Kwantificeren van cytoskeletdynamica met behulp van differentiële dynamische microscopie

Summary

Differentiële dynamische microscopie (DDM) combineert kenmerken van dynamische lichtverstrooiing en microscopie. Hier wordt het proces van het gebruik van DDM om gereconstitueerde cytoskeletnetwerken te karakteriseren door de subdiffusieve en gekooide dynamiek van deeltjes in vimentinenetwerken en de ballistische beweging van actieve myosine-gedreven actine-microtubulecomposieten te kwantificeren.

Abstract

Cellen kunnen kruipen, zichzelf genezen en hun stijfheid afstemmen vanwege hun opmerkelijk dynamische cytoskelet. Als zodanig kunnen reconstituerende netwerken van cytoskeletale biopolymeren leiden tot een groot aantal actieve en aanpasbare materialen. Het ontwerpen van dergelijke materialen met nauwkeurig afgestemde eigenschappen vereist echter het meten van hoe de dynamiek afhankelijk is van de netwerksamenstelling en synthesemethoden. Het kwantificeren van een dergelijke dynamiek wordt uitgedaagd door variaties in de tijd, ruimte en formuleringsruimte van samengestelde netwerken. Het protocol beschrijft hier hoe de Fourier-analysetechniek, differentiële dynamische microscopie (DDM), de dynamiek van biopolymeernetwerken kan kwantificeren en bijzonder geschikt is voor studies van cytoskeletnetwerken. DDM werkt aan tijdreeksen van beelden die zijn verkregen met behulp van een reeks microscopiemodaliteiten, waaronder laserscanning confocale, widefield-fluorescentie en brightfield-beeldvorming. Uit dergelijke beeldsequenties kan men karakteristieke decorrelatietijden van dichtheidsfluctuaties over een reeks golfvectoren extraheren. Er wordt ook een gebruiksvriendelijk, open-source Python-pakket ontwikkeld om DDM-analyses uit te voeren. Met dit pakket kan men de dynamiek van gelabelde cytoskeletcomponenten of van ingebedde tracerdeeltjes meten, zoals hier gedemonstreerd met gegevens van intermediaire filament (vimentine) netwerken en actieve actine-microtubule netwerken. Gebruikers zonder eerdere programmeer- of beeldverwerkingservaring kunnen DDM uitvoeren met behulp van dit softwarepakket en de bijbehorende documentatie.

Introduction

Het cytoskelet is een netwerk van eiwitfilamenten dat zich uitstrekt over het cytoplasma van eukaryote cellen en het celoppervlak verbindt met de kern. Het heeft unieke materiaaleigenschappen, biedt mechanische bescherming tegen grote en herhaalde mechanische belastingen, maar drijft ook dynamische celvormveranderingen^{aan 1}. Gereconstitueerde cytoskeletnetwerken kunnen aanleiding geven tot een reeks interessante dynamische gedragingen, van het opsluiten van ingebedde deeltjes tot ballistische bewegingen aangedreven door moleculaire motoren 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . Methoden om de dynamiek van dergelijke netwerken te analyseren omvatten het volgen van de beweging van ingebedde tracermicrosferen 6,7,12,13,14, beeldanalyse om de grootte van eiwitdichte clusters in de loop van de tijd te volgen 8, dynamische lichtverstrooiing¹⁵, deeltjesbeeld velocimetrie ^{4,16,17,18,19} , waarbij de spectrale vermogensdichtheid van beelden in de loop van de tijd^{wordt berekend 19}, en kymograafanalyse²⁰. Naarmate er meer studies naar gereconstitueerde cytoskeletnetwerken worden uitgevoerd, of het nu gaat om het begrijpen van cellulaire mechanica of actieve materie, worden robuuste, onbevooroordeelde en reproduceerbare methoden voor het karakteriseren van de dynamiek steeds noodzakelijker. Differentiële dynamische microscopie (DDM)^21,22, een relatief nieuwe techniek die is gebruikt om cytoskeletdynamica te bestuderen, is zo'n techniek die de dynamica efficiënt kwantificeert met weinig door de gebruiker gedefinieerde parameters. Met het hier beschreven softwarepakket kunnen onderzoekers met weinig ervaring in programmeren of beeldanalyse DDM gebruiken voor hun eigen werk.

DDM is een beeldanalysetechniek om de dynamiek van een monster te extraheren. Net als deeltjestracking of deeltjesbeeld velocimetrie vereist DDM een tijdreeks van afbeeldingen (vaak duizenden afbeeldingen), meestal vastgelegd met een microscoop. In tegenstelling tot het volgen van deeltjes, hoeven individuele kenmerken of tracerparels niet te worden gelokaliseerd (of zelfs gelokaliseerd) in de afbeelding. In tegenstelling tot zowel deeltjestracking als deeltjesbeeld velocimetrie, herstelt men de ensembledynamiek met DDM met relatief weinig door de gebruiker gespecificeerde parameters. Met DDM worden beelden geanalyseerd in de Fourierruimte om de vervaltijd van dichtheidsfluctuaties over een bereik van golfnummers te bepalen, q, waarbij q = 2πu en u de grootte van de ruimtelijke frequenties is, . Men verstrooiingsachtige informatie, maar met real-space beelden verkregen op een microscoop 21,22,23. Daarom kan men profiteren van de verschillende contrastgenererende methoden van microscopie, zoals widefield fluorescentie^22,24, confocale fluorescentie²⁵, gepolariseerde²⁶, donkerveld²⁷ of light-sheet fluorescentie²⁸ microscopieën. Bovendien kunnen afbeeldingen die worden gebruikt voor DDM-analyse worden gebruikt voor het volgen van deeltjes of deeltjesbeeld velocimetrie om aanvullende informatie te verstrekken.

Deze combinatie van kenmerken van dynamische lichtverstrooiing en optische microscopie maakt DDM een krachtige en veelzijdige techniek. Sinds de eerste beschrijving door Cerbino en Trappe in 2008²¹, waar werd aangetoond dat DDM de diffusie van 73 nm colloïdale deeltjes meet, is DDM gebruikt om stromende colloïden²⁹, colloïdale aggregatie ^30,31, de visco-elasticiteit van nematische vloeibare kristallen²⁶, de dynamiek van colloïdale gels³², grofschuim³³, nanodeeltjes in besloten omgevingen^34, 35,36,37, bacteriële beweeglijkheid 38,39,40,41, de diffusie van zwak verstrooiende eiwitclusters ⁴², capillaire golven bij vloeistofinterfaces⁴³ en andere systemen. Wie op zoek is naar een completere lijst van publicaties die DDM gebruiken, kan verwijzen naar grondige overzichtsartikelen over het onderwerp 22,23,44,45.

DDM is ook gebruikt om de dynamiek van biologische netwerken te onderzoeken. Drechsler et al. gebruikten DDM om de dynamiek van actine in levende Drosophila-eicellen te meten⁴⁶. Burla et al. kwantificeerden de dynamiek van tracerdeeltjes in netwerken van hyaluronaat en hyaluronaat-collageencomposieten⁴⁷. Verschillende toepassingen van DDM om de dynamiek van tracerdeeltjes in gereconstitueerde cytoskeletnetwerken ^9,10, het transport van DNA-moleculen in dergelijke netwerken^48,49 en de dynamiek van actieve gereconstitueerde netwerken zijn ook gedocumenteerd 11,50,51. Een voordeel van DDM bij het meten van de dynamiek in dergelijke systemen is dat individuele deeltjes of moleculen niet gelokaliseerd en gevolgd hoeven te worden. Zo kan bijvoorbeeld de dynamiek van DNA-moleculen in drukke omgevingen worden gemeten met DDM, ondanks de moeilijkheid om dergelijke kleine en niet-bolvormige moleculen te volgen. Bovendien kan men met fluorescentiemicroscopie multi-color labeling gebruiken om selectief de dynamiek van individuele bestanddelen in een complex composiet te meten.

Om DDM uit te voeren, wordt in de loop van de tijd een reeks afbeeldingen gemaakt, I (x, y, t). Voor een bepaalde vertragingstijd, Δt, worden alle (of een subset van) paren afbeeldingen gevonden, gescheiden door die vertragingstijd. De vierkante Fourier transformeert het verschil van elk paar,

wordt samen berekend en gemiddeld. Deze hoeveelheid, , is radiaal gemiddeld, op voorwaarde dat de dynamiek isotroop is. Dit levert de DDM-matrix op (ook wel de beeldstructuurfunctie genoemd), . Dit proces wordt grafisch weergegeven in figuur 1. Om de dynamiek van het monster uit deze DDM-matrix te bepalen, wordt aangenomen dat de DDM-matrix de vorm aanneemt

waarbij A de amplitude is, die afhankelijk is van de details van de microscoop en de structuur van het monster, B de achtergrond is, die afhankelijk is van de ruis in de beelden, en f (q, Δt) de intermediaire verstrooiingsfunctie (ISF), die informatie bevat over de dynamiek^21,22. In eenvoudige gevallen,

waarbij τ een karakteristieke verval- of decorrelatietijd is. Een dergelijke ISF is gebruikt in verschillende studies waarbij DDM wordt gebruikt op ergodische systemen zoals verdunde colloïdale suspensies 21,24,27,37,40,52. Andere vormen van de ISF kunnen echter worden gebruikt om verschillende soorten dynamiek te modelleren. Men kan bijvoorbeeld een cumulante expansie gebruiken om de ISF voor polydispersemonsters te modelleren als

waarbij μ een maat is voor de polydispersiteit^42,53; als dichtheidsfluctuaties door twee afzonderlijke modi vervallen, kan men een ISF-achtige gebruiken

^{26, 54, 55, 56, 57};

andere ISF's kunnen worden gebruikt voor zwemmende micro-organismen of andere actieve deeltjes 38,39,40,41,58,59.

Figuur 1: Overzicht van DDM-analyse. Uit de tijdreeks van beelden wordt de Fouriertransformatie van beeldverschillen berekend om de DDM-matrix te berekenen. De DDM-matrix kan worden aangepast aan een model om de tijdschaal van dichtheidsfluctuaties over een bereik van q-waarden te bepalen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Hier wordt het gebruik van een DDM-analysesoftwarepakket ontwikkeld in Python, PyDDM, beschreven. Dit softwarepakket bouwt voort op het werk dat onze onderzoekslaboratoria en andere gepubliceerde studies de afgelopen jaren hebben gedaan. Primaire motivatoren voor het maken van dit softwarepakket zijn de noodzaak om (1) metadata en parameters die bij de analyse worden gebruikt bij te houden en op te slaan; (2) grondige documentatie met gedetailleerde voorbeelden van analyse van begin tot eind; en (3) een eenvoudige manier om verschillende (of nieuwe) wiskundige modellen te gebruiken voor het aanpassen van de gegevens (bijvoorbeeld het toevoegen van ISF-modellen, zoals die onlangs zijn ontwikkeld voor actieve filamenten⁶⁰, zou eenvoudig zijn). Er bestaan ook andere softwarepakketten voor DDM-analyse, hoewel ze niet allemaal goed gedocumenteerd en geschreven zijn in een open-source programmeertaal. Er is bijvoorbeeld C++ code met computing op GPU's (https://github.com/peterlu/ConDDM)²⁵, C++ code die Fouriertransformaties in de tijd gebruikt om berekeningen te versnellen (https://github.com/giovanni-cerchiari/diffmicro)⁶¹, MATLAB- en Python-versies (https://github.com/MathieuLeocmach/DDM)⁴⁰, MATLAB-code (https://sites.engineering.ucsb.edu/~helgeson/ddm.html)²⁷ en MATLAB-code met onzekerheidskwantificering ( https://github.com/UncertaintyQuantification/DDM-UQ)⁶². Omdat dit PyDDM-pakket goed gedocumenteerd is en veel flexibiliteit biedt in hoe de DDM-matrix wordt berekend en geanalyseerd, kan het hopelijk nuttig zijn voor onderzoekers die DDM willen implementeren, ongeacht hun achtergrond in programmeren of beeldanalyse.

Het protocol laat zien hoe dit softwarepakket kan worden gebruikt om de dynamiek van in vitro gereconstitueerde cytoskeletnetwerken te kwantificeren. Dit wordt gedaan met behulp van twee verschillende sets beeldgegevens: (1) beelden van submicron tracerdeeltjes ingebed in een vimentinenetwerk genomen met brightfield-microscopie en (2) beelden van fluorescerend gelabelde actine- en microtubulefilamenten in een verstrengeld composietnetwerk met myosine-gestuurde activiteit genomen met laserscan confocale microscopie. De analyses van deze twee datasets benadrukken opmerkelijke sterke punten van DDM, waaronder het vermogen om beelden te analyseren die zijn gemaakt met een verscheidenheid aan beeldvormingsmodaliteiten (bijv. Brightfield of confocale fluorescentie), om dynamiek te extraheren uit ingebedde tracers of uit gelabelde filamenten, en om een verscheidenheid aan dynamieken te kwantificeren (bijv. Subdiffusief en beperkt of ballistisch).

Protocol

OPMERKING: Een Jupyter Notebook-bestand met de code die bij elke stap in het volgende protocol hoort, is te vinden op de volgende GitHub-opslagplaats, https://github.com/rmcgorty/PyDDM/tree/main/Examples. Een PDF van dat bestand is opgenomen in aanvullend dossier 1. Daarnaast is een walkthrough van de code en documentatie van elke functie en klasse te vinden op de website, https://rmcgorty.github.io/PyDDM/.

1. Software-installatie

1. Als u het voorbeeld van de DDM-analysebestanden wilt volgen, installeert u Jupyter Notebook voor het uitvoeren van de code. Installeer ook andere vereiste algemene Python-pakketten, waaronder NumPy en Matplotlib. Deze pakketten worden allemaal gebundeld geleverd met de Anaconda-distributie (zie https://www.anaconda.com/products/individual).
2. Installeer het Python-pakket xarray⁶³. Dit pakket is nodig voor het organiseren en opslaan van metadata en analyseparameters. Als u de Anaconda-distributie gebruikt, installeert u xarray (samen met de aanbevolen afhankelijkheden) met de opdracht:
   conda install -c conda-forge xarray dask netCDF4 bottleneck
3. Installeer het PyYAML-pakket met de opdracht:
   conda install -c anaconda yaml |
   Dit pakket is nodig voor het lezen van metadata over de te analyseren afbeeldingen en de parameters die door de gebruiker zijn ingesteld voor analyse en aanpassing.
4. Installeer het PyDDM-pakket door te downloaden van de GitHub-repository of met behulp van het git-commando:
   git kloon https://github.com/rmcgorty/PyDDM.git

2. Planning van de beeldvormingssessies

1. Kies de optimale beschikbare beeldmodaliteit en optische instellingen. Zoals gezegd kan DDM worden gebruikt met een aantal microscopiemethoden.
2. Om te helpen bij het plannen van de juiste objectieve lens en afbeeldingsgrootte om te gebruiken, bepaalt u het bereik van golfnummers, q, die worden onderzocht op basis van de pixelgrootte en de totale afbeeldingsgrootte. Controleer op basis van deze berekeningen of de keuze van de vergroting en het gezichtsveld optimaal zijn voor het experiment. Voor de hier geanalyseerde beelden werden een 60x 1,4 NA objectief en een beeldgrootte van 256 x 256 pixels met een pixelgrootte van 0,83 μm gebruikt voor het actieve actine-microtubule composietnetwerk. Voor de beelden van kralen ingebed in een vimentinenetwerk werd een 100x 1.4 NA objectief en een beeldgrootte van 512 x 512 pixels met een pixelgrootte van 0,13 μm gebruikt.
   OPMERKING: De minimale q wordt ingesteld door 2π/NΔx, waarbij de afbeeldingsgrootte (verondersteld vierkant te zijn) N is × N pixels met een pixelgrootte van Δx. Het maximum q is het minimum van π/Δx en 2π NA/λ, waarbij NA het numerieke diafragma van het beeldobject is en λ de golflengte van het licht (voor brightfield imaging kan men NA vervangen door (_NA-objectief +_NA-condensor)/2).
3. Overweeg vervolgens het bereik van de tijdschalen om te onderzoeken. Doorgaans wordt DDM-analyse uitgevoerd op sequenties van ten minste 1000 frames.
   1. Om de juiste framesnelheid te bepalen, moet u rekening houden met de verwachte tijd die functies in het voorbeeld nodig hebben om een afstand te verplaatsen in de volgorde van de minimale oplosbare lengteschaal (overeenkomend met de maximale q).
   2. Bij het overwegen van de bovengrens van het bereik van de onderzochte tijdschalen, moet u erkennen dat, typisch, het vermogensspectrum van honderden beeldverschillen van een bepaalde vertragingstijd Δt samen worden gemiddeld om voldoende statistieken te leveren om ruis te verminderen. Verkrijg daarom beeldreeksen die langer zijn dan de maximale tijdschaal die is onderzocht.
      OPMERKING: Als een verwachte diffusiecoëfficiënt, D, of snelheid, v, bekend is, dan kan men de verwachte karakteristieke vervaltijden schatten met behulp van τ = 1/Dq² of τ = 1/vq samen met het bereik van q, dat werd bepaald op basis van het gezichtsveld en de pixelgrootte. Het bereik van verwachte τ-waarden over het toegankelijke q-bereik kan helpen bij de keuze van de framesnelheid en het aantal frames dat moet worden verkregen.

3. Monstervoorbereiding en beeldacquisitie

OPMERKING: Voor details over de monstervoorbereiding en beeldvormingsinstellingen die zijn gebruikt voor de gegevens die worden gepresenteerd in de sectie representatieve resultaten, zie eerdere publicaties van de auteurs ^11,51,64 en Aanvullend bestand 2.

1. Op basis van de overweging van de tijd- en lengteschalen om te onderzoeken, verwerft u beeldreeksen van, idealiter, meer dan 1000 frames.
   OPMERKING: De code analyseert vierkante afbeeldingen of vierkante gebieden van belang in de afbeelding, dus pas de framegrootte dienovereenkomstig aan.
2. Sla afbeeldingsreeksen op als een driedimensionale TIFF-stapel grijswaarden. Als alternatief kan het formaat dat door Nikon Instruments-systemen wordt gebruikt, het ND2-formaat, worden gelezen door het geïnstalleerde pakket. Als afbeeldingen in een andere indeling zijn opgeslagen, gebruikt u ImageJ of een ander beeldverwerkingsprogramma om de afbeeldingen naar een TIFF-stack te converteren.
   OPMERKING: Als u ND2-bestanden gebruikt, moet het pakket nd2reader van https://github.com/Open-Science-Tools/nd2reader zijn geïnstalleerd.

4. Parameter instellen

1. Maak een kopie van het parameterbestand example_parameter_file.yml in de PyDDM-codeopslagplaats onder de map voorbeelden. Open dit YAML-bestand met een teksteditor zoals NotePad ++ of de teksteditor in JupyterLab. Zie Aanvullend bestand 2 voor een voorbeeld van een YAML-parametersbestand dat wordt gebruikt bij de analyse van gegevens die worden gepresenteerd in de sectie representatieve resultaten.
2. Geef in het gekopieerde YAML-bestand de gegevensmap en bestandsnaam op die overeenkomen met de te analyseren afbeeldingsvolgorde. Geef in het gedeelte metagegevens de pixelgrootte en framesnelheid op.
3. Geef in de sectie Analysis_parameters details over hoe de DDM-matrix moet worden berekend. Sommige parameters hier zijn optioneel.
   1. Geef minimaal waarden op voor de parameters number_lag_times en last_lag_time. Deze komen overeen met het aantal verschillende vertragingstijden waarvoor de DDM-matrix moet worden berekend en de langste vertragingstijd (in frames) om te gebruiken. Voor de gegevens van tracerparels in vimentin-netwerken die hier worden gebruikt, waren de parameters number_lag_times en last_lag_time respectievelijk 60 en 1000. De code berekent de DDM-matrix voor vertragingstijden van 1 frame (of een andere minimale vertragingstijd als de optionele parameter first_lag_time is opgegeven) tot de last_lag_time met logaritmische afstand.
      OPMERKING: Als M-frames werden verkregen, zou men de DDM-matrix kunnen berekenen voor een vertragingstijd zo groot als M-1. Echter, met slechte statistieken op zo'n grote vertragingstijd, zijn de gegevens waarschijnlijk luidruchtig. De langste vertragingstijd om de DDM-matrix te berekenen, hangt af van de details van de gegevens, maar we raden aan ongeveer een derde van de totale duur van de beeldreeks te proberen.
4. Geef details over hoe de DDM-matrix of de intermediaire verstrooiingsfunctie (ISF) in de sectie Fitting_parameters moet worden ingepast. Geef de naam van het model op onder de modelparameter. Geef de eerste schatting, ondergrens en bovengrens op voor elk van de aanpassingsparameters in het gekozen model.
   OPMERKING: Als u een lijst met de mogelijke montagemodellen wilt weergeven, voert u de functie print_fitting_models uit. De modellen zijn ook te vinden in de online documentatie op de PyDDM-website.

5. De DDM-matrix berekenen

1. Initialiseer een instantie van de klasse DDM_Analysis. Om dit te doen, geeft u de hierboven besproken metagegevens en analyseparameters door de bestandsnaam, met het volledige bestandspad inbegrepen, van het YAML-bestand door te geven aan DDM_Analysis. U kunt ook de metagegevens en parameters doorgeven als een Python-woordenboekgegevensstructuur.
2. Voer de functie calculate_DDM_matrix uit om de DDM-matrix te berekenen. Deze berekening kan enkele minuten of langer duren, afhankelijk van de framegrootte en het aantal vertragingstijden. Zie figuur 2 voor typische looptijden.
3. Inspecteer de geretourneerde gegevens, die zich in een gegevensstructuur bevinden van het xarray-pakket dat bekend staat als een dataset. Deze gegevensstructuur wordt opgeslagen onder het kenmerk ddm_dataset.
   OPMERKING: Niet alleen de DDM-matrix, maar ook bijbehorende variabelen en metagegevens worden in deze gegevensstructuur opgeslagen. Het wordt ook opgeslagen op schijf in een netCDF-indeling (Network Common Data Form).
4. Inspecteer de percelen en figuren, die worden gegenereerd en weergegeven. Deze cijfers worden ook opgeslagen als PDF-bestand in de gegevensmap.
   1. Zie dat een van de gegenereerde plots de ensemblegemiddelde kwadraatmodulus van de Fourier-getransformeerde afbeeldingen toont, als functie van q. Standaard gebruikt de code dit om de achtergrondparameter B te schatten. Schat de achtergrond van door aan te nemen dat deze, in de limiet van grote q, B/2 zal benaderen, waarbij B de achtergrond is.
   2. Als er geen plateau bij grote q wordt bereikt, gebruik dan een andere methode voor het schatten van B. Om dit te bereiken, stelt u de parameter background_method in het YAML-bestand of als een optioneel trefwoordargument in op de functie calculate_DDM_matrix. Meer details over de methoden voor het schatten van B worden gepresenteerd in de sectie representatieve resultaten.

Figuur 2: Rekentijd voor het berekenen van de DDM-matrix. In (A) en (B) wordt de tijd voor het berekenen van de DDM-matrix, weergegeven. De gebruikte gegevens zijn in alle gevallen een film van 5000 frames met een beeldformaat van 512 x 512 pixels. De DDM-matrix werd berekend voor 30 lag-tijden, logaritmisch verdeeld tussen 1 frame (0,01 s) en 1000 frames (10 s). De code werd uitgevoerd op een Intel i7-10700 2,90 GHz desktopcomputer met 32 GB RAM. In (A) wordt het effect weergegeven van het variëren van het aantal beeldverschillen dat wordt gebruikt bij het berekenen van de DDM-matrix voor elke vertragingstijd. Hiervoor worden de afbeeldingen weggegooid om te resulteren in een afbeeldingsgrootte van 256 x 256. Voor elke vertragingstijd Δt worden beelden gescheiden door die Δt afgetrokken en de resulterende matrix is Fourier getransformeerd. Voor een bepaalde Δt kunnen alle paren afbeeldingen, gescheiden door die Δt , worden gebruikt (weergegeven in blauw), alleen niet-overlappende beeldparen kunnen worden gebruikt (bijv. frames 1 en 10, 10 en 19, enz.; weergegeven in bruin), of 300 beeldparen of minder kunnen worden gebruikt voor elke Δt. In (B) wordt het effect van het wijzigen van de afbeeldingsgrootte op de rekentijd weergegeven. De afbeeldingen werden in een prullenbak gegooid door 2 x 2, 4 x 4 of 8 x 8 pixels te groeperen, wat resulteerde in afbeeldingsformaten van respectievelijk 256 x 256, 128 x 128 of 64 x 64. Voor elk worden ongeveer 300 beeldparen gebruikt bij het berekenen van de DDM-matrix voor elke Δt. (C) Uit de DDM-matrix kan de intermediaire verstrooiingsfunctie (ISF) worden geëxtraheerd. Dit wordt aangetoond voor de drie gevallen onder (A). De blauwe gegevenspunten (zonder offset) komen overeen met het ISF wanneer het maximale aantal beeldparen voor elke Δt wordt gebruikt; de bruine gegevenspunten (met een offset van 0,1) overeenkomen met het ISF wanneer voor elke Δt niet-overlappende beeldparen worden gebruikt; en de roze gegevenspunten (met een offset van 0,2) komen overeen met de ISF wanneer voor elke Δt maximaal 300 beeldparen worden gebruikt. De ISF die is gevonden met behulp van niet-overlappende beeldparen toont luidruchtigheid bij lange Δt. In dat geval worden weinig beeldparen gebruikt bij lange Δt (bijvoorbeeld voor Δt van 1000 frames worden slechts 4 beeldparen gebruikt). (D) Door de ISF in te passen op een exponentiële functie, wordt de karakteristieke vervaltijd, τ, voor elk golfnummer, q, bepaald. In roze worden de resultaten weergegeven na het invullen van de originele afbeeldingen met 2 x 2, wat resulteert in een afbeeldingsgrootte van 256 x 256. In grijs worden de resultaten na het ingooien weergegeven met 8 x 8, wat resulteert in een afbeeldingsgrootte van 64 x 64. Door de gegevens in te gooien gaat informatie over de dynamiek bij hogere golfnummers verloren, maar het berekenen van de DDM-matrix voor de 64 x 64 beelden is ongeveer 16x sneller dan voor de 256 x 256 beelden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

6. Montage van de DDM-matrix of de ISF

1. Initialiseer een instantie van de klasse DDM_Fit. Om dit te doen, geeft u DDM_Fit de bestandsnaam van het YAML-bestand met de metagegevens van de afbeelding en de parameters voor aanpassing.
2. Bepaal welk model voor de DDM-matrix of de ISF moet worden gebruikt voor het aanpassen van de gegevens. Maak een lijst van de beschikbare modellen door de functie print_fitting_models uit te voeren. Geef het model op dat moet worden gebruikt in het YAML-parameterbestand of met behulp van de functie reload_fit_model_by_name.
3. Stel de eerste gissingen en grenzen in voor elke parameter in het gekozen model in het meegeleverde YAML-parameterbestand. Als u de eerste schatting voor een parameter wilt wijzigen, gebruikt u de functie set_parameter_initial_guess. Stel grenzen in voor de parameters met de functie set_parameter_bounds. Bijvoorbeeld, zoals te zien is in Aanvullend bestand 2, voor de gegevens van tracerparels in het vimentinenetwerk, was de eerste schatting voor de vervaltijd 1 s en de grenzen op die parameter waren 0,01 s en 2000 s.
4. Voer de fit uit met de functie fit. Wijs een variabele toe aan de uitvoer van deze functie om eenvoudig toegang te krijgen tot de resultaten.
   OPMERKING: Deze functie kan veel optionele argumenten gebruiken. Zie de codedocumentatie en de voorbeelden voor een lijst met dergelijke argumenten en wanneer u kunt overwegen deze in te stellen op niet-standaardwaarden.

7. Interpreteren van de fit resultaten

1. Genereer plots voor het inspecteren van de pasvormen en de q-afhankelijkheid van de fitparameters met de functie fit_report.
   OPMERKING: Deze functie genereert een reeks plots, die ook als PDF worden opgeslagen. Optionele argumenten voor deze functie kunnen worden gebruikt om de geproduceerde plots te wijzigen.
2. Onder de gegenereerde plots bevindt zich een figuur met 2 x 2 subplots met de DDM-matrix of ISF (afhankelijk van het gekozen aanpassingsmodel) op vier q-waarden (gespecificeerd als een optioneel argument voor fit_report), samen met de berekende DDM-matrix of ISF met behulp van het model en de best passende parameters. Als u de DDM-matrix of ISF samen met de beste pasvorm op een interactieve manier wilt plotten, gebruikt u de klasse Browse_DDM_Fits zoals weergegeven in de meegeleverde voorbeelden wanneer de Jupyter Notebook-omgeving wordt gebruikt.
3. Bepaal uit de plot van de karakteristieke vervaltijd τ versus het golfnummer q of de dynamiek diffusief, subdiffusief, ballistisch of een ander type beweging volgt. Dit kan door te zoeken naar de machtsrechtelijke relatie tussen τ en q.
   OPMERKING: Op de log-log plot van τ vs. q gegenereerd door de functie fit_report, worden drie regels weergegeven, die overeenkomen met machtswet past over een bepaald bereik van q-waarden . De ononderbroken zwarte lijn komt overeen met het passen van τ vs. q aan een machtswet, τ = 1 / Kq^β, waarbij K en β vrije parameters zijn. De stippellijn in oranje komt overeen met aanpassing aan eenvoudige diffusie, τ = 1 / Dq², waarbij D een diffusiecoëfficiënt is. De stippellijn in blauw komt overeen met passen bij τ = 1 / vq, waarbij v een snelheid is.

8. De resultaten opslaan

1. De resultaten van de fit worden opgeslagen in een xarray dataset. Gebruik de xarray-functie to_netcdf of de ingebouwde pickle-module van Python om deze gegevensstructuur op schijf op te slaan. Gebruik de functie xarray open_dataset om deze netCDF-bestanden te laden.
2. Gebruik de functie save_fit_results_to_excel om de fit-resultaten, samen met de gegevens, op te slaan in een werkbladbestand.

Results

Hier laten we voorbeelden zien van de analyse die met PyDDM is gedaan vanuit twee verschillende sets experimenten. In een reeks experimenten werden sub-micron tracerparels ingebed in netwerken bestaande uit het intermediaire filamenteiwit vimentine en afgebeeld met een 100x objectieflens in brightfield-modus bij 100 frames / s (figuur 3A). Vimentine komt tot expressie in mesenchymale cellen en is een belangrijke determinant van de mechanische eigenschappen van het cytoplasma⁶⁵ en de mechanische stabiliteit van de kern in cellen die besloten migratie uitvoeren^66,67. Tot nu toe zijn gereconstitueerde vimentinenetwerken voornamelijk bestudeerd door macroscopische reologie 64,68,69, terwijl de dynamiek relatief weinig aandacht heeft gekregen 13,70,71. Aanvullende details van deze experimenten zijn te vinden in aanvullend dossier 2. In de andere reeks experimenten werden actieve cytoskeletnetwerken bereid met actine, microtubuli en myosine. Spectraal verschillende fluorescerende labels maakten het mogelijk om de actine- en microtubulefilamenten in beeld te brengen met een tweekleurige laserscanconfiscale microscoop met behulp van een 60x objectief objectief bij 2,78 frames / s (figuur 3B, C). Actine- en microtubulefilamenten zijn beide belangrijke aanjagers van dynamische celvormveranderingen, waarbij hun acties worden gecoördineerd door mechanische en biochemische interacties⁷². Aanvullende details van deze experimenten zijn te vinden in¹¹. Individuele frames uit beeldreeksen die in deze experimenten zijn genomen, worden weergegeven in figuur 3.

Figuur 3: Beelden uit de geanalyseerde tijdreeks. (A) Brightfield-afbeelding van 0,6 μm kralen in een vimentinenetwerk. (B,C) Afbeelding van de (B) microtubuli en (C) actine in een actieve actine-microtubule composiet genomen met een 60x objectief op een laser-scanning confocale microscoop, met behulp van 561 nm excitatielicht voor de microtubule beeldvorming en 488 nm excitatielicht voor de actine beeldvorming. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Voor afbeeldingen van tracerkralen in vimentin-netwerken werden films van 5000 frames met een grootte van 512 x 512 pixels bij 100 frames / s opgenomen. Hieruit werd de DDM-matrix berekend op 60 logaritmisch gespreide vertragingstijden tussen 1 en 1000 frames, of 0,01 s en 10 s. Om de achtergrond te schatten, werd B, het gemiddelde van de in het kwadraat getransformeerde Fourier-getransformeerde afbeeldingen, berekend en gelijk gesteld aan ^55,73. Er werd aangenomen dat over de grootste 10% van de q-waarden deze grootheid gelijk is aan B/2 en dat B onafhankelijk is van q. Dit is de standaardmethode van het pakket voor het schatten van B, maar andere methoden zijn mogelijk door de parameter background_method in te stellen op een andere waarde.

Met de parameters A(q) en B bepaald uit , kan men de intermediaire verstrooiingsfunctie (ISF) uit de DDM-matrix halen. Voorbeeld-ISF's zijn weergegeven in figuur 4. In figuur 4A wordt de ISF van beelden van kralen met een diameter van 0,6 μm weergegeven die zijn ingebed in een netwerk met een vimentineconcentratie van 19 μM. In figuur 4B wordt de ISF voor hetzelfde type kralen in een netwerk met een vimentineconcentratie van 34 μM weergegeven. Interessant is dat in geen van beide gevallen de ISF tot nul is vervallen. Bij grote vertragingstijden zou de ISF de nul moeten benaderen voor ergodische systemen. Dat wil zeggen, in dergelijke systemen moeten dichtheidsfluctuaties volledig decorreeren over grote vertragingstijden. Het feit dat de ISF hier niet tot nul is vervallen, kan het gevolg zijn geweest van onnauwkeurige schattingen van A (q) en B, die werden gebruikt om de ISF te vinden uit de berekende DDM-matrix. Met name de hier gebruikte methode kan B in bepaalde scenario's overschatten⁶². Het is echter waarschijnlijker dat de dynamiek van de tracerkralen echt niet-goadisch is, omdat de kralen een vergelijkbare grootte hebben als de maaswijdte van het netwerk en daarom kooivormig kunnen worden. Andere gegevens bevestigden de bevinding van niet-activiteit. De kraalgrootte, 0,6 μm, was namelijk groter dan de berekende gemiddelde waarde voor de maaswijdten van 0,4 μm voor de 19 μM-concentratie en 0,3 μm voor de 34 μM-concentratie. Bovendien vertoonden de resultaten van het volgen van enkele deeltjes van deze tracerparels, die later worden getoond, ook beperkte beweging.

Figuur 4: Tussentijdse verstrooiingsfuncties op verschillende golfnummers voor vimentinenetwerken. De ISF wordt uitgezet als functie van de vertragingstijd voor q-waarden van ongeveer 1 tot 9 ^μm-1. (A) De ISF uit beelden van 0,6 μm kralen in een vimentinenetwerk met een vimentineconcentratie van 19 μM. (B) De ISF uit beelden van 0,6 μm kralen in een vimentinenetwerk met een vimentineconcentratie van 34 μM. Het lange vertragingstijdplateau van de ISF bij een waarde ruim boven nul duidt op niet-activiteit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aangezien de dynamiek waarschijnlijk niet-goodisch is, zijn de ISF's geschikt voor de vorm , waarbij C de niet-godiciteitsfactor ³² is. Deze vorm van de ISF is gebruikt in eerdere studies van niet-ergodische dynamica, zoals die van colloïdale gels^32,74 of tracerdeeltjes in actine-microtubulinetwerken ¹⁰. De gestippelde zwarte lijnen in figuur 4 tonen de pasvormen samen met de gegevens. Vanuit deze fits kan men nu kijken naar de q-afhankelijkheid van de vervaltijd, τ, en van de nonergodiciteitsparameter, C.

Figuur 5: Vervaltijd vs. golfnummer voor vimentinenetwerken. Van past tot de ISF wordt de vervaltijd τ bepaald voor een bereik van q-waarden . Voor de duidelijkheid, we tonen niet de waarde van τ voor elke q, maar slechts een logaritmisch gespreide verzameling. In blauw (tan) zijn de gegevens van beelden van 0,6 μm kralen binnen vimentinenetwerken met een vimentineconcentratie van 19 μM (34 μM). De foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviaties in τ over meerdere films (vier films voor de gegevens met het 19 μM-netwerk [blauw] en vijf films voor de gegevens met het 34 μM-netwerk [tan]). Rode stippellijnen markeren geschatte grenzen voor onze temporele en ruimtelijke resolutie, zoals beschreven in de resultaten. De ononderbroken zwarte lijn toont schaalvergroting, wat zou wijzen op diffusieve beweging. Geen van beide gegevenssets volgt deze schaling. Integendeel, kralen in het 19 μM-netwerk vertonen subdiffusieve beweging (met β > 2), en kralen in het 34 μM-netwerk vertonen beperkte of gekooide beweging. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De vervaltijden vertoonden een grote mate van onzekerheid, zowel bij de lage q als de hoge q extremen, zoals te zien is in figuur 5. De foutbalken op deze plot tonen de standaarddeviatie tussen vier video's geanalyseerd voor het geval van de lagere vimentineconcentratie of vijf video's geanalyseerd op de hogere concentratie. Om de bron van de grote onzekerheid aan deze uitersten te begrijpen, moet u zowel de temporele als de ruimtelijke resolutie overwegen. Geschatte limieten van de resolutie worden weergegeven met drie rode stippellijnen. De twee horizontale lijnen komen overeen met de onderzochte minimale en maximale vertragingstijden. Gezien de framesnelheid van 100 frames/s en de maximale vertragingstijd die overeenkomt met 1000 frames (20% van de totale videoduur), ging de nauwkeurigheid verloren bij het meten van dynamieken die sneller dan 0,01 s of langzamer dan 10 s plaatsvonden. Bij de lagere q-waarden waren de aanpassingswaarden voor τ groter dan 10 s. Daarom moeten grote onzekerheden worden verwacht in vervaltijden die groter zijn dan de maximale vertragingstijd. Aan de bovenkant van het q-bereik benaderde de vervaltijd de minimale vertragingstijd van 0,01 s, maar bleef erboven. In plaats van te worden beperkt door de temporele resolutie, kan bij deze hogere q-waarden de ruimtelijke resolutie de beperkende factor zijn. Gezien de pixelgrootte van 0,13 μm was de grootste waarde voor q ongeveer 24 ^μm-1. De diffractie-beperkte resolutie maakt echter niet noodzakelijkerwijs nauwkeurige metingen van de dynamiek op deze hoge ruimtelijke frequenties mogelijk. Het benaderen van de optische resolutie leidt tot een bovenste golfnummerlimiet van ongeveer 16 ^μm-1, gezien het numerieke diafragma van de objectieflens, NA, van 1,4 en de golflengte van het licht, . Dit wordt gemarkeerd door de verticale rode stippellijn in figuur 5. Inderdaad, de gegevens waren luidruchtig bij grote waarden van q. Zelfs vóór deze geschatte bovengrens van q werd een verhoogde onzekerheid in τ gezien, en dit zou kunnen zijn door het overschatten van q_max. Een slechtere optische resolutie dan voorspeld kan zijn omdat een olie-onderdompelingslens werd gebruikt om voorbij de coverslip in een waterig monster te fotograferen of omdat de condensorlens onvolmaakt was uitgelijnd.

Voor de 0,6 μm kralen ingebed in het minder geconcentreerde netwerk (19 μM vimentine), kan worden waargenomen uit de log-log plot van de vervaltijd versus golfnummer dat de vervaltijd afnam met golfnummer op een manier die consistent is met een machtswet (figuur 5). Het lijkt echter niet te volgen wat zou worden verwacht voor normale diffusieve beweging, waar . Integendeel, τ daalde steiler met toenemende q. Dit is indicatief voor subdiffusieve beweging, die vaak voorkomt voor kralen in drukke omgevingen zoals deze. Door τ(q) over het bereik van 1,4 ^μm-1 tot 12,3 ^μm-1 te monteren op een machtswet van de vorm τ = 1/Kq^β worden de transportparameters K = 0,0953 μm^β /s en β = 2,2. Voor degenen die meer gewend zijn om na te denken over normale diffusie versus subdiffusie in termen van de gemiddelde kwadraatverplaatsing (MSD) van tracerdeeltjes als functie van vertragingstijd (d.w.z. MSD = K 'Δt^α), is het nuttig om te erkennen dat de subdiffusieve schaalexponent in de MSD-vergelijking, α, gelijk is aan α = 2 / β. Met andere woorden, de waarde van β = 2,2 is consistent met een subdiffusieve schaalexponent in de MSD-vergelijking van α = 0,9. Men zou PyDDM instellen op τ(q) over dit bereik van q-waarden door de indexen van de array van q op te geven met de parameter Good_q_range in het YAML-bestand of door het optionele argument forced_qs door te geven aan de functie generate_fit_report. Het bereik van q van 1,4 ^μm-1 tot 12,3 ^μm-1 zou, voor de gegevens hier, overeenkomen met indices van de array van q van 15 tot 130.

Voor de 0,6 μm kralen in het meer geconcentreerde netwerk (34 μM) vertoonde de vervaltijd weinig afhankelijkheid van q. Dit komt waarschijnlijk door de niet-godiciteit van kralen in een netwerk met een kleinere maaswijdte. Om de niet-daagsheid in dit systeem te onderzoeken, moet de niet-godiciteitsparameter, C, worden uitgezet als een functie van q, zoals in figuur 6. Voor de 0,6 μm kralen in het 19 μM vimentine netwerk, C ≈ 0,2 met weinig afhankelijkheid van q (niet getoond). Voor het netwerk met 34 μM vimentine en voor een netwerk met een nog hogere concentratie van 49 μM vimentine was de log van C echter evenredig met q² zoals weergegeven in figuur 6. Deze relatie tussen C en q wordt verwacht voor beperkte beweging. Voor kralen die vastzitten in delen van het netwerk, wordt verwacht dat de MSD lang genoeg vertragingstijden zal plateau (d.w.z. waar is de MSD en δ² is de maximale MSD). Aangezien de ISF kan worden uitgedrukt in termen van de MSD als , en aangezien de niet-erodische ISF naar C gaat bij lange vertragingstijden (d.w.z., ), wordt de relatie verkregen^32,75. Daarom kan men C(q) gebruiken om δ² te vinden, en dit leverde δ² = 0,017 μm² en 0,0032 μm² op voor respectievelijk de vimentinenetwerken van 34 en 49 μM (overeenkomend met δ = 0,13 μm en 0,057 μm).

Figuur 6: Niet-godiciteitsparameter vs. golfnummer voor vimentin-netwerken. Van past op de ISF wordt de niet-goodbaarheidsparameter C bepaald voor een bereik van q-waarden . In tan (rood) zijn de gegevens van beelden van 0,6 μm kralen binnen vimentinenetwerken met een vimentineconcentratie van 34 μM (49 μM). De foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviaties in τ over meerdere films (vijf films voor de gegevens met het 34 μM-netwerk [tan] en vier films voor de gegevens met het 49 μM-netwerk [rood]). De y-as heeft logaritmische schaling. Men observeert een q-afhankelijkheid van C die volgt , waardoor de maximale gemiddelde kwadraatverplaatsing kan worden geëxtraheerd, δ². Past aan worden getoond met de effen lijnen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Men kan andere methoden gebruiken om de δ de opsluitingsgrootte uit de gegevens te halen, evenals de subdiffusieve exponent die is gevonden bij het onderzoeken van τ (q) op kralen binnen het vimentinenetwerk van 19 μM. Ten eerste kan men de methode beschreven door Bayles et ^al.76 en Edera et ^al.77 gebruiken om de MSD uit de DDM-matrix te extraheren. Met name deze methode vereist geen aanpassing van de DDM-matrix. Men hoeft alleen de DDM-matrix te berekenen, D(q, Δt), en (waaruit A(q) en B kunnen worden bepaald). Vervolgens, om de MSD te vinden, gebruikt men de relatie . Merk op dat deze methode om de MSD te vinden ervan uitgaat dat de verdeling van deeltjesverplaatsingen Gaussisch is, hoewel eerder werk heeft aangetoond dat, in bepaalde gevallen, spier- en skeletaandoeningen afgeleid van DDM overeenkomen met spier- en skeletaandoeningen van deeltjestracering, zelfs wanneer de verplaatsingen niet-Gaussisch zijn⁷³. Voor dit systeem is er, zoals verwacht⁷⁸, niet-Gaussiviteit in de verdeling van grote verplaatsingen, zoals te zien is in figuur S1. In het PyDDM-pakket moet de functie extract_MSD worden uitgevoerd, die retourneert . Ten tweede kan men single particle tracking gebruiken om de MSD te vinden. Hoewel DDM kan worden gebruikt om beelden te analyseren waarbij de hoge dichtheid van deeltjes of de beperkte optische resolutie nauwkeurige deeltjeslokalisatie verbiedt, konden we voor de beelden van 0,6 μm-kralen in vimentinenetwerken kralen lokaliseren en volgen met behulp van de trackpy-software (https://github.com/soft-matter/trackpy)⁷⁹. Dit softwarepakket voor het volgen van deeltjes maakt gebruik van de algoritmen die worden beschreven door Crocker en Grier⁸⁰.

Figuur 7: Gemiddelde kwadraatverplaatsing versus vertragingstijd voor vimentinenetwerken. De MSD werd bepaald met behulp van twee methoden. Eerst werd de MSD berekend op basis van de DDM-matrix (weergegeven met solide symbolen). Vervolgens werd de MSD bepaald met behulp van single-particle tracking (SPT) om deeltjestrajecten (open symbolen) te vinden. Foutbalken worden op dezelfde manier bepaald als beschreven in de vorige twee figuurlegendes. (A) spier- en skeletaandoeningen voor 0,6 μm-kralen in het vimentinenetwerk van 19 μM geven een subdiffusieve beweging aan, waarbij de twee methoden voor het vinden van de MSD goed overeenkomen. B) spier- en skeletaandoeningen voor 0,6 μm-kralen in het vimentinenetwerk van 49 μM geven een gekooide beweging aan, met een goede overeenstemming tussen de twee methoden voor het vinden van de vid en met de maximale MSD die is gevonden op basis van de parameter niet-godiciteit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De MSD's vs. vertragingstijd voor 0,6 μm kralen in het 19 μM vimentine netwerk en in het 49 μM vimentine netwerk zijn weergegeven in Figuur 7. In beide gevallen was de msd bepaald op basis van DDM het goed eens met de MSD die werd gevonden door single-particle tracking (SPT). Bovendien was voor het minder geconcentreerde netwerk de subdiffusieve schaalexponent (α in ) ongeveer 0,9. Dit komt overeen met de τ(q) schaal van gevonden door de ISF aan te passen om τ(q) te bepalen (dat wil zeggen, 2/2.2 = 0.9). Voor het meer geconcentreerde netwerk plateaut de MSD op langere vertragingstijden. De maximale MSD die werd gevonden door de q-afhankelijkheid van de niet-godiciteitsparameter te analyseren (weergegeven in figuur 7B met de horizontale lijn op δ² = 0,0032 μm²) was ongeveer dezelfde waarde waar de spier- en skeletaandoeningen van zowel SPT als DDM naartoe leken te gaan. Er is een discrepantie tussen de msd's met de langste vertragingstijd die zijn bepaald op basis van DDM en SPT in figuur 7A. Hoewel dit te wijten kan zijn aan een beperkt aantal lange vertragingstijdtrajecten, kan het ook zo zijn dat het verder optimaliseren van het bereik van q-waarden waarvoor de DDM-matrix wordt gebruikt om te schatten voor elke vertragingstijd (zoals gedaan door Bayles et ^al.76 en Edera et ^al.77) onze resultaten zou verbeteren, en een dergelijke optimalisatie zal de focus zijn van toekomstig werk.

Deze experimenten waarbij beeldsequenties werden vastgelegd van tracerparels ingebed in een netwerk van vimentine intermediaire filamenten maakten onafhankelijke analyses mogelijk: DDM (met behulp van het hier beschreven pakket) en SPT (met behulp van trackpy). Beide analyses kunnen de mate van subdiffusie en opsluitingslengte onthullen, waardoor men twee onafhankelijke beeldanalysetechnieken kan gebruiken om complementaire statistieken te bieden. Er zijn extra hoeveelheden die men kan vergelijken van SPT en DDM. Heterogeniteit in de dynamiek van het monster kan zich bijvoorbeeld openbaren als niet-Gaussiviteit in de verdeling van deeltjesverplaatsingen (d.w.z. de van Hove-verdeling) bepaald uit SPT, evenals in een ISF bepaald uit DDM die past bij een uitgerekte exponentiële^34,35. Figuur S1 toont de van Hove-verdeling voor de 0,6 μm deeltjes in vimentinenetwerken en bespreekt de uitrekkende exponent die wordt gevonden door het passen van de ISF's - metrieken die in eerdere studies tegelijkertijd werden gebruikt om de heterogene dynamiek van deeltjes binnen biomimetische systemen aan te tonen ^9,10,47 of andere drukke omgevingen ³⁴ . Als ander voorbeeld kan de ISF worden berekend op basis van deeltjestrajecten gemeten met SPT en vergeleken met de DDM-verworven ISF's. Hoewel de gemiddelde kwadraatverplaatsingen en verplaatsingsverdelingen de maatstaven zijn die het vaakst uit SPT-analyse worden getrokken, kan men ook de ISF berekenen uit deeltjestrajecten, met behulp van (zie figuur S2). Deze ISF kan worden vergeleken met door DDM gegenereerde ISF's en worden gebruikt om dynamieken te onthullen die niet zichtbaar zijn in de MSD⁵⁹.

Hoewel het verkrijgen van afbeeldingen van tracerdeeltjes binnen een netwerk iemand in staat kan stellen om de complementaire analysemethoden van SPT en DDM te gebruiken, is het belangrijk op te merken dat een voordeel van DDM ten opzichte van SPT is dat het geen afbeeldingen van kralen (of andere functies) vereist die gemakkelijk kunnen worden gelokaliseerd en gevolgd. Om dit punt aan te tonen, benadrukken we vervolgens de analyse van actieve netwerken van actine- en microtubulefilamenten, waarbij fluorescerende etikettering van actine en tubuline de beeldvorming van beide filamenttypen mogelijk maakt, van elkaar onderscheiden via verschillende fluoroforen, met een meerkleurige laserscan confocale microscoop.

Beelden werden verkregen met een laserscannde confocale microscoop van actine-microtubule-netwerken met activiteit aangedreven door myosine (konijnenskeletspieren myosine II; Cytoskelet #MY02). Details van de experimenten en resultaten zijn eerder beschreven¹¹, en de representatieve resultaten die hier worden getoond, zijn afkomstig van de analyse van twee films in het aanvullende materiaal (films S1 en S4) voor¹¹. Beide beeldreeksen werden opgenomen met 2,78 frames/s voor 1000 frames.

Om deze beelden te analyseren, werd de DDM-matrix berekend voor 50 vertragingstijden, variërend van 0,4 s tot 252 s (1 frame tot 700 frames). De DDM-matrix werd vervolgens aangepast aan het model , met als tussenliggende verstrooiingsfunctie . Er zijn dus vier passende parameters: A, τ, s en B. De resultaten van deze aanvallen zijn weergegeven in figuur 8. Er werd waargenomen dat de DDM-matrix voor een bepaalde q-waarde een plateau had bij lage vertragingstijden, toenam met de vertragingstijd en vervolgens plateaude (of tekenen vertoonde van beginnend plateau) bij grote vertragingstijden. De DDM-matrix voor de lagere waarden van q bereikte geen plateau bij lange vertragingstijden. Men mag daarom een slechte nauwkeurigheid verwachten bij het meten van de vervaltijd voor deze lage q (grote lengteschaal) dynamiek.

De karakteristieke vervaltijden, τ, van de fits naar de DDM-matrix zijn weergegeven in figuur 9. De resultaten worden gepresenteerd voor een actief actine-microtubule composietnetwerk (vergelijkbaar met film S1¹¹) en voor een actief actinenetwerk (vergelijkbaar met film S4¹¹). Beide netwerken werden bereid met dezelfde concentraties actine en myosine, maar het actine-only netwerk werd gecreëerd zonder tubuline, zoals beschreven in¹¹. Voor deze twee soorten actieve netwerken was de waargenomen machtsrechtelijke relatie . Deze schaling duidt op ballistische beweging en dat de door myosine aangedreven contractie en stroming de thermische beweging van de filamenten domineren. Van τ = (vq)^-1 kon een karakteristieke snelheid, v, worden gevonden van ongeveer 10 nm/s voor het actieve actine-microtubulenetwerk en 75 nm/s voor het actieve actinenetwerk. Deze waarden komen overeen met de deeltjesbeeld velocimetrie analyse van dezelfde video's getoond in¹¹. De schaling hield geen stand bij de lagere q-waarden voor het actieve actine-microtubule composietnetwerk. Dit komt waarschijnlijk omdat de werkelijke vervaltijden voor dit actine-microtubule composietnetwerk bij de lagere q-waarden langer zijn dan de maximale vertragingstijd van de berekende DDM-matrix. De maximale vertragingstijd wordt aangegeven met de horizontale rode lijn in figuur 9 en de vervaltijden weken af van de verwachte schaalvergroting in de buurt van deze langere tijden.

Figuur 8: DDM-matrix versus vertragingstijd voor een actief actine-microtubule composietnetwerk. De DDM-matrix voor verschillende waarden van q wordt uitgezet als functie van de vertragingstijd van een film van een samengesteld netwerk dat bestaat uit 2,9 μM actinemonomeren, 2,9 μM tubulinedimmeren en 0,24 μM myosine. Deze gegevens tonen de analyse van alleen het microtubulikanaal van een veelkleurige tijdreeks van afbeeldingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 9: Vervaltijd vs. golfnummer voor actieve actine-microtubulinetwerken. Uit het passen van de DDM-matrix wordt de vervaltijd, τ, als functie van golfnummer, q, gevonden. Plotted is τ vs q voor beelden van een actief actine-microtubule netwerk (waarbij alleen het microtubule kanaal wordt geanalyseerd) in bruin en voor beelden van een actief actinenetwerk in het groen. Beide netwerken hebben dezelfde concentraties actine en myosine (respectievelijk 2,9 μM en 0,24 μM); het actine-microtubule composiet heeft 2,9 μM tubuline dimeren. De vervaltijden voor het actieve actinenetwerk zijn veel kleiner dan de vervaltijden voor het actieve actine-microtubulenetwerk, wat wijst op een snellere beweging van het actieve actinenetwerk. In beide gevallen is de dynamiek ballistisch omdat de gegevens een trend volgen. Inzet: de plot van de ISF's versus de vertragingstijd geschaald door het golfnummer (Δt × q) toont een samenvouwing van de ISF's over een bereik van q-waarden . Dit duidt ook op ballistische beweging. De ISF's die in deze inzet worden weergegeven, zijn afkomstig van het actieve actinenetwerk. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Voor deze gegevens van actieve netwerken hebben we ervoor gekozen om de DDM-matrix aan te passen, . Dit staat in contrast met wat werd gedaan voor de gegevens van kralen in het vimentin-netwerk, waar A (q) en B werden geschat zonder enige aanpassing om de ISF, f (q, Δt) te isoleren. In dit geval werden voor de actieve netwerkgegevens A en B als passende parameters gelaten omdat de methoden die werden gebruikt om B te schatten niet resulteerden in goede pasvormen. De standaardmethode om B te schatten is om te berekenen en aan te nemen dat dit bij grote q naar B/2 gaat. Deze methode overschatte B echter voor deze gegevens, wat bleek uit het feit dat, bij het berekenen van de ISF's van B die op deze manier werden geschat (niet weergegeven), de ISF's groter waren dan 1 bij vroege vertragingstijden (terwijl ze van maximaal 1 naar nul of een niet-godiciteitsparameter met toenemende vertragingstijd zouden moeten gaan). Men kan andere methoden selecteren voor het schatten van B met behulp van de parameter background_method. Een van deze andere methoden is om B te schatten als het minimum van de DDM-matrix bij vroege vertragingstijden (ingesteld met background_method = 1). Een vergelijkbare methode werd gebruikt door Bayles et ^al.76, hoewel ze niet aannamen dat B constant was met q. Een andere optie is om B te schatten als de gemiddelde waarde over alle vertragingstijden van de DDM-matrix bij de maximale q (ingesteld met background_method=2). Deze verschillende methoden voor het schatten van de achtergrond, evenals de resultaten voor het toestaan van B als een vrij passende parameter, zijn weergegeven in figuur 10. Uit die plots kan men zien dat de amplitude, A, niet nul bereikte bij de grootste onderzochte q-waarden, omdat het geen plateau was bij grote q (figuur 10B), en omdat D (q_max, Δt) van een lager vertragingstijdplateau naar een hoger vertragingstijdplateau ging (d.w.z. bij q_max was er een niet-nul A; Figuur 10D). Daarom zou het niet passend zijn om B als of als passend te schatten. Men moet vs. q en D (q_max, Δt) vs. Δt inspecteren voordat men beslist hoe (of of) B te schatten.

Figuur 10: Achtergrond vs. golfnummer voor actieve actine-microtubule netwerken. Van het passen van de DDM-matrix, kan men de achtergrond, B, vinden als een functie van golfnummer, q. Getoond is B vs. q voor beelden van een actief actine-microtubule netwerk (waarbij alleen het microtubule kanaal wordt geanalyseerd) bepaald uit deze past bij de paarse symbolen. De drie ononderbroken lijnen in (A) tonen schattingen van de gevonden achtergrond zonder enige aanpassing. De bovenste, donkerste lijn in (A) toont de geschatte achtergrond met behulp van , wat geschikt kan zijn als plateaus een constante waarde bij grote q bereiken. Van (B), merk op dat nog geen constante waarde heeft bereikt bij de grootste q onderzocht. Daarom overschat het gebruik van deze methode de achtergrond. De onderste regel in (A) toont de geschatte achtergrond met behulp van . Als de DDM-matrix een laag vertragingstijdplateau vertoont zoals weergegeven in (C) met de rode lijn, kan deze methode geschikt zijn voor het schatten van de achtergrond. De middelste, lichtste lijn in (A) toont de geschatte achtergrond van . Deze methode kan geschikt zijn als bij q_max de amplitude, A, nul heeft bereikt. Uit (D) blijkt dat de amplitude niet-nul is en daarom overschat deze methode de achtergrond. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende figuur S1: Kansverdelingen van deeltjesverplaatsingen. Kansverdelingen van deeltjesverplaatsingen vertonen niet-Gaussiviteit voor vimentineconcentraties van 34 μM en 49 μM. Single-particle tracking van 0,6 μm diameterparels werd uitgevoerd in vimentinenetwerken van verschillende concentraties. Verschillende vertragingstijden worden weergegeven in de verplaatsingsverdelingen voor de drie voorwaarden. (A) De verdeling van deeltjesverplaatsingen in een vimentinenetwerk van 19 μM is geschikt voor een Gaussiaanse functie. De breedte van de Gauss neemt toe met toenemende vertragingstijd. (B) De verdeling van deeltjesverplaatsingen in een vimentinenetwerk van 34 μM vertoont meer niet-Gaussiviteit, vooral bij grote verplaatsingen, dan voor het geval van 19 μM. (C) De verdeling van deeltjesverplaatsingen in een vimentinenetwerk van 49 μM vertoont ook niet-Gaussiviteit. Verder nemen de breedtes van de verdelingen niet zo significant toe met de vertragingstijd als in de monsters met lagere vimentineconcentraties, wat wijst op beperkte beweging. Niet-Gaussische van Hove-verdelingen (gezien voor alle vimentinemonsters, maar het meest zichtbaar in de hogere concentraties) worden geassocieerd met heterogene dynamiek zoals vaak wordt gezien bij het transport van deeltjes in drukke en besloten omgevingen. Een andere indicator van heterogeen transport die wordt bepaald aan de hand van DDM-analyse is de rekbare exponent die wordt gebruikt om de intermediaire verstrooiingsfunctie te passen (de parameter s in de vergelijking voor de ISF die hier wordt gebruikt: + ). De gemiddelde rekbare exponenten over het q-bereik van 0,4 ^μm-1 tot 9,4 ^μm-1 zijn, van de hoogste vimentineconcentratie tot de laagste, 0,53 ± 0,07, 0,64 ± 0,02 en 0,86 ± 0,04 (gemiddelde ± standaarddeviatie). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur S2: De tussenliggende verstrooiingsfuncties van DDM en SPT. De tussenliggende verstrooiingsfuncties (ISF) voor vijf verschillende golfnummers worden weergegeven. De ISF versus vertragingstijd gevonden via DDM wordt uitgezet met cirkelvormige markers, en de ISF berekend op basis van trajecten met één deeltje met open vierkanten. Gestippelde zwarte lijnen tonen de pasvormen op de door DDM verworven ISF's. De ISF wordt berekend op basis van trajecten met één deeltjes, met behulp van . In (A) wordt de ISF weergegeven voor 0,6 μm deeltjes in de 19 μM vimentine netwerken. In (B) wordt de ISF weergegeven voor 0,6 μm deeltjes in de 34 μM vimentinenetwerken. De discrepanties in de ISF die zijn gevonden bij DDM en SPT zijn waarschijnlijk te wijten aan een beperkt aantal lange vertragingstijdtrajecten. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend dossier 1: Protocol voor het gebruik van DDM. De invoer en uitvoer van de stappen die in het protocol worden weergegeven, worden gepresenteerd. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 2: Details van voorbeeldvoorbereiding en voorbeeldparameterbestanden voor vimentin-netwerken. Gedetailleerde stappen voor monstervoorbereiding en beeldacquisitie op vimentin-netwerken worden verstrekt. Daarnaast wordt ook een voorbeeldparametersbestand verstrekt voor de analyse van gegevens die worden gepresenteerd in de sectie representatieve resultaten over vimentin-netwerken. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

Het hier beschreven softwarepakket maakt gebruik van DDM om dichtheidsfluctuaties te analyseren die worden waargenomen in beelden die zijn verkregen met behulp van een optische microscoop. Representatieve resultaten van de gegevens van tracerdeeltjes ingebed in vimentinenetwerken werden voor het eerst getoond. De analyse van dergelijke gegevens kan worden gebruikt om de maaswijdte en stijfheid van het netwerk te karakteriseren op dezelfde manier als hoe single-particle tracking is gebruikt in veel eerdere studies van cytoskeletnetwerken ^6,12,13. Een voordeel van het gebruik van DDM ten opzichte van single-particle tracking is dat DDM niet vereist dat de deeltjes gelokaliseerd zijn. Daarom kan DDM zelfs in beelden waar de deeltjesdichtheid te hoog is of de deeltjes te klein om te lokaliseren en te volgen, nog steeds de dynamiek bepalen. Waar single-particle tracking voordelig zou zijn, is bij het inspecteren van deeltjes-tot-deeltjesvariabiliteit. Met DDM vindt men de gemiddelde dynamiek van het ensemble, terwijl men met single-particle tracking zowel de MSD van een enkel deeltje als de ensemblegemiddelde MSD kan berekenen. DDM kan echter worden gebruikt om heterogene dynamiek te onderzoeken door meerdere interessegebieden binnen een groot gezichtsveld te analyseren.

Vervolgens werden representatieve resultaten getoond van gegevens van fluorescerend gelabelde filamenten in een actief netwerk bestaande uit twee verschillend gelabelde cytoskeletale filamenttypen¹¹. Met deze gegevens werd de ballistische beweging gekarakteriseerd zonder dat er lokaliseerbare kenmerken in het beeld nodig waren. Omdat DDM de gemiddelde dynamiek van het ensemble extraheert met weinig gebruikersinvoer, maakt het het vergelijken van beeldreeksen verkregen met verschillende omstandigheden eenvoudig (bijvoorbeeld het vergelijken van monsters met verschillende verhoudingen van actine tot microtubuli of monsters met verschillende concentraties myosine, zoals gedaan in⁵⁰). Bovendien kunnen we met behulp van fluorescerende beeldvorming de dynamiek van verschillende componenten van een netwerk onderzoeken met behulp van multicolor-labeling. Dit werd gedaan in ^11,50, waar de dynamiek van actine en van microtubuli afzonderlijk werd geanalyseerd in een actief actine-microtubule composietnetwerk met behulp van multicolor imaging. In de sectie representatieve resultaten hier werden alleen de resultaten van het microtubulekanaal getoond, maar in eerder werk vergeleken we de dynamiek van de microtubule- en actinefilamenten¹¹.

We merken op dat deze representatieve resultaten ofwel passieve subdiffusie of actieve ballistische beweging laten zien. Belangrijk is dat DDM kan worden gebruikt om systemen te analyseren waarbij er een cross-over is in het type dynamiek op tussenliggende tijds- of lengteschalen. Als voorbeelden gebruikten Kurzthaler et al. DDM met een systeem van actieve Januscolloïden om actieve gerichte beweging op korte tijdschalen en randomisatie van de oriëntatie op langere tijdschalen^{te onderzoeken 59}; Giavazzi et al. gebruikten DDM met een grof schuim en vonden een cross-over in de dynamiek die overeenkomt met de lengteschaal van een bel³³; en Cho et al. gebruikten DDM met colloïdale gels en vonden drie onderscheidbare regimes op verschillende lengteschalen, variërend van de fractalclusters tot het hele netwerk³².

De gegevens in de sectie representatieve resultaten werden verkregen met brightfield-microscopie en laserscanning confocale microscopie. Zoals eerder opgemerkt, kan DDM echter met veel beeldvormingsmodaliteiten worden gebruikt. Bij elke beeldvormingsmodaliteit moeten gebruikers optische instellingen overwegen, zoals de mate van optische sectie of de scherptediepte. Een hoge mate van optische sectioning kan het signaal van onscherpe objecten verminderen, maar men zal niet in staat zijn om de dynamiek nauwkeurig te meten over tijdschalen die groter zijn dan de tijdschaal voor objecten om uit de scherptediepte te bewegen^25,28. Een meer grondige bespreking van hoe de q-afhankelijke scherptediepte DDM-analyse beïnvloedt, is te vinden in²². Voor brightfield imaging moeten gebruikers mogelijk ook rekening houden met de dikte van het monster. Terwijl voor zwak verstrooiende monsters dikkere monsters meer signaal⁴² kunnen leveren, kunnen troebele monsters de analyse moeten aanpassen om rekening te houden met meerdere verstrooiing⁸¹. Ten slotte, voor beeldvormingsmethoden die geen lineaire ruimte-invariant zijn (dat wil zeggen, waarbij de intensiteit die door de camera van een object wordt geregistreerd, afhangt van waar dat object zich in het x-y-monstervlak bevindt), moet men mogelijk rekening houden met de lineaire ruimtevariantie, zoals aangetoond met dark-field DDM²⁷.

Voor degenen die aan de slag gaan met DDM, willen we het belang benadrukken van het overwegen van de ruimtelijke en temporele resolutie. Bij het inspecteren van de vastgestelde vervaltijden als functie van het golfnummer, is het belangrijk om de grenzen van iemands resolutie te markeren (d.w.z. de maximale en minimale vertragingstijden en het maximale golfnummer, zoals gedaan in figuur 5). Men moet goed nadenken over deze limieten voordat u gegevens verzamelt, zodat de optimale objectieve lens, beeldgrootte, framesnelheid en filmduur kunnen worden geselecteerd. De andere belangrijke overweging is hoe de achtergrondparameter B moet worden geschat. In de literatuur zijn meerdere methoden gebruikt om de achtergrond te schatten en de effecten van over- of onderschatting van B zijn beschreven in eerdere publicaties^62,77. Zoals te zien is in figuur 10, stelt PyDDM gebruikers in staat om verschillende methoden te implementeren voor het schatten van B, en we raden nieuwe gebruikers aan deze methoden te proberen en te evalueren welke geschikt zijn om te gebruiken.

Een kracht van dit pakket is de grondige documentatie en walkthroughs met voorbeeldgegevens, de opslag en organisatie van metadata om bij te houden hoe analyses werden uitgevoerd, en de flexibiliteit in het analyseren van de DDM-matrix (verschillende aanpassingsmodellen, meerdere methoden voor het schatten van de achtergrondparameter B, de mogelijkheid om de MSD te vinden). Er zijn echter meerdere aspecten aan deze code die kunnen worden verbeterd. Momenteel is de code niet geoptimaliseerd voor een snelle rekensnelheid. Methoden voor het versnellen van de berekening zijn gemeld^61,62, en deze zullen worden geïmplementeerd in toekomstige releases. Daarnaast zijn we van plan om recent gerapporteerde methoden te implementeren om onzekerheden beter in te schatten en simulaties te gebruiken om gebruikers naar het juiste ISF-model⁶² te leiden. Voor andere verbeteringen hopen we dat gebruikers contact met ons opnemen met suggesties.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CMOS camera, Orca-Flash 4.0	Hamatsu
F-127 Pluronic	Sigma Aldrich
Jupyter Notebook
Nanodrop	Thermo Fisher
Nikon Ti-Eclipse microscope	Nikon
PLL-PEG-bio	SuSos AG, Dübendorf, Switzerland
Polystyrene beads	Sigma Aldrich
Protein dialysis mini-cassette	Thermo Fisher
PyDDM	University of San Diego	N/A	Open source software available from https://github.com/rmcgorty/PyDDM