.

De 3D-reconstructies in een enkel tomogram hebben dan een ontbrekende wig van informatie en een laag signaal naar ruis. Individuele macromoleculen kunnen als subtomogrammen worden geëxtraheerd en samen worden gemiddeld om dit aan te pakken. Waar elk macromolecuul in een subtomogram in een andere oriëntatie wordt gevonden, is de ontbrekende wig in elk subtomogram van het doelobject anders georiënteerd, dus gemiddeld over vele kopieën vult informatie in vanwege de ontbrekende wig. Recente ontwikkelingen in beeldverwerking hebben ook geprobeerd om neurale netwerken van kunstmatige intelligentie te trainen om de ontbrekende wig op te vullen met zinvolle gegevens22. Dit middelingsproces verhoogt ook het signaal naar ruis, vergelijkbaar met het doel van middeling in analyse van enkele deeltjes, zodat de kwaliteit en resolutie van de reconstructie verbeteren. Als het molecuul van belang symmetrie bezit, kan ook dat worden gedefinieerd en gebruikt tijdens het middelen, waardoor de reconstructieresolutie verder wordt verbeterd. De extractie van 3D-volumes van een macromolecuul uit een tomogram in een reeks subtomogrammen en de daaropvolgende verwerking ervan staat bekend als subtomogrammiddeling (STA)23. Wanneer elk subtomogram een unieke kopie van het bestudeerde molecuul vertegenwoordigt, kan elke structurele heterogeniteit worden ondervraagd met behulp van de STA-workflow. Zoals vaak gebruikt in de SPA-workflow, kunnen classificatietechnieken tijdens STA worden gebruikt om de conformatietoestanden van het complex van belang te ontleden. Naast STA die reconstructie met hoge resolutie in cryo-ET mogelijk maakt, maakt deze aanpak de techniek een krachtig hulpmiddel om de structurele mechanismen van macromoleculen in hun oorspronkelijke cellulaire omgeving of van doelen die vaak niet vatbaar zijn voor SPA 24,25,26 te ondervragen.

Elektronentomografie heeft een lange geschiedenis van het bepalen van de 3D-ultrastructuur van cellulaire monsters bij kamertemperatuur27. Het verkrijgen van weergaven door het fysiek kantelen van het monster biedt voldoende informatie voor de 3D-reconstructie van een object op cellulaire lengteschalen en is vooral belangrijk wanneer cellulaire structuren de regelmaat voor gemiddelden missen. Cellen kunnen ook worden ingevroren op substraten voor cryo-ET-beeldvorming aan de celranden waar het monster dun genoeg is om elektrontransparantie te zijn. Onder deze omstandigheden kan STA worden gebruikt om macromoleculaire structuren in een cellulaire omgeving te bepalen, zij het wanneer het monster dun genoeg is om elektrontransparant te zijn28. In combinatie met aanvullende voorbereidende technieken, waaronder cryocorrelatieve licht- en elektronenmicroscopie (cryo-CLEM) en gefocusseerd ionenbundelfrezen (cryo-FIB), kan cryo-ET echter worden gebruikt om in hele cellen onder cryogene omstandigheden in beeld tebrengen 29. Dit brengt de kracht van cryo-ET samen om de cellulaire ultrastructuur te bestuderen met de kracht van STA om de structuren van macromoleculaire complexen in situ te bepalen, terwijl hun cellulaire locatiewordt geïdentificeerd 30 en snapshots worden gemaakt van complexen die betrokken zijn bij dynamische processen31. Het vermogen van de techniek om cellulaire specimens in beeld te brengen en STA in verschillende studies te gebruiken, heeft de kracht van de techniek benadrukt om macromoleculaire structuren in situ op te lossen, zelfs bij resoluties die vergelijkbaar zijn met SPA32. Een ander voordeel wordt gevonden in de kennis van de oorspronkelijke locatie van het macromolecuul, vertegenwoordigd door de uiteindelijke geclassificeerde 3D-reconstructie in het tomogram30. Daarom kan de macromoleculaire structuur worden gecorreleerd met de cellulaire ultrastructuur. Deze waarnemingen over lengteschalen zullen vermoedelijk leiden tot belangrijke bevindingen waarbij structurele mechanismen kunnen worden gecorreleerd met cellulaire veranderingen in de context van functionele studies.

Cryo-ET en STA maken gegevensverzameling mogelijk in drie belangrijke workflows: moleculaire, cellulaire en lamellentomografie. De structuren van gezuiverde macromoleculaire complexen kunnen worden bepaald door cryo-ET door moleculaire tomografie. Het bepalen van eiwitstructuren in hun cellulaire omgeving waar de cel dun genoeg is, kan worden beschreven als cellulaire tomografie. Meer recent, met de ontwikkeling van cryogene targeting en frezen, kunnen dezelfde technieken worden toegepast in lamellatomografieworkflows om de eiwitstructuren diep in de cel in hun oorspronkelijke omgeving te bepalen en tegelijkertijd de cellulaire context te onthullen waarin die eiwitten worden waargenomen. Verschillende strategieën voor gegevensverzameling kunnen worden gebruikt, afhankelijk van de beschikbare softwarepakketten en, belangrijker nog, afhankelijk van de vereiste van het specimen. Moleculaire of niet-hechtende monsters op een koperen TEM-rooster van een gezuiverd eiwit vereisen doorgaans minder behandeling en blijven dus plat en onbeschadigd in ideale gevallen. Elektronentomogrammen kunnen eenvoudig in serie worden opgezet over een gatachtig koolstofraster om snel tientallen tot honderden tomogrammen op een systematische manier te verkrijgen. De eenvoudigste manier voor gebruikers om moleculaire tomografiemonsters op te zetten waar eiwitten overvloedig aanwezig zijn op het raster, zou zijn om Tomo5 te gebruiken (software voor 3D-elektronentomografie die in deze studie wordt gebruikt, zie Tabel van materialen). Andere tomografiesoftware zoals Leginon9 en serialEM6 zijn ook beschikbaar; ze bieden meer installatieopties voor meer gepersonaliseerde benaderingen voor gegevensverzameling, maar zijn complexer en kunnen daarom moeilijker te navigeren zijn, vooral voor gebruikers die nieuw zijn bij tomografie en gebruikers die op afstand toegang hebben tot hun sessie. Voor een faciliteit met een groot en divers gebruikersbestand is Tomo5 eenvoudig te bedienen in een externe omgeving en om gebruikers in te trainen. Voor aanhangende cellen vereisen rasters doorgaans meer verwerkingsstappen en de noodzaak om fragiele gouden rasters te gebruiken, verhoogt de behoefte aan verbeterde zorg bij het omgaan met en verzamelen van gegevens. Om het vinden van een interessant cellulair gebied te vergemakkelijken en occlusie van het raster zelf bij hoge kantelhoeken te voorkomen, is het ook gunstig om grotere maaswijdten te gebruiken, maar ten koste van het feit dat ze inherent kwetsbaarder zijn. Voor lamellenmonsters wordt de kwetsbaarheid van het monster bepaald door de kwaliteit van de lamellen, die variabel kan zijn. Deze factoren verhogen de insteltijd en overwegingen, maar het toegenomen aanpassingsvermogen en de robuustheid maken Tomo5 weer geschikt voor dit type gegevensverzameling. Er bestaan echter gespecialiseerde scenario's voor gegevensverzameling voor elke workflow. BISECT en PACE-tomo (beide uitgevoerd in SerialEM) introduceren de mogelijkheid van gescripte bundelbeeldverschuiving tijdens tomografie-acquisitie om de snelheid van de tomogramverzameling te verhogen28, met name in moleculaire tomografie. Medium vergrotingsmontages (MMM) in SerialEM 6,7,33 kunnen moleculaire functies in alle workflows beter identificeren en nauwkeurig targeten, hoewel deze functies op het moment van schrijven beginnen te worden geïmplementeerd in Tomo5.

Net als SPA worden cryo-ET en STA steeds toegankelijker door de verbeteringen aan acquisitiesoftware en een schat aan beschikbare pakketten voor subtomogrammen met een gemiddelde van 16,17,32,34,35,36,37,38. Bovendien werd tijdens de pandemie het mogelijk maken van externe toegang tot cryo-EM-instrumentatie essentieel voor de voortzetting van de werking van nationale faciliteiten zoals het Electron Bio-Imaging Centre (eBIC) in Diamond Light Source (DLS), VK. Deze ontwikkelingen hebben cryo-ET toegankelijker en robuuster gemaakt voor onderzoekers die de techniek willen gebruiken. Zodra gegevens zijn verkregen, is STA een essentieel hulpmiddel voor het analyseren van terugkerende objecten om reconstructie met maximale resolutie te verkrijgen en de classificatie van macromoleculaire heterogeniteit mogelijk te maken. Het huidige protocol is bedoeld om een gedetailleerde walk-through te geven van het voorbereiden van een cryo-TEM-microscoop voor cryo-ET-gegevensverzameling en hoe subtomogrammiddeling kan worden uitgevoerd met behulp van emClarity op een moleculaire tomografie-dataset van apoferritine als voorbeeld. Het gebruik van emClarity (software voor cryo-elektronentomografie met hoge resolutie en subtomogrammiddeling, zie Materiaaltabel) vereist het uitvoeren van scripts vanaf de opdrachtregel, dus er wordt uitgegaan van een mate van vertrouwdheid met Linux/UNIX-systemen.

De externe verbinding is afhankelijk van de netwerkomgeving in elk instituut/faciliteit. Bij eBIC maakt het externe systeem gebruik van programma's die het mogelijk maken om op afstand gegevens te verzamelen over de specifieke netwerkconfiguratie die bij Diamond wordt gebruikt. Verbinding op afstand met de microscoop wordt mogelijk gemaakt door twee platforms: NoMachine en TeamViewer (zie Materiaaltabel). Met behulp van het programma NoMachine kan de gebruiker inloggen op een extern Windows-bureaublad. Het externe Windows-bureaublad van NoMachine bevindt zich op hetzelfde netwerk als de microscoop en fungeert dus als een virtuele ondersteunings-pc voor de microscoop. Vanaf de virtuele ondersteunings-pc maakt de gebruiker verbinding met de microscoop via TeamViewer en biedt directe toegang en controle tot de microscoop-pc met TUI en Tomo.

Het huidige protocol bestaat uit twee delen (stap 1 en stap 2). Stap 1 richt zich op cryo-ET data-acquisitie op afstand met behulp van Tomo5 (software voor 3D-elektronentomografie). De walk-through voor een (externe) sessie legt beelden vast met steeds hogere vergrotingen om de gebruiker uiteindelijk in staat te stellen de tomografiesoftware te richten op specimengebieden voor tomografische gegevensverzameling. Figuur 1 vat dit proces samen. Stap 2 beschrijft cryo-ET STA-gegevensverwerking met behulp van emClarity (software voor cryo-elektronentomografie met hoge resolutie en subtomogrammiddeling). Figuur 9 vat dit proces samen.

Het protocol is bedoeld voor een extern publiek. Het gaat ervan uit dat de persoon fysiek bij de microscoop en het laden van de monsters de directe uitlijningen heeft gedaan en heeft gezorgd voor de cameraafstemming en gain-referentie-acquisitie. Voor dit protocol wordt uitgegaan van een driecondensorlenssysteem met een autoloader. Voor meer gedetailleerde richtlijnen over de tomografiesoftware is een gedetailleerde handleiding van de fabrikant beschikbaar in de Windows Start-knop van waaruit de software is geladen.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De softwarepakketten die in dit onderzoek worden gebruikt, zijn gedeeltelijk vrij beschikbaar (zie Materiaalaftabel).

1. Cryo-ET data-acquisitie op afstand met Behulp van Tomo5

  1. Als de software niet is geladen, begint u met het starten van deze software vanaf de TEM-server-pc (zie Tabel met materialen).
  2. Voer de eerste controles uit en configureer de beeldbewerkingsconditie door Voorinstellingen te selecteren.
    1. Start de sessie-instelling door de parameters voor het verkrijgen van afbeeldingen aan te passen op het tabblad "Voorbereiding" onder Voorinstellingen (Figuur 2A, B).
      1. Pas de "Overzichtsvergroting" aan de raster-vierkante grootte en dosis aan om voldoende tellingen te krijgen.
        OPMERKING: Als de geschikte vergroting onbekend is voor het rastertype, keert u terug naar deze stap nadat u een raster hebt geladen.
      2. "Eucentrische hoogte" en "Zoekvergroting" kunnen hetzelfde zijn. Klik op Zoeken op het tabblad "Tomografie" om posities in te stellen en ervoor te zorgen dat de vergroting voldoende is om het kenmerk van interesse weer te geven en om het gebied "Belichting" en het gebied "Tracking / Focus" in het gezichtsveld (figuur 2C) te passen.
      3. Stel "Belichtingsvergroting" in op de gewenste doelpixelgrootte. Als dit onbekend is, stelt u dit vast door de vergroting aan te passen aan het gewenste gezichtsveld om aan te sluiten bij het interessegebied.
    2. Kopieer de parameters van beeldacquisitie (belichting) naar alle andere voorinstellingen met hoge vergroting (Tracking, Drift, Focus, Thon Ring, Zero Loss,). Om dit te doen, drukt u op Instellen om "Belichting" in te stellen op de microscoop en Krijgen om de "Belichtingsinstellingen" naar alle andere hoge vergrotingen te krijgen nadat u ze afzonderlijk hebt geselecteerd.
      1. Pas de belichtingstijden aan, vooral voor "Focus" en "Tracking" om een passend aantal tellingen te geven, ook rekening houdend met de dikte bij 60 °, wat zowel bij 0° als 60° betekent, zodat voldoende elektronen door het monster gaan om een sterk signaal voor kruiscorrelatie te leveren.
        OPMERKING: Als schatting zijn blootstellingstijden voor "Tracking" en "Focus" gelijk aan de vooraf ingestelde "Exposure" een goede eerste meting. Voor een voorbeeld van een dosisberekening voor de voorinstelling "Blootstelling", zie Figuur 3. Stel de berekende belichtingstijd in voor de voorinstelling "Belichting" in het tabblad "Voorbereiding".
    3. Pas de "Zero Loss Preset" aan om een helderdere en grotere spotgrootte te gebruiken (een grotere spotgrootte komt overeen met een kleiner aantal), omdat dit een hogere dosis nodig heeft.
      OPMERKING: Deze preset kan het beste worden gebruikt om de spleet van het energiefilter uit te lijnen indien aanwezig op de microscoop.
  3. Voer atlasverzameling uit volgens de onderstaande stappen.
    1. Om een atlas te verzamelen, klikt u op Nieuwe sessie op het tabblad "Atlas", stelt u de sessievoorkeuren in, voert u het opslagpad en het uitvoerformaat in en drukt u op Toepassen. Selecteer Screening (figuur 4) en vink vervolgens alle atlassen aan die u wilt aanschaffen. Selecteer Col Valves sluiten om de microscoop zonder toezicht te laten; dit sluit de kolomkleppen nadat alle geselecteerde atlassen zijn verzameld. Als u de vertoning wilt starten, drukt u op de knop Start .
    2. Inspecteer de enkele of meerdere atlassen op doelen door te klikken op het raster in het linkerdeelvenster onder "Screening" (figuur 4), klik vervolgens met de linkermuisknop en sleep de muis om rond te bewegen en de middelste scroll om in en uit te zoomen. Kies raster voor doelinstellingen, selecteer het en klik op Voorbeeld laden vanuit de software.
    3. Voor de kalibraties van de afbeeldingsverschuiving gebruikt u het tabblad Atlasscreening om binnen het geladen raster te navigeren. Zoek een identificeerbaar kenmerk dat herkenbaar is bij alle vergrotingsvoorinstellingen, d.w.z. een ijskristal dat overlapt met een rand van een gat of een ander herkenbaar kenmerk (figuur 5). Ga met de rechtermuisknop naar dat vierkant en vervolgens naar dat vierkant en vervolgens "Verplaats het podium naar Rasterplein".
      OPMERKING: De fase moet zich op eucentrische hoogte bevinden om beeldverschuivingskalibraties correct te implementeren.
  4. Voer beeldverschuivingskalibratie uit.
    1. Stel op het tabblad "Autofuncties" (figuur 6) de voorinstelling in op "Eucentrische hoogte", navigeer naar "Auto-Eucentric by Stage Tilt" en druk op Start. Controleer het statusvenster om ervoor te zorgen dat het vinden van de eucentrische hoogte succesvol is en houd de positieve en negatieve kantelbeelden in de gaten; ze moeten correleren.
      OPMERKING: Vanaf versie 5.8 van de Tomo-software kan het criterium voor eucentrische hoogteacceptatie worden gewijzigd; de standaardwaarde is 0,25 μm en het instellen op 0,5-0,8 μm geeft meer speelruimte. Waarden zijn afhankelijk van de microscoopprestaties, maar het wordt aanbevolen om ze zo klein mogelijk te maken.
      1. Wanneer u op eucentrische hoogte en in focus bent, centreert u het podium op een functie. Verzamel een voorbeeld met behulp van de voorinstelling "Atlas". Stel alle "Presets" in op het tabblad "Preparation". Verhoog vervolgens de vergroting naar Overzicht > middenfunctie > Voorvertoning, herhaal vervolgens "Zoekvergroting" en ten slotte "Belichtingsvergroting".
    2. Als de functie tijdens het richten gecentreerd bleef, slaat u de kalibraties van de beeldverschuiving over. Als u anders de beeldverschuiving wilt kalibreren, gaat u naar het tabblad "Voorbereiding", selecteert u Image Shift kalibreren en drukt u op Start (afbeelding 5). Hiermee worden lagere vergrotingen iteratief afgestemd op de functie die is gecentreerd bij belichtingsvergroting.
      OPMERKING: Als de initiële vooraf ingestelde "Belichting" in dit stadium niet is gecentreerd, gebruikt de software voor recentering alleen faseverschuiving voor deze stap.
      1. Druk op Doorgaan voor de voorinstelling "Belichting". De volgende getoonde afbeelding is de "Search preset". Om de beeldverschuiving tussen de voorinstellingen te kalibreren, dubbelklikt u met de linkermuisknop in het voorbeeld "Zoeken" naar waar het midden van het voorbeeld "Belichting" zich bevindt en drukt u vervolgens op Opnieuw verwerven (Figuur 5). Klik op Doorgaan om naar het volgende paar voorinstellingen te gaan.
        OPMERKING: Als tijdens deze kalibratie een beeldverschuiving bij atlasvergroting is toegepast, moet u ervoor zorgen dat de atlas opnieuw wordt verkregen nadat de kalibratie van de beeldverschuiving is voltooid. Selecteer de gewenste atlas en druk op Reset geselecteerd in het bovenste paneel op het tabblad "Atlas". Bevestig en begin opnieuw met het verwerven van die atlas.
  5. Voer de tomografie-instelling uit.
    1. Maak de instellingen voor het verzamelen van tomografiegegevens op het tabblad "Tomografie".
      OPMERKING: Tenzij specifiek vermeld, wordt de installatie volledig uitgevoerd op het tabblad "Tomografie".
    2. Start een nieuwe sessie. Kies in "Session Setup" voor biologische monsters Slab-like als het monstertype en selecteer Batch en Lage dosis, selecteer het uitvoerformaat en de opslagmap, voeg desgewenst een e-mailontvanger toe en druk vervolgens op Toepassen.
      OPMERKING: Er is nu een menu-item "Batchposities" beschikbaar (figuur 7A). De momenteel geladen atlas wordt automatisch geïmporteerd. "Overzicht" en "Zoekafbeeldingen" kunnen worden verkregen en opnieuw worden bekeken totdat een nieuw beeld wordt verkregen. Bovendien kunnen vanaf versie 5.8 zoekkaarten van 3 x 3, 4 x 4 en 5 x 5 tegels worden verkregen met "Search Map verwerven" om het vinden en instellen van doelen te vergemakkelijken. Ze komen overeen met een versie van medium vergrotingsmontages.
    3. Om doelen in te stellen, gaat u naar de "Atlaspijl", zoekt u een interessante regio en verplaatst u zich daarheen door de opties te selecteren die met de rechtermuisknop verschijnen. Maak een overzichtsfoto om een goede positie voor eucentrische hoogteverstelling te bevestigen en druk vervolgens op Auto Eucentric; dit zal de eucentrische door fase kantelen routine uitvoeren. Verkrijg vervolgens opnieuw een nieuwe overzichtsafbeelding om de eucentrische hoogte bij te werken.
      OPMERKING: De knop "Autofocus" zou niet nodig moeten zijn als de positie zich op eucentrische hoogte bevindt. Als de eucentrische hoogteafbeelding ver buiten beeld lijkt, is de eucentrische hoogte waarschijnlijk niet correct en moet deze opnieuw worden uitgevoerd (zie het discussiegedeelte voor het oplossen van problemen met eucentrische hoogte).
    4. Controleer het doel met behulp van de voorinstelling "Overzicht" voordat u de eerste positie instelt; selecteer de voorinstelling "Overzicht" en kantel het podium naar ±60° om te controleren op welke afstand van de rasterbalken de posities kunnen worden ingesteld (figuur 8). Voer dit uit door de gewenste kantelhoekwaarde in te voeren in het venster "Tilt instellen" (figuur 8A).
    5. Inspecteer het vierkant "Overzicht" of de verworven "Zoekkaart", ga naar een interessante regio en druk op Zoekopdracht verwerven. Inspecteer de afbeelding "Zoeken". Als het interessegebied niet gecentreerd is, klikt u met de rechtermuisknop op de gewenste positie en herhaalt u Fase hier verplaatsen en Afbeelding verkrijgen. Stel Tilt (°) in op 0,00 (of een andere starthoek die het werkgebied aankan) om de beginhoek van het tomogram te definiëren.
      1. Voer voor het eerste tomogram de naam voor de gewenste naamgevingsconventie voor het tomogram en de onscherpte in om de gewenste onscherptewaarde voor elk tomogram in te stellen.
      2. Optioneel kunnen vanaf Tomo versie 5.8 de onscherptewaarden in één keer systematisch worden gewijzigd; klik daarvoor op Posities selecteren, selecteer de posities die moeten worden gewijzigd of vink het vinkje aan om alle posities te selecteren en klik vervolgens op Focus bijwerken en pas de parameters aan (figuur 7A).
    6. Pas het gebied "Focus" en "Tracking" aan (figuur 2C). Klik met de linkermuisknop om de tracking- en focusgebieden (gele en blauwe cirkels) te slepen. Zorg ervoor dat het volg-/focusgebied (meestal) op koolstof of een andere geschikte trackingfunctie staat, d.w.z. een vergelijkbare functie als de interesseregio; vermijd scheuren, ijsbesmetting, te dikke gebieden en lege gaten.
      1. Wanneer u lege koolstof kiest zonder veel trackingfuncties, moet u ervoor zorgen dat het gebied halverwege het tomogram begint te branden door een voldoende hoge dosis te kiezen voor focus en te volgen om het monster langzaam op hogere hellingen te verbranden. Dit kan gunstig zijn om de trackingnauwkeurigheid te behouden. Zorg ervoor dat het tracking-/focusgebied geen later acquisitiegebied blootlegt.
        OPMERKING: Wees voorzichtig met wat dichtbij is en wat er in de balk zal komen. Vermijd gebieden met functies die ingrijpen bij tracking en/of belichting, inclusief rasterbalken.
    7. Druk op Positie toevoegen zodra alle parameters zijn ingesteld en het gewenste interessegebied en "Focus" en "Tracking" zijn gedefinieerd. Herhaal dit voor nieuwe doelen.
      OPMERKING: Om te controleren of de eucentrische hoogte correct is gekalibreerd voor de batchposities die zijn ingesteld, zijn er verschillende beschikbare strategieën. Het wordt aanbevolen om er een te kiezen op basis van het type tomografiesessie dat wordt uitgevoerd (moleculair, cellulair, lamellen).
    8. Voor moleculaire tomografie, ervan uitgaande dat de rasters vrij vlak zijn en eucentrische hoogte is gedaan in het midden van elk vierkant met doelposities, slaat u de procedure "Alles verfijnen" (of Geselecteerde verfijnen als posities zijn geselecteerd, figuur 7A) over. Als Tomo worstelt met de auto-eucentrische kantelingsroutine, klik dan eventueel op Skip Eucentric.
      1. Voor cellulaire of lamellenmonsters kan elke batchpositie zich op een andere z-hoogte bevinden. Gebruik "Alles verfijnen" om voorzichtig te zijn of vink de optie "Eucentrisch overslaan" niet aan.
        OPMERKING: "Alles verfijnen" zal door alle tomogrammen heen itereren die zijn ingesteld of geselecteerd via "Select Positions"; verfijn de eucentrische hoogte en voer tracking en focus uit vóór data-acquisitie. Deze procedure kan elke overlappende blootstelling van het volgende focus-/volggebied van het tomogram blootleggen (figuur 7B), die moet worden overwogen voordat u doorgaat.
      2. Controleer en bezoek de vierkanten die de verfijning hebben doorstaan. Klik met de rechtermuisknop op de mislukte positie om de opties te zien. Als de eucentrische hoogte faalt, zoekt u "Auto-eucentric by stage-tilt" (stap 1.4.1.), verkrijgt u een nieuwe "Search" -afbeelding om de z-hoogte bij te werken en "Add Position". Verwijder de mislukte/eerder geïnitialiseerde positie. Klik op de optie Eucentrisch overslaan , wat is gedaan met "Alles verfijnen".
        OPMERKING: Als "Alles verfijnen" niet wordt uitgevoerd, mag "Eucentric overslaan" niet worden aangevinkt. Tomo5 zal eucentrische verfijning uitvoeren voordat elk tomogram wordt verkregen; op deze manier worden posities die falen in eucentrische verfijning overgeslagen.
  6. Voer automatische functies uit volgens de onderstaande stappen.
    1. Controleer de instellingen om de uitlijningen uit te voeren via het tabblad "Autofuncties" door in de atlas naar een gebied van koolstof te navigeren. Breng dat gebied naar eucentrische hoogte en volg de volgorde van uitlijningen zoals hieronder vermeld.
      1. Voer Auto-eucentric by stage tilt uit met de voorinstelling "Eucentric Height".
      2. Voer de autofocusroutine uit met de voorinstelling "Scherpstellen".
      3. Voer de Autostigmate-routine uit met de voorinstelling "Thon Ring".
      4. Voer de Autocoma-routine uit met de voorinstelling "Thon Ring".
      5. Voeg het gewenste objectiefatuur in (figuur 6B), waarschijnlijk het diafragma van 100 μm, als een goed compromis voor een verhoogd monstercontrast en slechts een kleine afsnijding in signaal met een zeer hoge resolutie.
      6. Herhaal de Autostigmate-routine na het inbrengen van het diafragma.
        OPMERKING: Bij vergrotingen met pixelgroottes rond 3 Å en lagere resoluties kan de Autocoma-routine mislukken; controleer en lijn in dit geval Tomo Rotation Center uit onder de directe uitlijningen in de TEM-gebruikersinterface.
    2. Controleer of de Auto Zero-Loss centering-routine werkt op uw monster. Met de "Zero Loss" preset bij een redelijk hoge dosis (stap 1.2.3) zal de routine in Auto Functions waarschijnlijker slagen.
  7. Voer gegevensverzameling uit.
    1. Om de geautomatiseerde acquisitie op het tabblad "Tomografie" te starten, selecteert u de plakgegevensverzameling en stelt u de gewenste parameters in (figuur 7C). Parameters voor gegevensverzameling instellen: Tilt Step (°), Max. Positive Angle (°), Max. Negative Angle (°), trackingschema (aanbevolen: selecteer Track/Focus Before Acquisition). Selecteer Kolomventielen sluiten voor een eucentrisch hoogteschema.
      OPMERKING: Zelden gebruikte parameters zijn "Belichtingstijd aanpassen", "ZLP aanpassen", "Faseplaat gebruiken" en "Pauzeren na kantelen".
      1. Gebruik de belichtingstijd aanpassen voor tomogrammen die niet bedoeld zijn voor STA om de belichtingstijd te verhogen met een opgegeven verhouding bij hogere hellingen.
      2. Met de optie ZLP aanpassen wordt na elk tomogram een ZLP-verfijning uitgevoerd, ongeacht de periodiciteitsset. Het is traag, mislukt af en toe zonder voor de hand liggende redenen en zal die positieverwerving overslaan. Het kan echter nuttig zijn voor een zeer smalle spleetbreedte, d.w.z. 3-5 eV op een Selectris (X) -filter.
      3. Gebruik Faseplaat wordt zelden gebruikt sinds de introductie van DED's met energiefilters.
      4. Pause After Tilt pauzeert de acquisitie, maar staat geen wijzigingen in de software toe.
    2. Controleer de parameters voor gegevensverzameling (op het tabblad "Voorbereiding"), ga akkoord met de dosisberekening en het gewenste kantelschema, geef het aantal fracties (nr.) op in de voorinstelling "Belichting" en begin vervolgens met de acquisitie.
      OPMERKING: Het aantal fracties hangt af van het monster, de acquisitieparameters en de geplande nabewerkingsstappen, d.w.z. STA versus morfologische analyse, en moet worden beperkt tot waarden waar bewegingscorrectie en CTF-schatting voldoende signaal krijgen. Een bereik van 4-10 fracties is een goede schatting, waarbij 4 meer geschikt is voor dikkere monsters en 10 voor dunnere moleculaire monsters.
      1. Klik vervolgens op Start om de gegevensverzameling te starten en de eerste tomogramacquisitie te controleren om ervoor te zorgen dat de tomogrammen worden verkregen zoals bedoeld.
        OPMERKING: Recente tomografiesoftwareversies hebben een extra movie player-slab-out op het tabblad "Tomografie" waar de verworven tomogrammen kunnen worden bekeken. Wees geduldig tijdens het laadproces.

2. Cryo-ET STA van apoferritine met behulp van emClarity

OPMERKING: Hier wordt emClarity-software17 gebruikt om cryo-ET-structuurbepaling te illustreren door STA. Figuur 9 vat dit proces samen. Zes tilt-series van apoferritine (EMPIAR-10787) werden als voorbeeld genomen. Octaëdrische symmetrie werd toegepast en de uiteindelijke kaart had een resolutie van 2,86 Å, verkregen uit slechts 4.800 deeltjes en dicht bij de Nyquist-frequentie (2,68 Å).

  1. Zorg ervoor dat het emClarity-softwarepakket39 is gedownload en geïnstalleerd (zie Materiaaltabel). Installeer IMOD voor de softwareverwerking40.
    OPMERKING: Basiskennis van Linux-opdrachten is vereist. Een meer gedetailleerde tutorial is te vinden in referentie41, die een ribosoom dataset (EMPIAR-10304) als voorbeeld neemt en de stapsgewijze procedures beschrijft. Voor verschillende soorten eiwitmonsters is ook een eerder gepubliceerd rapport beschikbaar42.
  2. Bereid de invoerbestanden en mappen voor.
    OPMERKING: De ONBEWERKTE frames zijn bewegingsgecorrigeerd door MotionCor2 (patch 5 x 5)43 (zie Materiaaltabel). De bewegingsgecorrigeerde afbeeldingen werden gestapeld om de tilt-serie te genereren met behulp van newstack (IMOD) en handmatig uitgelijnd met patchtracking met Behulp van Etomo (zie Tabel met materialen), gevolgd door emClarity. Om betere uitlijningen te krijgen, wordt het aanbevolen om offsets en kantelcompensatie uit te voeren in Etomo. De zes tilt-series worden omgedoopt tot TS1 naar TS6. Hieronder staan de instructies en commando's voor de eerste tilt series (TS1) als voorbeeld.
    1. Stel een projectmap in.
      OPMERKING: De nieuwste versie van de software is 1.5.3.11. Alle gerelateerde softwarelogs zijn te vinden in de lokale projectmap (.../logFile/emClarity.logfile).
    2. Maak onder de projectmap nog een nieuwe map, "fixedStacks", en bereid de invoerbestanden voor: TS1.fixed, TS1.xf en TS1.tlt.
      OPMERKING: TS1.fixed: de originele tilt-serie, ook bekend als TS1.st in Etomo. TS1.xf: dit bestand bevat de transformatiecoördinaten na Etomo tiltalign. TS1.tlt: dit bestand bevat kantelhoeken.
  3. Schat de onscherpte volgens de onderstaande stappen.
    1. Bereken de onscherpte. Werk het parameterbestand bij met de microscoop en de beeldparameters volgens aanvullende tabel 1. Kopieer een parameterbestand naar de projectmap, wijzig de naam in param_ctf.m. en voer uit: emClarity ctf estimate param_ctf.m TS1.
      OPMERKING: De sjabloon voor het parameterbestand is te vinden in het aanvullende bestand 1 of de lokale software-installatiemap (.../emClarity_1.5.3.11/docs/exampleParametersAndRunScript/).
  4. Controleer de CTF-schattingsresultaten voor elke stapel.
    1. Controleer de uitgelijnde stapels (bijvoorbeeld aliStacks/TS1_ali1.fixed) met behulp van 3dmod en zorg ervoor dat de fiduciale kralen correct worden gewist.
    2. Zorg ervoor dat het logbestand meldt dat de handvaardigheid correct is, wat te vinden is in logfile/emClarity.logfile (Figuur 9).
    3. Controleer de onscherptewaarde (bijvoorbeeld fixedStacks/ctf/TS_ali1_psRadial_1.pdf) en zorg ervoor dat deze overeenkomt met de theoretische CTF-schatting.
  5. Definieer de subregio's.
    1. Genereer een in de prullenbak gegooid tomogram. Voer in de projectmap: sh recScript2.sh -1 uit.
      OPMERKING: Een kleiner (in grootte) tomogram voor elke stapel wordt opgeslagen in een nieuwe map "bin10". Om het proces te versnellen, kunnen de coördinaten van een of meerdere subregio's worden gedefinieerd in een bin10-tomogram. Het scriptbestand bevindt zich in de lokale software-installatiemap (.../emClarity_1.5.3.11/docs/).
    2. Bepaal de grenzen door zes punten, xmin, xmax, ymin, ymax, zmin en zmax te kiezen om één subgebied te maken. Voer onder de map "bin10" uit: 3dmod TS1_bin10.rec.
      OPMERKING: Als er vier subregio's in één kantelreeks moeten worden gemaakt, kiest u 6 × 4 = 24 punten. Elke stack moet één modelbestand (*.mod) hebben onder de map "bin10".
    3. Converteer de modelbestanden naar het emClarity-formaat. Hiermee wordt een nieuwe map recon gemaakt. Sla alle coördinaten van elke subregio op in deze map. Voer in de projectmap: sh recScript2.sh TS1 uit.
  6. Pluk deeltjes.
    1. Zoek een apoferritine sjabloon voor het plukken van deeltjes. Download een sjabloon uit de ElektronenmicroscopieGegevensbank (EMD-10101)44. Zorg ervoor dat de pixelgrootte van de sjabloon overeenkomt met die van de onbewerkte gegevens. Voer in de projectmap uit: emClarity rescale ApoF.mrc ApoF_Template_rescale.mrc 3.60 1.34 cpu.
    2. Genereer CTF-gecorrigeerde tomogrammen voor deeltjespluk. Voer in de projectmap: emClarity ctf 3d param_ts.m templateSearch uit.
    3. Voer deeltjesselectie uit voor elke subregio. Voer voor de apoferritine-dataset een sjabloonzoekopdracht uit in bin6. Wijzig de Tmp_angleSearch parameters (θuit, Δuit, θin, Δin) om het hoekbereik en de intervallen voor in- of uitvlakszoeken in graden te bepalen. Voer in de projectmap: emClarity templateSearch param_ts.m TS1 1 ApoF_Template_rescale.mrc O 1.
      OPMERKING: In deze stap wordt een map "convmap_wedge_Type2_bin6" gegenereerd. Het csv-bestand onder deze map (bijvoorbeeld TS1_1_bin6.csv) bevat alle informatie over de geselecteerde deeltjes.
    4. Verwijder de verkeerde deeltjes met 3dmod. Voer onder de map "convmap_wedge_Type2_bin6" uit: 3dmod .. /cache/TS1_1_bin6.rec TS1_1_bin6.mod.
      OPMERKING: Het is gebruikelijk om verkeerde deeltjes te vinden naast koolstofranden of ijsverontreinigingen in die gebieden. Klik met de rechtermuisknop op de onjuiste punten en druk op backspace op het toetsenbord om ze te verwijderen. Zorg er in deze stap voor dat de meeste fout-positieve punten worden verwijderd (figuur 10).
    5. Wijzig de mapnaam "convmap_wedge_Type2_bin6" in "convmap", omdat emClarity in de volgende stappen subregio-informatie onder convmap zal zoeken.
  7. Initialiseer het project. Voer in de projectmap: emClarity init param0.m uit om een database te maken voor emClarity, ApoF.mat.
  8. Voer tomogrammen reconstructie uit vóór STA en uitlijning. Om CTF-gecorrigeerde subregiotomogrammen te genereren bij bin4, voert u uit: emClarity ctf 3d param0.m.
    OPMERKING: CTF-gecorrigeerde tomogrammen (bijvoorbeeld cache/TS1_1_bin4.rec)  worden gegenereerd in een nieuwe map "cache".
  9. Voer STA en uitlijning uit.
    1. Voer de middeling uit met behulp van de CTF-gecorrigeerde subtomogrammen vanaf bin4. Voer in de projectmap uit: emClarity avg param0.m 0 RawAlignment.
    2. Blijf uitlijningen doen en uitvoeren: emClarity alignRaw param0.m 0.
      OPMERKING: De middelingsstap genereert een referentie, die door emClarity in deze stap wordt gebruikt om de deeltjes uit te lijnen. De Raw_angleSearch parameters (θout, Δout, θin, Δ in) kunnen worden gewijzigd om het hoekbereik en de stapgroottes voor elke cyclusin te stellen. Aangezien de meeste onjuiste deeltjes uit de database worden verwijderd (stap 2.6.4), kunnen deze hoekinstellingen voor uitlijning met een relatief kleine mate beginnen.
    3. Werk de Raw_angleSearch parameters bij en voer nog een paar cycli uit (stappen 2.9.1 en 2.9.2). Om het proces te versnellen, voert u in-plane en out-of-plane uitlijningen afzonderlijk uit.
      OPMERKING: Voor elke binning wordt aanbevolen om meerdere cycli uit te voeren en de hoekinstellingen geleidelijk te verminderen. Voor de ApoF-dataset werden nog vijf cycli in bin 4 uitgevoerd en verdere details zijn beschikbaar in aanvullende tabel 2. Voer voor cycle001 in de projectmap uit: emClarity avg param1.m 1 RawAlignment, gevolgd door emClarity alignRaw param1.m 1.
    4. Reinig de overlappende deeltjes. Voer in de projectmap uit: emClarity removeDuplicates param5.m 5.
  10. Voer tilt-serie verfijning uit met tomoCPR.
    OPMERKING: Deze stap is optioneel.
    1. Voer tomoCPR uit om de stackgeometrie te verfijnen. Voer in de projectmap: emClarity tomoCPR param5.m 5 uit.
    2. Genereer nieuw uitgelijnde stacks en werk de geometriebestanden bij. Voer in de projectmap uit: emClarity ctf update param6.m.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de nieuwe geometriebestanden (bijvoorbeeld fixedStacks/ctf/TS1_ali2_ctf.tlt) en de nieuw uitgelijnde stacks (bijvoorbeeld aliStacks/TS1_ali2.fixed) correct zijn gegenereerd.
    3. Maak nieuwe subtomogrammen bij bin2. Voer in de projectmap uit: emClarity ctf 3d param6.m.
      OPMERKING: Dit wordt gevolgd door een paar cycli voor gemiddelden en uitlijnen bij bin2 (stappen 2.9.1, 2.9.2 en 2.9.3), dubbele reiniging (stap 2.9.4) en optionele tomoCPR (stap 2.10). Vanwege de hoge symmetrie werden nog eens vijf cycli bij bin2 uitgevoerd voor apoferritine. Werk de Raw_angleSearch parameters voor elke cyclus bij.
  11. Voer de laatste reconstructie uit.
    1. Blijf een paar cycli uitvoeren bij bin1 en tomoCPR (stap 2.9 en stap 2.10). Nog eens 10 cycli bij bin1 werden uitgevoerd voor de apoferritine dataset. Meer informatie over de opdrachten en parameters is te vinden in tabel 2.
    2. Voer de definitieve reconstructie uit door de twee halve datasets te combineren. Voer in de projectmap uit: emClarity avg param21.m 21 RawAlignment, gevolgd door emClarity avg param21.m 21 FinalAlignment.
      OPMERKING: De uiteindelijke kaart (bijvoorbeeld met een B-factor van 10, cycle021_ApoF_class0_final_bFact-10.mrc) wordt gegenereerd, figuur 11.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Voor cellulaire en lamellenmonsters hangt de strategie voor gegevensverzameling grotendeels af van het monster en het doel van het beeldvormingsonderzoek (figuur 1). De targetingbenadering hangt af van het feit of het moleculaire doelwit in situ is of bereid uit het gezuiverde macromoleculaire complex voor reconstructiemonsters met hoge resolutie die moleculaire doelen bevatten. Voor gezuiverde complexen die op gaten (koolstof) roosters worden verglaasd, kan targeting eenvoudig worden gebaseerd op beeldvorming in de gaten van de (koolstof) ondersteuningsfilm. Voor in situ werk vereist de targetingbenadering kennis van de locatie van de moleculaire entiteit op basis van correlatieve gegevens of bekende cellulaire oriëntatiepunten met lage vergroting. Cellulaire oriëntatiepunten zouden idealiter identificeerbaar zijn bij het maken van overzichtsfoto's en, indien voldoende om regio's van belang ruwweg te lokaliseren, een snelle manier kunnen bieden om de doelidentiteit te bevestigen met een zoekafbeelding. Als de waarneembare gebeurtenissen echter zeldzaam zijn, kunnen zoekafbeeldingen met gemiddelde vergroting nodig zijn om te kwalificeren dat het doel correct is. Zoekkaarten zijn medium vergrotingsmontages van zoekafbeeldingen en kunnen dus het vinden van doelen veel gemakkelijker maken, waar ze kunnen worden verkregen bij een vergroting waarbij het interessante kenmerk zichtbaar is. Zoekkaarten kunnen vervolgens worden gescreend om doelbatchposities te vinden en in te stellen. Voor specimens die cellulaire kenmerken voor ultrastructurele reconstructie bevatten, is de targetingbenadering vergelijkbaar, hoewel even afhankelijk van de zichtbaarheid van de cellulaire gebeurtenis bij verschillende vergrotingen en de prevalentie ervan in het monster.

Er moet ook rekening worden gehouden met de data-acquisitiestrategie; in alle gevallen bepaalt het doel van het onderzoek grotendeels hoe de gegevens worden verzameld. Voor reconstructie van de cellulaire ultrastructuur kunnen een lage vergroting (20-5 Å/px) en een groot gezichtsveld geschikt zijn, maar hoge vergrotingen zijn vereist om moleculaire of hoge resolutiedetails (5-1 Å/px) te reconstrueren. Een dataset verzameld op 1,5 Å/px onder ideale omstandigheden zal alleen fysiek een reconstructie kunnen produceren met de Nyquist-frequentie van 3,0 Å/px; in werkelijkheid hebben echter veel factoren, waaronder maar niet beperkt tot de dikte, grootte en heterogeniteit van het specimen, allemaal invloed op de verkregen reconstructiekwaliteit. De exacte beeldparameters balanceren ook de vergroting op basis van het doel van de studie met het gezichtsveld om voldoende informatie te bevatten. Dit artikel presenteert een subtomogram met een gemiddelde van 2,86 Å, maar aanvullende studies 17,42,43,44,45 worden gepresenteerd in tabel 1 om de verzamelparameters te illustreren die verband houden met studies gericht op verschillende uitkomsten17,42,45,46.

Zodra een doelgerichte workflow en data-acquisitieregime voor cryo-ET is vastgesteld, is gegevensverzameling van veel verschillende monstertypen mogelijk. Representatieve tomogrammen van een verscheidenheid aan specimens worden hier gepresenteerd: moleculaire monsters zoals apoferritine (film 1), dunne cellulaire processen (film 2) en FIB-gemalen lamellen van het dikke cellulaire monster (film 3).

figure-results-1
Figuur 1: Overzicht van de configuratie van de tomografieworkflow. De cryo-ET imaging workflow beschreven in het protocol wordt weergegeven als een stroomdiagram. De beelden die naar verwachting zullen worden verkregen, worden getoond voor de cellulaire en moleculaire workflow. De gepresenteerde naamgeving volgt de Tomo5-conventie, hoewel de meeste tomografie-acquisitiesoftware gemeenschappelijke principes deelt voor het verzamelen van deze afbeeldingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Voorbereidingstabblad en vooraf ingestelde zoekcondities. (A) Overzichtsafbeelding van het hele tabblad. Voorinstellingen voor beeldcondities worden op dit tabblad ingesteld en de "Calibrate Image Shift" en "Image Filter Settings" zijn te vinden in de vervolgkeuzelijst "Tasks". (B) Zoom-in van de vervolgkeuzelijst "Presets" waar elke preset kan worden geselecteerd voor het instellen van individuele beeldomstandigheden. (C) Afbeelding met een adequate vergroting om zowel de belichting als het gebied "Focus and Tracking" in het gezichtsveld te passen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Dosisberekeningen. Voorbeelddosisberekeningen voor mogelijke tomogramacquisitieschema's waarbij het dosistempo over vacuüm is gemeten. De twee berekeningen bepalen de blootstellingstijd (en) voor elke kanteling, of het nu gaat om een optimale dosis per kanteling of een optimale totale dosis voor de full tilt-serie. Bij subtomogrammiddeling is het gebruikelijk om een optimale dosis per gekantelde afbeelding te targeten in het bereik van 3,0-3,5 e-/Å2. In beide gevallen zijn de "Fracties (Nr.)" ingesteld op 6 om ~0,5 e-/Å2 dosis per filmframe van de kanteling te bereiken voor voldoende signaal om bewegingscorrectie uit te voeren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Tabblad Atlas. Overzichtsafbeelding van het tabblad "Atlas". De afbeelding is bijgesneden om lege rasterpositieruimten te voorkomen. Het menu "Taken" bevat voorkeuren voor sessie-instellingen en rasterselectieruimten voor individuele selectie van alle geïnventariseerde rasters en een optie om een enkele atlas te verkrijgen nadat de cassette uit de autoloader is verwijderd. Een geselecteerd raster kan opnieuw worden ingesteld en vervolgens opnieuw worden verkregen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Gekalibreerde beeldverschuivingen. Afbeelding toont een belichtings- en zoekafbeelding. Het rode kruis in de zoekafbeelding is de verschoven markering om de verschuiving tussen belichting en zoekopdracht te corrigeren. Men moet de kalibraties van de beeldverschuiving opnieuw uitvoeren bij het begin van de sessie of na het wijzigen van de voorinstellingen voor de beeldconditie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-6
Figuur 6: Automatische functies en diafragma's. (A) Het tabblad "Automatische functies" toont de vervolgkeuzelijst "Voorinstellingen" en de selectie "Taak". Blauw onderstreept is de "Thon Ring" preset die vereist is voor "Autostigmate" (ook onderstreept in blauw) en "Autocoma". Men moet de respectieve voorinstellingen voor elke taak selecteren en vervolgens op de Startknop drukken. (B) Diafragma's zijn te vinden in de TEM-gebruikersinterface. Selecteer het gewenste "Objectief diafragma" nadat de automatische functies zijn uitgevoerd en voer "Autostigmate" uit met het diafragma in. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-7
Figuur 7: Tomografie tabblad overzicht. Afbeeldingen tonen de Tomo 5.8 gebruikersinterface. (A) Partijposities. De nieuwste functies die in de afbeelding worden weergegeven: de optie "Search Map verkrijgen"; tomogramposities worden weergegeven in atlasweergave met de inzoomoptie; gemarkeerd in de rechterbovenhoek is "Posities selecteren"; hieronder zijn alle vier de posities geselecteerd om de parameters "Update Defocus" te gebruiken. (B) Er worden drie posities geselecteerd op de zoekkaart, met het label 1, 2 en 3. Positie 1 zal geen probleem vormen wanneer "Alles verfijnen" wordt uitgevoerd. Als u echter in een instelling met een hoge doeldichtheid, zoals wanneer lamellenposities zijn geselecteerd, zoals afgebeeld voor positie 2 en positie 3, dan zal "Refine All" de routine "Tracking" en "Focus" uitvoeren op het "Exposure" -gebied van positie 2, waardoor het doel wordt blootgesteld voordat het tomogram wordt verkregen. Het rastertype is R1.2/1.3. Schaalbalk = 1,2 μm. (C) Gegevensverzameling. Geselecteerde posities die zijn ingesteld in "Batchposities" kunnen nu individueel worden verkregen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-8
Figuur 8: Bepalen van de maximale kantelhoek. Figuur toont een stapsgewijze benadering voor het bepalen van het maximale kantelbereik voor tomogramaankopen. (A) 0° overzicht en een zoekkaart in het midden van het rasterplein. Om het kantelbereik te testen, kan de hoek in de tomografiesoftware worden ingesteld met "Set Tilt (°)" door de gewenste waarde te typen en vervolgens op Set te drukken. (B) Het podium is gekanteld naar −60°, wat aantoont dat een hoek van de zoekkaart niet volledig zou worden verworven bij −60°. (C) Het podium is gekanteld tot 60°. Door de gaten te tellen die verdwenen zijn bij ±60°, kan men een idee krijgen van het kantelbereik van een rastervierkant. Schaalbalken = 2,5 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-9
Figuur 9: emClarity flowchart. Het stroomdiagram beschreef de verschillende stappen voor cryo-subtomogrammiddeling. Schaalstaven = 50 nm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-10
Figuur 10: Template matching met behulp van emClarity. (A) Een typische micrograaf van apoferritine op een grafeen-gecoat raster. Onscherpte: −3.430 μm. (B) Een plak van het tomogram bedekt met modelpunten na het zoeken naar een sjabloon. (C) Een boven- en (D) een zijprojectiebeeld van modelpunten, wat duidt op een enkele platte laag monodispersed apoferritinedeeltjes. Schaalstaven = 50 nm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-11
Figuur 11: Cryo-ET STA van apoferritine. (A) De laatste kaart na 21 cycli van subtomogramuitlijning. (B) De Fourier shell correlation (FSC) plot van de uiteindelijke kaart met een gerapporteerde resolutie van 2,86 Å, met 38 kegel FSC's. (C) Representatieve dichtheidskaarten (uitgerust met PDB-model 6s6147). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

MonsterCryo-ET-typeÅ/pxKantelbereik (+/-)Kanteltrap (°)Onscherp bereik (μm)Totale dosis (e-/Å2)ResolutieOnbewerkte gegevensReferentie
ApoferritineGezuiverd/Moleculair (STA)1.346031.5 – 3.51022.86EMPIAR-1078717 & dit artikel
HIV-1 GagGezuiverd/Moleculair (STA)1.356031.5 – 3.961203.1EMPIAR-1016417
RibosoomGezuiverd/Moleculair (STA)2.16032.2 – 4.31207EMPIAR-1030442
SARS-CoV-2 piekLamellen/Moleculair (STA)2.135432 – 712016EMPIAR-1075345
Neuron axon structuurCellulair (ultrastructureel)5.466023.5 – 590N.D.EMPIAR-1092247

Tabel 1: Verzamelparameters voor verschillende cryo-ET-onderzoeken. Studies gericht op de reconstructie van moleculaire details uit gezuiverde of in situ eiwitten in vergelijking met een studie gericht op het oplossen en segmenteren van de ultrastructurele cellulaire kenmerken.

Film 1: Een tomogram van apoferritinemonsters op een normaal EM-raster en vervolgens afgebeeld met een cryo-TEM uitgerust met een camera met ultrahoge resolutie met een compatibel filter. Tilt-series werden verkregen met een dosissymmetrisch schema, met een kantelbereik van 54° en een totale dosis van 134 e-/A2 in de elektronentomografiesoftware. Schaalbalk = 50 nm. Klik hier om deze film te downloaden.

Film 2: Een tomogram van een primair neuron gekweekt op een EM-raster en vervolgens direct in beeld gebracht met een cryo-TEM uitgerust met een ultrahoge resolutie camera met een compatibel filter. De tilt-serie werd verkregen met een dosissymmetrisch schema, met een kantelbereik van 60° en een totale dosis van 120 e-/A2 in de elektronentomografiesoftware. Schaalbalk = 100 nm. Klik hier om deze film te downloaden.

Film 3: Een tomogram van een Cyanobacteria op een EM-raster, onderworpen aan FIB-frezen en vervolgens in beeld gebracht met een cryo-TEM uitgerust met een hogesnelheidscamera en een compatibel filter. De kantelseries werden verkregen met een dosissymmetrisch schema, met een kantelbereik van 50° en een totale dosis van 120 e-/A2 in de elektronentomografiesoftware. Schaalbalk = 87,2 nm. Klik hier om deze film te downloaden.

Aanvullend bestand 1: De parameterbestandssjabloon voor het schatten van de onscherpte. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 1: Gegevensverzameling en microscoopopinstellingen. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullende tabel 2: Lijst van opdrachten in de volgorde van uitvoering. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tomo5
De workflowbeschrijving van de tomografiesoftware belicht een potentiële en meest gestroomlijnde manier voor een (externe) batchtomografiesessie-instelling. Hoewel de software gemakkelijk is voor beginners, kan enige initiële cryo-EM-ervaring en basistomografie-inzicht helpen bij de installatie. Kritieke stappen worden gemarkeerd in het protocol en moeten helpen bij het oplossen van problemen, zelfs als een andere instellingsaanpak is gebruikt. De vooruitgang van de software zal het verzamelen van (externe) gegevens vergemakkelijken en cryo-ET toegankelijker maken voor een breed gebruikersbestand. Een paar tips en trucs die kunnen helpen bij het oplossen van veelvoorkomende problemen worden hieronder beschreven.

Een belangrijk punt om te bespreken is de keuze van rasters, omdat bij het kantelen van het monster tot ±60°, rasterbalken bij hoge kantelen het zicht kunnen belemmeren (figuur 8). Op een TEM-raster verwijst de maaswijdte naar het aantal rastervierkanten per eenheidslengte van het raster. Grotere maasnummers hebben meer rastervierkanten per lengte-eenheid, een hogere dichtheid van rastervierkanten en kleinere rastervierkanten, d.w.z. een raster met 400 mazen heeft kleinere vierkanten dan een raster met 200 mazen. Een goede keuze aan rasters voor tomografie is rasters met 200 mazen of 300 mazen. Zoals te zien is in figuur 8, wordt het beschikbare gebied om te verzamelen verkleind naarmate het raster wordt gekanteld. Bij ±60° kanteling heeft een raster van 300 mesh een klein gezichtsveld waarop een volledig tomogram kan worden verkregen. De voordelen van rasters met 200 mazen zijn dat de grotere rastervierkanten de moleculaire tomografie sneller opzetten, en met het grotere raster-vierkante gebied zal één vierkant waarschijnlijk voldoende zijn voor een nachtelijke verzameling. Het nadeel is dat 200-mesh roosters kwetsbaarder zijn, dus handling en clipping vereisen meer finesse.

Bovendien moet bij het gebruik van gatachtige steunfolie (zie Materiaaltabel) op EM-rasters rekening worden gehouden met de gatafstand voor het instellen van het focus- en volggebied in relatie tot het belichtingsgebied. Idealiter moet de straaldiameter bij de gewenste vergroting klein genoeg zijn om het koolstofgebied naast het blootstellingsgebied langs de kantelas te bedekken voor een optimale en snelle installatie. Op deze manier kunnen potentiële regio's van belang in elk gat worden verkregen.

Omdat de eucentrische hoogteroutine van de software momenteel niet zo robuust is, zoals de serialEM-routine, kunnen de volgende tips dat probleem omzeilen. Als de eucentrische hoogtebepaling mislukt met behulp van de eucentrische hoogtevoorinstelling, kan men in plaats daarvan de overzichtsvoorinstelling gebruiken en "Auto-eucentric by stage tilt" opnieuw uitvoeren; dit kan problemen oplossen als de eucentrische hoogte ver weg is van 0. Als dit lukt, kan men "Auto-eucentric by stage tilt" opnieuw uitvoeren met "Eucentric Height" presets om de precisie te verbeteren. Als het mislukt, kan men "Auto-Eucentric by beam tilt" uitvoeren met de eucentrische hoogtevoorinstelling en vervolgens "Auto-Eucentric by stage tilt" opnieuw uitvoeren of handmatig de z-hoogte instellen geconsolideerd door "Auto-Eucentric by beam tilt" in de TEM-gebruikersinterface onder "Stage" instellingen. In het geval dat rasters met een herhalend patroon van gaten worden gebruikt, kunnen ze de identificatie van een enkele kruiscorrelatiepiek voorkomen. Men kan proberen de eucentrische hoogtevoorinstelling te wijzigen in een lagere onscherpteverschuiving zoals −25 μm en/of een kortere belichtingstijd om de kruiscorrelatie van de gatpatronen te verminderen. Aan de andere kant kan het gebruik van lacey grids / lamellen niet voldoende signaal geven voor een sterke cross-correlatie piek. Men kan proberen de eucentrische hoogtevoorinstelling te wijzigen in een grotere onscherpteverschuiving zoals −75 μm en/of een langere belichtingstijd om de kruiscorrelatiepiek te verbeteren. Een andere optie is om de instellingen van het afbeeldingsfilter aan te passen; ze zijn te vinden in het tabblad "Voorbereiding". Opties om de filterinstellingen aan te passen kunnen worden ingesteld voor laag (Overzicht/Rasterplein), gemiddeld (Eucentrische Hoogte) en hoge vergroting (Tracking/Focus) om de optimale kruiscorrelatiepiek voor elke voorinstelling te vinden. De vereiste invoer is één afbeelding, d.w.z. op 0° en één op 5°, gevolgd door op Vergelijken te klikken om beide afbeeldingen te vergelijken. De aanbevolen beginwaarde voor de langste golflengte is een kwart van de schaalbalk in de afbeelding en voor de kortste golflengte is een veertigste van de schaalbalk. Als de piek niet robuust wordt geïdentificeerd, kan men de instellingen optimaliseren totdat een overtuigende piek kan worden gevonden. Het is niet nodig om afbeeldingen elke keer opnieuw te verwerven; gewoon op "Vergelijken" drukken is voldoende. Als TOMO er nog steeds niet in slaagt om automatisch de eucentrische hoogte te vinden, kan de handmatige eucentrische hoogtekalibratie worden gebruikt. Men moet centreren over een redelijk groot ijskristal in overzichtsvergroting in het tabblad "Voorbereiding", ga dan naar de "Stage control" van de TEM-gebruikersinterface, stel alfa in op −30 °, en pas de fase z-waarde aan om het kristal opnieuw te centreren met behulp van het fluorescerende schermbeeld. Het selecteren van de instellingen "Hoge resolutie" en "Hoog contrast" in de TEM-gebruikersinterface maakt dit eenvoudig (knoppen onder aan het fluorescerende schermvenster). Optioneel, als er toegang is tot een camera met live-modus, kan dit worden gebruikt om de eucentrische hoogte te bepalen; het zal gemakkelijker zijn dan op het fluorescerende scherm.

De grootste beperkingen in Tomo5-versies vóór 5.8 zijn de ontbrekende mediumvergrotingsmontages, ontbrekende dosissymmetrisch schema en problemen met betrekking tot eucentrische hoogtebepaling. Deze bestaan in serialEM, een freeware met snelle ontwikkeling en community-ondersteuning, een robuuste eucentrische hoogteroutine en de optie om te scripten, d.w.z. een op maat gemaakt dosissymmetrisch schema. Vanaf versie 5.8 in Tomo5 is het meest voorkomende probleem voor het vinden van de eucentrische hoogte, d.w.z. een mislukte lus rond de doelz-waarde, opgelost door de optie te implementeren om een eucentrisch hoogteacceptatiecriterium in te stellen. Bij verschillende raster- en monstertypen wordt het echter ten zeerste aanbevolen om de beeldfilterinstellingen aan te passen aan de unieke beeldomstandigheden van individuele sessies en om de best mogelijke kruiscorrelatiepiek te geven om de eucentrische hoogte te vinden en om het focus- en trackinggebied betrouwbaar te laten werken tijdens tomogramacquisitie.

Over het algemeen hebben veel faciliteiten zich snel aangepast aan bediening op afstand tijdens de pandemie. De Tomo5-software biedt een gemakkelijke toegang en gebruiksvriendelijke route naar tomografie die zeer geschikt is voor bediening op afstand. De vooruitgang die in de software is geboekt, zal ongetwijfeld doorgaan met het op afstand verzamelen van gegevens en tomografie in het algemeen meer mainstream in de gemeenschap.

emClarity
Omdat emClarity een op sjablonen gebaseerde deeltjesverzamelmethode gebruikt, heeft het een sjabloon nodig voor het object van interesse. De deeltjespluk (stap 2.6) is zeer gevoelig en bepalend voor de uiteindelijke structuur. Alvorens het gemiddelde te nemen en uit te lijnen (stap 2.9), moet men ervoor zorgen dat de valse positieven zorgvuldig en handmatig worden verwijderd. Wanneer een sjabloon niet beschikbaar is, is emClarity misschien niet gemakkelijk te gebruiken, maar het is mogelijk om andere software te gebruiken, bijvoorbeeld Dynamo37 en PEET48, om een eerste model te maken.

Voor heterogene monsters is emClarity uitgerust met een classificatiemethode waarmee gebruikers zich kunnen concentreren op specifieke functies met verschillende schalen. Het is handig om een paar cycli van uitlijningen uit te voeren voordat u deze classificeert en deze uit te voeren op een hogere binning (zoals bin 4 of bin 3).

De up-to-date versie van de software (V1.5.3.11) heeft belangrijke updates in vergelijking met de eerste release (V1.0)17. Deze omvatten, maar zijn niet beperkt tot, een handvaardigheidscontrole tijdens CTF-schatting (stap 2.3); symmetrie voor uitlijningen (CX, I, I2, O); berekening van 3D-bemonsteringsfuncties per deeltje (3DSF); een overstap naar MATLAB 2019a voor compatibiliteit en stabiliteit; en reconstructie met behulp van de onbewerkte projectiebeelden (cisTEM). De software zal blijven verbeteren voor verschillende voorbeelden en de nieuwste aankondigingen zijn online te vinden (zie Tabel met materialen).

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We erkennen Diamond Light Source voor toegang tot en ondersteuning van de cryo-EM-faciliteiten in het nationale Electron Bio-Imaging Centre (eBIC) in het Verenigd Koninkrijk, gefinancierd door de Wellcome Trust, MRC en BBRSC. We willen ook Andrew Howe bedanken voor de aankoop van het Apoferritin-tomogram (film 1), Ishika Kumar voor de voorbereiding en verwerving van het neurontomogram (film 2) en Craig MacGregor-Chatwin voor het Cyanobacteria lamella-tomogram (film 3).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Software
TomografieThermo Fisher Scientific5.9.0Interne terminologie: Tomo5 in document
TEM serverThermo Fisher Scientific7.10.1
TIAThermo Fisher Scientific5.10.1
DigitalMicrographGatan3.44
emClarityOpen-Source software1.5.3.11Software voor hoge resolutie cryo-elektron tomografie en subtomogram averaging
IMODOpen-Source software4.11Modellering-, weergave- en beeldverwerkingsprogramma's gebruikt voor 3D reconstructie en modellering van microscoopbeelden met speciale nadruk op elektronenmicroscopie gegevens
MotionCor2Gratis voor academisch gebruik1.1.0Een multi-GPU programma dat stralingsgeïnduceerde monsterbeweging corrigeert die is opgenomen
op dosis gefractioneerde filmstacks
ETomoOpen-Source software4.11ETomo is een interface voor het uitvoeren van een subset van IMOD en PEET commando's. 
NoMachineNoMachine, freeware7.9.2Remote desktop software
TeamViewerTeamViewer AG-Remote access en remote control computer software
Materialen
Quantifoil (holey support film) EM roostersQuantifoil-Een vlakke film van koolstof met vooraf gedefinieerde gatgrootte, vorm en rangschikking
Instrumentatie
Titan Krios microscoopThermo Fisher ScientificTitan Krios G2
K3 camera en GIB energiefilterGatan-
Falcon 4 camera en Selectris X energiefilterThermo Fisher Scientific-
Website
Website 1: https://github.com/bHimes/emClarity/--Link om het emClarity softwarepakket te downloaden
Website 2: https://bio3d.colorado.edu/imod/--Link om IMOD te downloaden
Website 3: https://github.com/ffyr2w/emClarity-tutorial--Link naar de emClarity online tutorial
Website 4: https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software--Link om MotionCor2 te downloaden
Website 5: https://github-wiki-see.page/m/bHimes/emClarity/wiki--Link naar de nieuwste aankondigingen inclusief updates en bug fixes voor emClarity

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bai, X. -C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. W. Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles. eLife. 2, 00461(2013).
  2. Li, X., et al. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nature Methods. 10 (6), 584-590 (2013).
  3. Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).
  4. Kato, T., et al. CryoTEM with a cold field emission gun that moves structural biology into a new stage. Microscopy and Microanalysis. 25, 998-999 (2019).
  5. Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM. Nature. 587 (7832), 157-161 (2020).
  6. Mastronarde, D. N. SerialEM: A program for automated tilt series acquisition on Tecnai microscopes using prediction of specimen position. Microscopy and Microanalysis. 9, 1182-1183 (2003).
  7. Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. Software tools for automated transmission electron microscopy. Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).
  8. Deng, Y., et al. Smart EPU: SPA getting intelligent. Microscopy and Microanalysis. 27 (1), 454-455 (2021).
  9. Carragher, B., et al. Leginon: An automated system for acquisition of images from vitreous ice specimens. Journal of Structural Biology. 132 (1), 33-45 (2000).
  10. Bell, J. M., Chen, M., Baldwin, P. R., Ludtke, S. J. High resolution single particle refinement in EMAN2.1. Methods. 100, 25-34 (2016).
  11. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  12. Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. cisTEM, user-friendly software for single-particle image processing. eLife. 7, 35383(2018).
  13. Zivanov, J., et al. New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3. eLife. 7, 42166(2018).
  14. Kimanius, D., Dong, L., Sharov, G., Nakane, T., Scheres, S. H. W. New tools for automated cryo-EM single-particle analysis in RELION-4.0. Biochemical Journal. 478 (24), 4169-4185 (2021).
  15. Galaz-Montoya, J. G., Flanagan, J., Schmid, M. F., Ludtke, S. J. Single particle tomography in EMAN2. Journal of Structural Biology. 190 (3), 279-290 (2015).
  16. Bharat, T. A. M., Scheres, S. H. W. Resolving macromolecular structures from electron cryo-tomography data using subtomogram averaging in RELION. Nature protocols. 11 (11), 2054-2065 (2016).
  17. Himes, B. A., Zhang, P. emClarity: Software for high-resolution cryo-electron tomography and subtomogram averaging. Nature Methods. 15 (11), 955-961 (2018).
  18. Weissenberger, G., Henderikx, R. J. M., Peters, P. J. Understanding the invisible hands of sample preparation for cryo-EM. Nature Methods. 18 (5), 463-471 (2021).
  19. White, J. B. R., et al. Single particle cryo-electron microscopy: From sample to structure. Journal of Visualized Experiments. (171), e62415(2021).
  20. Orlova, E. V., Saibil, H. R. Structural analysis of macromolecular assemblies by electron microscopy. Chemical Reviews. 111 (12), 7710-7748 (2011).
  21. Turk, M., Baumeister, W. The promise and the challenges of cryo-electron tomography. FEBS Letters. 594 (20), 3243-3261 (2020).
  22. Liu, Y. -T., et al. Isotropic reconstruction of electron tomograms with deep learning. bioRxiv. , (2021).
  23. Briggs, J. A. G. Structural biology in situ-The potential of subtomogram averaging. Current Opinion in Structural Biology. 23 (2), 261-267 (2013).
  24. Grünewald, K., et al. Three-dimensional structure of herpes simplex virus from cryo-electron tomography. Science. 302 (5649), 1396-1398 (2003).
  25. Allegretti, M., et al. In-cell architecture of the nuclear pore and snapshots of its turnover. Nature. 586 (7831), 796-800 (2020).
  26. Wang, Z., et al. The molecular basis for sarcomere organization in vertebrate skeletal muscle. Cell. 184 (8), 2135-2150 (2021).
  27. Winey, M., Meehl, J. B., O'Toole, E. T., Giddings, T. H. Conventional transmission electron microscopy. Molecular Biology of the Cell. 25 (3), 319-323 (2014).
  28. Davies, K. M., et al. Macromolecular organization of ATP synthase and complex I in whole mitochondria. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (34), 14121(2011).
  29. Wagner, J., Schaffer, M., Fernández-Busnadiego, R. Cryo-electron tomography-The cell biology that came in from the cold. FEBS Letters. 591 (17), 2520-2533 (2017).
  30. Mahamid, J., et al. Visualizing the molecular sociology at the HeLa cell nuclear periphery. Science. 351 (6276), 969-972 (2016).
  31. Erdmann, P. S., et al. In situ cryo-electron tomography reveals gradient organization of ribosome biogenesis in intact nucleoli. Nature Communications. 12 (1), 5364(2021).
  32. Tegunov, D., Xue, L., Dienemann, C., Cramer, P., Mahamid, J. Multi-particle cryo-EM refinement with M visualizes ribosome-antibiotic complex at 3.5 Å in cells. Nature Methods. 18 (2), 186-193 (2021).
  33. Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).
  34. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
  35. Heymann, J. B., Belnap, D. M. Bsoft: Image processing and molecular modeling for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 3-18 (2007).
  36. Tang, G., et al. EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).
  37. Castaño-Díez, D., Kudryashev, M., Arheit, M., Stahlberg, H. Dynamo: A flexible, user-friendly development tool for subtomogram averaging of cryo-EM data in high-performance computing environments. Journal of Structural Biology. 178 (2), 139-151 (2012).
  38. Hrabe, T., et al. PyTom: A python-based toolbox for localization of macromolecules in cryo-electron tomograms and subtomogram analysis. Journal of Structural Biology. 178 (2), 177-188 (2012).
  39. Himes, B. A. emClarity. GitHub. , (2021).
  40. Mastronarde, D. N. The IMOD Home Page. , Available from: https://bio3d.colorado.edu/imod/ (2020).
  41. Frosio, T. GitHub: emClarity-tutorial. , Available from: https://github.com/ffyr2w/emClarity-tutorial (2021).
  42. Ni, T., et al. High-resolution in situ structure determination by cryo-electron tomography and subtomogram averaging using emClarity. Nature Protocols. 17 (2), 421-444 (2022).
  43. Zheng, S. Q., Palovcak, E., Armache, J. -P., Cheng, Y., Agard, D. A. MotionCor2. , Available from: https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software (2016).
  44. Mills, D. J., Pfeil-Gardiner, O., Vonck, J. Apoferritin from mouse at 1.84 angstrom resolution. , Available from: https://www.emdataresource.org/EMD-10101 (2022).
  45. Nedozralova, H., et al. In situ cryo-electron tomography reveals local cellular machineries for axon branch development. Journal of Cell Biology. 221 (4), 202106086(2022).
  46. Mendonça, L., et al. Correlative multi-scale cryo-imaging unveils SARS-CoV-2 assembly and egress. Nature Communications. 12 (1), 4629(2021).
  47. Vonck, J., Pfeil-Gardiner, O., Mills, D. J. Apoferritin from mouse at 1.84 angstrom resolution. , Available from: https://www.rcsb.org/structure/6s61 (2019).
  48. Nicastro, D., et al. The molecular architecture of axonemes revealed by cryoelectron tomography. Science. 313 (5789), 944-948 (2006).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cryo Electron TomographyRemote Data CollectionSubtomogram AveragingTomo5 SoftwareDirect Electron DetectorsAutomated AcquisitionCTF EstimationTomogram ReconstructionParticle PickingApoferritin Dataset

Related Articles