Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Multi-Stream Perfusion Bioreactor geïntegreerd met Outlet Fractionation voor dynamische celcultuur

2.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/63935

⸱

20 juli 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical and Biochemical Engineering, Rutgers University, 2Department of Biomedical Engineering, Rutgers University, 3Department of Medicine, Rutgers Biomedical Health Sciences

In dit artikel

Samenvatting

Dit artikel presenteert een methode om een goedkoop, meerkanaals perfusiecelkweeksysteem te construeren en te gebruiken voor het meten van de dynamiek van secretie en absorptiesnelheden van opgeloste stoffen in cellulaire processen. Het systeem kan cellen ook blootstellen aan dynamische stimulusprofielen.

Samenvatting

Bepaalde cel- en weefselfuncties werken binnen de dynamische tijdschaal van minuten tot uren die slecht worden opgelost door conventionele kweeksystemen. Dit werk heeft een goedkoop perfusiebioreactorsysteem ontwikkeld waarmee kweekmedium continu kan worden doordrenkt in een celkweekmodule en gefractioneerd in een downstream-module om de dynamiek op deze schaal te meten. Het systeem is bijna volledig opgebouwd uit in de handel verkrijgbare onderdelen en kan worden geparallelliseerd om tegelijkertijd onafhankelijke experimenten uit te voeren in conventionele multi-well celkweekplaten. Dit videoartikel demonstreert hoe de basisopstelling moet worden samengesteld, waarvoor slechts een enkele meerkanaals spuitpomp en een gemodificeerde fractiecollector nodig zijn om tot zes culturen parallel te laten doordringen. Er worden ook nuttige varianten op het modulaire ontwerp gepresenteerd die een gecontroleerde stimulatiedynamiek mogelijk maken, zoals opgeloste pulsen of farmacokinetisch-achtige profielen. Belangrijk is dat als opgeloste signalen door het systeem reizen, ze worden vervormd als gevolg van opgeloste dispersie. Verder wordt een methode beschreven voor het meten van de verblijftijdverdelingen (RTD's) van de componenten van de perfusieopstelling met behulp van MATLAB. RTD's zijn nuttig om te berekenen hoe opgeloste signalen worden vervormd door de stroom in het systeem met meerdere compartimenten. Dit systeem is zeer robuust en reproduceerbaar, zodat basisonderzoekers het gemakkelijk kunnen gebruiken zonder dat er gespecialiseerde fabricagefaciliteiten nodig zijn.

Inleiding

Veel belangrijke biologische processen vinden plaats in cel- en weefselculturen op de tijdschaal van minuten tot uren 1,2,3. Hoewel sommige van deze verschijnselen op een geautomatiseerde manier kunnen worden waargenomen en vastgelegd met behulp van time-lapse microscopie4, bioluminescentie1 of andere methoden, worden experimenten met het verzamelen van cultuursupernatantmonsters voor chemische analyse vaak handmatig uitgevoerd in statische celculturen. Handmatige bemonstering beperkt de haalbaarheid van bepaalde onderzoeken vanwege het ongemak van frequente of na sluitingstijdstips. Verdere tekortkomingen van statische kweekmethoden omvatten experimenten met gecontroleerde, voorbijgaande blootstelling aan chemische stimuli. In statische culturen moeten stimuli handmatig worden toegevoegd en verwijderd, en stimulusprofielen zijn beperkt tot stapsgewijze veranderingen in de loop van de tijd, terwijl mediumveranderingen ook andere mediumcomponenten toevoegen en verwijderen, die cellen op een ongecontroleerde manier kunnen beïnvloeden5. Fluidic-systemen kunnen deze uitdagingen overwinnen, maar bestaande apparaten stellen andere uitdagingen. Microfluïdische apparaten komen met de onbetaalbare kosten van gespecialiseerde apparatuur en training om te produceren en te gebruiken, vereisen microanalytische methoden om monsters te verwerken en cellen zijn moeilijk te herstellen van de apparaten na perfusie6. Er zijn weinig macrofluïdische systemen gemaakt voor de soorten experimenten die hier worden beschreven 7,8,9,10, en ze zijn gebouwd van meerdere aangepaste onderdelen die in eigen huis zijn gemaakt en vereisen meerdere pompen of fractiecollectoren. Bovendien zijn de auteurs niet op de hoogte van commercieel verkrijgbare macrofluïdische perfusiecelkweeksystemen anders dan geroerde tankbioreactoren voor suspensiecultuur, die nuttig zijn voor biomanufacturing, maar niet zijn ontworpen voor het modelleren en bestuderen van fysiologie.

De auteurs rapporteerden eerder over het ontwerp van een goedkoop perfusiebioreactorsysteem dat bijna volledig bestaat uit in de handel verkrijgbare delen11. De basisversie van het systeem maakt het mogelijk om meerdere culturen in een putplaat in een CO2-incubator te bewaren en continu te doordrenken met medium van een spuitpomp, terwijl de effluentmediumstromen uit de culturen in de loop van de tijd automatisch in monsters worden gefractioneerd met behulp van een fractiecollector met een aangepaste modificatie. Dit systeem maakt dus geautomatiseerde bemonstering van kweekmedium supernatant en continue opgeloste input naar de culturen in de loop van de tijd mogelijk. Het systeem is macrofluïdisch en modulair en kan eenvoudig worden aangepast aan de behoeften van nieuwe experimentontwerpen.

Het algemene doel van de hier gepresenteerde methode is om een perfusiecelkweeksysteem te construeren, karakteriseren en gebruiken dat experimenten mogelijk maakt waarbij de secretie- of absorptiesnelheden van stoffen door cellen in de loop van de tijd worden gemeten en / of cellen worden blootgesteld aan nauwkeurige, voorbijgaande opgeloste signalen. In dit videoartikel wordt uitgelegd hoe u de basisopstelling samenstelt, die in staat is om tot zes celculturen tegelijkertijd te perfuseren met behulp van een enkele spuitpomp en een gemodificeerde fractiecollector. Twee nuttige varianten op het basissysteem die gebruik maken van extra pompen en onderdelen om experimenten mogelijk te maken die cellen blootstellen aan voorbijgaande opgeloste concentratiesignalen, waaronder korte pulsen en farmacokinetisch-achtige profielen12, worden ook gepresenteerd, weergegeven in figuur 1.

figure-introduction-1
Figuur 1: Drie variaties op het ontwerp van het perfusiesysteem. (Boven) Het basisperfusiesysteem. (Midden) Het perfusiesysteem met een stopkraan voor meerdere mediumbronnen. (Onder) Het perfusiesysteem met een geroerde tank om een goed gemengd distributievolume na te bootsen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Door dispersie en diffusie binnen de stroming worden de opgeloste signalen vervormd of "besmeurd" terwijl ze door het stromingssysteem reizen. Deze vervorming kan worden gekwantificeerd door het gebruik van verblijftijdverdelingen (OTO's)13. In dit artikel wordt uitgelegd hoe tracerexperimenten kunnen worden uitgevoerd op onderdelen van het perfusiesysteem (afbeelding 2) en worden MATLAB-scripts gebruikt om RTD's te genereren op basis van gemeten gegevens. Een gedetailleerde uitleg van deze analyse is te vinden in het vorige artikel11 van de auteurs. Aanvullende MATLAB-scripts passen geschikte functies toe aan de RTD's en extraheren fysieke parameters, en voeren signaalconvolutie uit met behulp van RTD's om te voorspellen hoe opgeloste signaalinvoer door de gebruiker zich zal verspreiden en vervormen door het perfusiesysteem14.

figure-introduction-2
Figuur 2: Verblijftijdverdelingen. De RTD's van componenten van het stromingssysteem, zoals deze lengte van de buizen, worden gemeten door een puls tracer in het systeem in te voeren en te meten hoe het "uitstrijkt" tegen de tijd dat het de verzamelde fracties verlaat. Dit cijfer is aangepast van Erickson et al.11. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Bereid onderdelen voor op de perfusie van de putplaat

  1. Buizen voorbereiden
    1. Snijd twee lengtes siliconen slang (1,6 mm binnendiameter) voor elke celcultuur die moet worden doordrenkt. Zorg ervoor dat het stuk dat als stroomopwaartse buis wordt gebruikt lang genoeg is om van de spuitpomp naar de celcultuur in de incubator te reiken en dat het stroomafwaartse stuk van de celcultuur naar de verste verlengde positie van de fractiecollector kan reiken.
    2. Geef elk stuk buis een uniek label aan beide uiteinden met gelabelde tape.
  2. Maak stoppers klaar voor de putplaat
    1. Verkrijg één siliconen stop voor elke put van de putplaat die moet worden doordrenkt, met een geschikte diameter om knus in de putten te passen met een luchtdichte afdichting.
    2. Snijd overtollig materiaal van de bodems van de stop af, zodat ze in de putjes passen en laat binnen ruimte voor lucht boven het beoogde vloeistofniveau.
    3. Duw twee stompe naalden van 18 G door elke stop, naar boven en naar buiten vanaf de onderkant om te dienen als de inlaat en uitlaat voor de stroom door de put, diametraal tegenover elkaar om de afstand tussen hun uiteinden in de put te maximaliseren.
    4. Pas de hoogten van de naalden in de aangesloten put aan, omdat de hoogte van de uitlaatnaald de stabiele hoogte van het vloeistofniveau in de put tijdens de perfusie bepaalt.
      OPMERKING: Als de perfusie wordt gestart met de uitlaatnaald boven het vloeistofniveau, zal de vloeistof zich ophopen in de put totdat het niveau de naald bereikt. Als de perfusie wordt gestart met de uitlaatnaald onder het vloeistofniveau, blijft het vloeistofniveau stabiel, tenzij er luchtbellen in de put stromen, waardoor de vloeistofhoogte daalt totdat deze dezelfde hoogte heeft als de uitlaatnaald.
  3. Verzamel extra onderdelen
    1. Verkrijg één steriele spuit voor elke celcultuur die moet worden toegediend en die groot genoeg is om voldoende medium te bevatten voor de hele perfusie, plus een extra hoeveelheid medium om in eerste instantie de slang te vullen.
    2. Voor elke cultuur die moet worden doordrenkt, verkrijgt u één female-to-barb en twee male-to-barb Luer-connectoren, evenals twee vrouwelijke en twee mannelijke Luer-caps.
  4. Onderdelen reinigen en steriliseren
    1. Als onderdelen eerder zijn gebruikt, reinig ze dan door ze te perfuseren met 0,1 N NaOH, gevolgd door een spoeling met gedeïoniseerd water.
    2. Door autoclaveren of anderszins, zorg voor de steriliteit van alle hierboven genoemde onderdelen.

2. Lasergesneden de multi-head dispenser en bevestig deze aan een fractiecollector

  1. Maak het multi-head dispensermodel uit figuur 3 opnieuw in een computerondersteund ontwerpprogramma of download het meegeleverde DXF-modelbestand (supplementair bestand 1).
  2. Gebruik een lasersnijder om het ontwerp uit een 1/8 in acrylplaat te snijden.
  3. Verwijder de drie schroeven die de doseerkop aan de bewegende basis van de fractiecollector bevestigen.
  4. Lijn de drie kleinste gaatjes in de multikopdispenser uit met de schroefgaten in de bewegende basis en schroef de schroeven terug door de gaten om te bevestigen.
  5. Pas de dichtheid van de drie schroeven aan om de multikopdispenser op en neer te zetten totdat de rij doseergaten is uitgelijnd met de opvangbuizen eronder.
  6. Plaats voorzichtig 300 μL pipetpunten door de gewenste gaten om als doseerpunten te dienen.
    OPMERKING: De fractiecollector kan worden gebruikt zonder de multi-head dispenser om een enkele celcultuur te perfuseren.

3. Meet component RTD's en voer signaalconvolutie uit

  1. Stel pompen en spuiten in voor tracerpuls zoals weergegeven in figuur 2.
    1. Verkrijg twee eenkanaals of meerkanaals spuitpompen.
    2. Kies een achtergrondoplossing om het medium weer te geven dat in het stroomsysteem zal worden gebruikt tijdens celkweekexperimenten. Zorg ervoor dat de achtergrondoplossing vergelijkbare massaoverdrachtseigenschappen heeft als het medium. In veel gevallen is gedeïoniseerd water een geschikte keuze.
    3. Kies een tracerstof om de opgeloste stof weer te geven die van belang zal zijn tijdens celkweekexperimenten. Zorg ervoor dat de tracer vergelijkbare massaoverdrachtseigenschappen heeft als de opgeloste stof van belang en dat de concentratie ervan kan worden gemeten. In veel gevallen is voedselkleurstof een geschikte keuze.
    4. Los de tracerstof op in de achtergrondoplossing om de traceroplossing te maken.
    5. Vul één spuit met een achtergrondoplossing en laad deze in één spuitpomp. Vul een andere spuit met traceroplossing en laad deze in de tweede spuitpomp.
    6. Sluit beide spuiten aan op twee van de drie poorten van een vierwegstopkraan met behulp van Luer-connectoren.
    7. Sluit de stopkraan bij de achtergrondoplossing en pomp de traceroplossing in de stopkraan totdat deze uit de open poort begint te druppelen. Stop de pomp en stel de spuit niet verder af.
      OPMERKING: Het is belangrijk dat de bewegende staaf van de spuitpomp tegen de zuigers van de spuit wordt geduwd voordat de getimede delen van het experiment beginnen. Hierdoor kan de stroom onmiddellijk beginnen wanneer de pomp wordt gestart. Anders kan de pomp worden gestart, maar de stroom zal pas echt beginnen als de bewegende stang de positie van de zuiger inhaalt.
    8. Sluit de stopkraan bij de traceroplossing en pomp de achtergrondoplossing in de stopkraan totdat alle resterende traceroplossing uit de open poort is gespoeld. Stop de pomp en stel de spuit niet verder af.
  2. De interessante stroomsysteemcomponent en de fractiecollector instellen
    1. Stel de gewenste stroomsysteemcomponent in voor RTD-analyse. Zorg ervoor dat het te meten onderdeel eindigt met een stuk stroomafwaartse buis van geschikte lengte en flexibiliteit om de fractiecollector tijdens bedrijf te bereiken.
    2. Plaats het uiteinde van de stroomafwaartse buis in een pipetpuntdispenser in de multi-head dispenser, zodat deze nauw aansluit.
    3. Bevestig de open poort van de vierwegstopkraan aan de inlaat van het te meten onderdeel. Pomp de achtergrondoplossing door het onderdeel totdat het volledig is gevuld zoals tijdens een celkweekexperiment en het begint uit de fractiecollector te druppelen. Stop de pomp.
  3. Injecteer tracerpuls, verzamel fracties en meet tracer
    1. Stel de pomp voor de traceroplossing in op het gewenste debiet. Sluit de stopkraan bij de achtergrondoplossing en start de stroom van de traceroplossing. Start tegelijkertijd de breukcollector.
    2. Ga gedurende een korte periode door met de stroom van de traceroplossing om een impulsinvoer van de tracer te benaderen. Een pulsduur van 10 minuten bleek goed te werken voor RTD's bij een stroomsnelheid van 1 ml / h.
      OPMERKING: Als de tracerpuls te kort is, komt er niet genoeg tracer in de stroom om meetbaar te zijn. Als de puls te lang is, zal deze niet langer een impuls benaderen en de vorm van de RTD veranderen.
    3. Stop aan het einde van de traceroplossingspulsperiode de traceroplossingspomp. Sluit de stopkraan snel bij de traceroplossing en start de stroom van de achtergrondoplossing met hetzelfde debiet.
    4. Laat de achtergrondoplossing stromen en fracties worden verzameld totdat alle tracer door het systeem en in de verzamelde fracties is gegaan.
    5. Stop het systeem en meet de tracerconcentratie in de fracties. Neem alleen fracties op die volledig zijn verstrekt. Als de verzameling halverwege de verzameling van een breuk wordt gestopt, neem die fractie dan niet op.
  4. Bereken de verblijftijdverdeling (RTD) op basis van gemeten gegevens in MATLAB
    OPMERKING: Een schriftelijke uitleg van de analyse die door dit MATLAB-script wordt uitgevoerd, is te vinden in de vorige publicatie van de auteurs11, en discussies over de theorie zijn op grote schaal beschikbaar in literatuur13.
    1. Maak een .xlsx bestand met de concentratiegegevens in de indeling van de example_tracer_data.xlsx spreadsheet in aanvullend bestand 2. Voer de concentratiewaarden van de tracer in de fracties (eventuele eenheden) in chronologische volgorde in van links naar rechts in rij 2. Voer de tijd in die is verstreken vanaf het begin van de puls tot het einde van de laatste fractie in cel A5 en voer de lengte van de tracerpuls in minuten in cel A8 in.
    2. Sla het .xlsx bestand op in de map MATLAB.
    3. Open het script RTD_From_Data.m, uit Aanvullend bestand 3, in de MATLAB-editor.
    4. Vervang de naam van het .xlsx-bestand tussen haakjes in de eerste regel van de sectie Gegevens laden van het script door de naam van het nieuwe .xlsx gegevensbestand, volgens de instructies in het scriptbestand. Voer het script uit.
    5. Zorg ervoor dat het script OTO-analyse 13 met succes uitvoert, waarbij een plot van deRTD wordt geproduceerd en de waarde van de numerieke integraal over de RTD gelijk is aan 1. Zoek de tijdvector (t) en de bijbehorende RTD-waardenvector (Et) die door het script is opgeslagen in de MATLAB-map.
  5. Een modelfunctie aanpassen aan de RTD in MATLAB
    1. Open het script Fit_RTD_Function.m. in de MATLAB-editor vanuit Aanvullend bestand 4.
    2. Kies een van de drie becommentarieerde modelfuncties die passen bij de RTD: het axiale dispersiemodel13, dat rtd's past voor laminaire stroming in cilindrische buizen; het CSTR-model13, dat goed geroerde tanks past; en het n-CSTR model15, dat ongeveer past op grotere putplaten. Als u een ander model wilt gebruiken dat hier niet is opgenomen, voegt u het toe aan het script in dezelfde indeling.
    3. Verwijder de opmerkingen in het gedeelte van het script met het model dat is gekozen voor aanpassing.
    4. Wijzig de waarden van de eerste schattingen voor de parameters in de waarden die geschikt zijn voor de RTD.
    5. Voer het script uit om een plot van de fit-functie over de RTD-gegevens te maken en om de fit-parameterwaarden voor de functie af te drukken. Als de pasvorm erg slecht is of als er fouten optreden, wijzigt u de eerste schattingen van de parameter en voert u het script opnieuw uit.
  6. Voer signaalconvolutie uit in MATLAB
    1. Kies één signaal en één RTD of twee RTD's om te convoleren.
    2. Open het script Signal_Convolution.m, uit Supplemental File 5, in de MATLAB-editor.
    3. Definieer voor elk van de twee signalen die moeten worden samengevoegd (d.w.z. één signaal en één RTD, of twee RTD's), één vector van gelijkmatig verdeelde tijdspunten in de gewenste eenheden en een overeenkomstige vector van signaalwaarden op die momenten.
      OPMERKING: De vectoren van de twee signalen moeten hetzelfde aantal elementen en tijdstappen van dezelfde grootte hebben. Daarom is het handig om de RTD als een continue functie te hebben die kan worden bemonsterd voor een willekeurig aantal punten op elk tijdsinterval.
    4. Voer de twee signalen in MATLAB in en voer het script uit om de tijd- en signaalvectoren van het uitgangssignaal te verkrijgen.

4. Stel het basisperfusiesysteem in met cellen in een putplaat

  1. Bereid de putplaat voor
    1. Zorg ervoor dat de putplaatcultuur de juiste gemiddelde diepte heeft voor het perfusie-experiment. Voer alle laatste mediumveranderingen, stimulaties of andere stappen uit zoals gewenst voordat u met de perfusie begint. Als suspensiecellen worden doordrenkt, centrifugeer dan de plaat om ervoor te zorgen dat ze zich op de bodem bevinden.
    2. Onder steriele omstandigheden steekt u de stoppen met naalden in de putplaatculturen met de naalden omhoog getrokken. Nadat de stop op zijn plaats is, verlaagt u de naalden tot de gewenste hoogte voor perfusie, omdat de hoogte van de uitlaatnaald het stabiele vloeistofniveau bepaalt.
    3. Sluit de naalden af met mannelijke Luer-doppen en bewaar de hele putplaat in een couveuse tot gebruik.
  2. Bereid de spuiten en stroomopwaartse slang voor
    1. Vul onder steriele omstandigheden één spuit voor elke cultuur die moet worden doordrenkt met voldoende medium voor de gewenste duur van de perfusie, plus voldoende extra medium om de stroomopwaartse slang te vullen.
    2. Bevestig de stroomopwaartse slang aan de spuit met behulp van een female-to-barb Luer-connector. Plaats aan het andere uiteinde van de buis een male-to-barb Luer-connector.
    3. Doseer medium uit de spuit totdat de stroomopwaartse buis volledig gevuld is met medium.
    4. Sluit het open uiteinde van de buis af met een vrouwelijke Luer-dop.
      OPMERKING: Alle replicaatspuiten moeten op dit punt precies hetzelfde volume hebben. Als hun volumes niet gelijk zijn, zullen hun plunjers zich in verschillende posities bevinden en passen ze niet allemaal goed in een enkele meerkanaals spuitpomp.
  3. Onder steriele omstandigheden steekt u een male-to-barb Luer-connector in het ene uiteinde van de stroomafwaartse buis en sluit u deze af met een vrouwelijke Luer-dop.
  4. Breng zorgvuldig alle voorbereide slangen, spuiten en de putplaat naar de incubator die zal worden gebruikt voor perfusie.
  5. Plaats de spuitpomp en fractiecollector op de gewenste plaatsen in de buurt van de incubator. Plaats de spuitpomp bovenop of in de buurt van de incubator en plaats de fractiecollector naast de incubator, in de buurt van de poort.
  6. Bundel de afgedekte uiteinden van alle stroomopwaartse en stroomafwaartse buizen en duw ze van de buitenkant van de incubator naar binnen door de poort.
  7. Laad de spuiten in de spuitpomp en steek de open uiteinden van de stroomafwaartse buizen in de doseerpipetpunten van de multikopdispenser van de fractiecollector.
  8. Trek in de incubator zoveel mogelijk speling van de stroomopwaartse buizen in de incubator om de lengte van de buizen te maximaliseren waardoor het stromende medium warmte en CO2 uit de incubatorlucht kan ontvangen. Terwijl u deze op hun plaats houdt, trekt u de stroomafwaartse buizen uit de incubator, net genoeg zodat ze het verste verlengde punt op de fractiecollector kunnen bereiken terwijl de afgedekte uiteinden nog steeds in de incubator worden gehouden.
  9. Voor elke aangesloten put, maak snel de naalden en de upstream en downstream buizen voor die put los en bevestig ze aan elkaar met hun Luer-connectoren.
  10. Zodra alle onderdelen zijn aangesloten, laat u de spuitpomp kort op een relatief hoge snelheid draaien om ervoor te zorgen dat alle stromen goed stromen.
  11. Op dit punt, als het gewenst is om het experiment te beginnen met de stroomafwaartse buizen vol met het medium, blijft de pomp draaien totdat ze allemaal zijn gevuld. Stop anders de pomp.
  12. Stel het debiet van de spuitpomp en de frequentie van het verzamelen van fracties in en start beide machines tegelijkertijd om het experiment te starten. Verzamel breuken voor de gewenste experimentduur.

5. Stel het perfusiesysteem in met een stopkraan voor meerdere mediumbronnen

  1. Voer alle substappen van stap 4.1 hierboven uit.
  2. Bereid de twee media voor die in de perfusie moeten worden gebruikt en label het medium dat als eerste wordt afgegeven als 1 en het andere als medium 2.
  3. Voor elke cultuur die moet worden toegediend, vult u één spuit met voldoende medium 1 voor de duur van de dispensatie, plus voldoende volume om het perfusiesysteem in eerste instantie te vullen. Vul een tweede spuit met voldoende medium 2 voor de duur van de dispensatie.
  4. Sluit beide spuiten aan op twee van de drie poorten van een vierwegstopkraan.
    OPMERKING: Een lengte van de slang om de spuiten op de stopkranen aan te sluiten, kan nodig zijn.
  5. Bereid de stopkraan en spuiten op dezelfde wijze als stap 3.1.7-3.1.8 hierboven door de stopkraan te sluiten tot medium 1 en medium 2 in de stopkraan te doseren totdat deze net uit de open poort begint te druppelen.
  6. Sluit de stopkraan op medium 2 en doseer medium 1 in de stopkraan totdat al het resterende medium 2 uit de open poort is gespoeld.
  7. Bevestig de upstream-buis aan de open stopkraanpoort met behulp van een female-to-barb Luer-connector. Plaats aan het andere uiteinde van de buis een male-to-barb Luer-connector.
  8. Doseer medium 1 uit de spuit totdat de stroomopwaartse buis volledig gevuld is met medium.
  9. Ga verder met de stappen 4.3-4.11 hierboven, laad beide spuiten in afzonderlijke spuitpompen en doseermedium 1.
  10. Stel het debiet van de spuitpomp in voor medium 1 en de frequentie van het verzamelen van breuken en start beide machines tegelijkertijd om het experiment te starten.
  11. Wanneer de mediumbron moet worden vervangen, stopt u snel de spuitpomp voor medium 1, draait u de stopkraan dicht op medium 1 en start u de spuitpomp voor medium 2. Schakel de bron indien gewenst later op een vergelijkbare manier terug naar medium 1.
  12. Verzamel breuken voor de gewenste experimentduur.

6. Stel het perfusiesysteem in met een geroerde tank om de farmacokinetiek na te bootsen

  1. Verkrijg farmacokinetische gegevens voor het geneesmiddel van belang en zorg ervoor dat het bestaat uit een concentratiepiek gevolgd door een exponentieel verval.
  2. Nadat u de piek op tijd 0 hebt ingesteld en gegevenspunten vóór de piek hebt verwijderd, gebruikt u het script van Stirred_Tank_Fit.m (Supplemental File 6) om de geroerde tank RTD-vergelijking op de gegevens aan te passen. Input v (het gewenste perfusiedebiet) en de gegevens die als een paar vectoren rechtstreeks in het script moeten worden ingepast, samen met t en C voor respectievelijk tijdwaarden en concentratiewaarden. Voer het script uit om de parameter V af te drukken, het vereiste geroerde tankvolume.
  3. Plan een lay-out voor het perfusiesysteem met twee spuitpompen en een platenschudder stroomopwaarts van de incubator.
  4. Meet de RTD's van de componenten van het perfusiesysteem voorbij de stopkraan en voer signaalconvolutie van de RTD's uit met verschillende pulsduur en concentraties van geneesmiddelen om een geschikt farmacokinetisch profiel te vinden. Gebruik de fit roerde tank RTD-vergelijking in deze berekening.
  5. Ga verder met de stappen 5.1-5.8 hierboven.
  6. Gebruik een extra putplaat van de juiste grootte als de geroerde tank voor de opstelling. Elke put kan dienen als een geroerde tank voor één doordrenkte cultuur. Vul de put met het vereiste volume medium, V, en sluit de put met de naalden die in eerste instantie omhoog worden getrokken, vervolgens naar de bodem van de put worden geduwd en de naalden doppen.
  7. Plaats de spuiten in de spuitpompen en sluit de slang van de spuiten snel aan op de afgedekte inlaatnaalden van de geroerde tanks. Sluit vervolgens de celcultuur stroomopwaartse buisinlaten aan op de uitlaatnaalden van de geroerde tanks.
  8. Ga verder met stap 5.9-5.10.
  9. Schakel op het gewenste tijdstip over op doseermedium 2 dat het geneesmiddel bevat, zoals beschreven in stap 5.11. Schakel terug naar medium 1 wanneer de infusie van het geneesmiddel is voltooid.
  10. Ga verder met stap 5.12.

figure-protocol-1
Figuur 3: De multi-head dispenser. Ontwerp voor de lasergesneden multi-head dispenser. Dit cijfer is aangepast van Erickson et al.11. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het perfusiesysteem met meerdere mediumbronnen uit sectie 5 van het protocol werd gebruikt om de expressiedynamiek te meten van een reportergen aangedreven door de nucleaire factor kappa-light-chain-enhancer van geactiveerde B-cellen (NF-κB) transcriptiefactor in menselijke embryonale nier 293 (HEK293) cellen in reactie op een 1,5 h puls van tumornecrosefactor alfa (TNF-α). HEK293-cellen werden stabiel getransduceerd met behulp van lentivirale vectoren met een genconstruct dat Gaussia luciferase (GLuc) bevat, aangedreven...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit werk beschrijft de assemblage en werking van een perfusiecelkweeksysteem met meerdere mediumbronnen aangetoond met een specifiek voorbeeld waarin de dynamiek van NF-κB-gedreven genexpressie als reactie op een voorbijgaande puls van TNF-α werd gemeten. De RTD's van de componenten van het perfusiesysteem werden gemeten en gemodelleerd, en signaalconvolutie werd gebruikt om zowel de blootstelling van de cellen aan de TNF-α-puls als de TNF-α-verdeling in de verzamelde effluentmediumfracties te voorspellen. De cellen werd...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.

Dankbetuigingen

Dit onderzoek is uitgevoerd met steun onder Grant Nos. R01EB012521, R01EB028782 en T32 GM008339 van de National Institutes of Health.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html
Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
18 Gauge 1 1/2- in Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing MachinesGrainger5FVK2
293T CellsATCCCRL-3216HEK 293T-cellen gebruikt in het Representatieve Resultaten-experiment.
96-Well Clear Bottom Plates, CorningVWR89091-010Platen voor het meten van kleurstofconcentraties in RTD-experimenten en GLuc in representatieve resultatenexperimenten.
BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips, 5 mLFisher Scientific14-829-45
BioFrac Fraction Collector Bio-Rad7410002Fractiecollector die kan worden gebruikt voor een enkele stroom of kan worden aangepast met onze methode om collectie uit meerdere stromen mogelijk te maken.
Clear High-Strength UV-Resistant Acrylic 12" x 12" x 1/8"McMaster-Carr4615T93Deze plaat wordt gesneden met een lasersnijder volgens het DXF-bestand in de aanvullende materialen om de multi-head dispenser te produceren die aan de BioFrac-fractiecollector kan worden bevestigd.
Coelenterazine nativeNanoLight Technology303Substraat dat wordt gebruikt in Gaussia luciferase bioluminescentie-assay in representatieve resultaten.
Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plates, size 48 wells, polystyrene plate, flat bottom wellsMillipore SigmaCLS3548Gebaten om 293T-cellen in representatieve resultaten te laten groeien en te perfunderen.
Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates, size 12 wellsFisher Scientific720081Kan worden aangesloten en gebruikt als een geroerde tank om farmacokinetische profielen in perfusie te produceren. Kan ook cellen bevatten voor perfusie.
DMEM, high glucoseThermoFisher Scientific11965126
Epilog Zing 24 LaserCutting Edge SystemsEpilog Zing 24Lasersnijder gebruikt om multi-head dispenser uit acrylplaat te produceren. Andere lasersnijders mogen worden gebruikt.
Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use, Luer-Lock, 20 mLFisher Scientific14-955-460
Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use, Luer-Lock, 60 mLFisher Scientific14-955-461
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mLFisher Scientific05-408-129Microcentrifugebuizen voor het verzamelen van fracties.
Fisherbrand Round Bottom Disposable Borosilicate Glass Tubes with Plain EndFisher Scientific14-961-26Glasbuizen voor het verzamelen van fracties.
Fisherbrand SureOne Micropoint Pipette Tips, Universal Fit, Non-FilteredFisher Scientific2707410300 ul pipettentips die het beste passen op de multi-head dispenser en slangen om als doseertips te fungeren.
Gibco DPBS, powder, no calcium, no magnesiumFisher Scientific21600010Fosfaat-gebufferde zoutoplossing.
Labline 4625 Titer ShakerMarshall ScientificLabline 4625 Titer ShakerOrbitale shaker gebruikt om geroerde tanks gemengd te houden.
Masterflex Fitting, Polycarbonate, Four-Way Stopcock, Male Luer Lock, Non-Sterile; 10/PKCole-ParmerEW-30600-04Gebaten om meerdere inlaatstromen voor RTD-experimenten en celkweekexperimenten samen te voegen.
Masterflex Fitting, Polycarbonate, Straight, Female Luer x Cap; 25/PKMasterflexUX-45501-28
Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Female Luer to Hosebarb Adapters, 1/16"Cole-ParmerEW-45508-00
Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer Lock to Hosebarb Adapter, 1/16" IDCole-ParmerEW-45518-00
Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer Lock to Plug Adapter; 25/PKMasterflexEW-30800-30
Masterflex L/S Precision Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone, L/S 14; 25 ftMasterflexEW-96410-14
MATLABMathWorksR2019bVersie R2019b. Nieuwere versies kunnen ook worden gebruikt. Sommige oudere versies kunnen werken.
NE-1600 Six Channel Programmable Syringe PumpNew Era Pump SystemsNE-1600
Rack Set F1Bio-Rad7410010Racks om de verzamelbuizen in de fractiecollector te houden.
Recombinant Human TNF-alpha (HEK293-expressed) Protein, CFBio-Techne10291-TA-020Cytokine gebruikt om 293T-cellen te stimuleren in representatieve resultaten.
Saint Gobain Solid Stoppers, Versilic Silicone, Size: 00, Bottom 10.5mmSaint GobainDX263015-50Past op 48-well platen.
Saint Gobain Solid Stoppers, Versilic Silicone, Size: 4 Bottom 21mmSaint GobainDX263027-10Past op 12-well platen.
Sodium Hydroxide, 10.0 N Aqueous Solution APHA; 1 LSpectrum ChemicalsS-395-1LT
SolidWorksDassault SystemsSolidWorksCAD-software gebruikt om het DXF-bestand van de multi-head dispenser te maken.
Varioskan LUX multimode microplate readerThermoFisher ScientificVL0000D0Plate reader.
Wilton Color Right Performance Color System Base Refill, BlueMichaels10404779Blauwe voedselkleurstof met Brilliant Blue FCF, gebruikt als tracer in RTD-experimenten. Absorptiespectrum piekt bij 628 nm.
```

Referenties

  1. Welsh, D. K., Yoo, S. H., Liu, A. C., Takahashi, J. S., Kay, S. A. Bioluminescence imaging of individual fibroblasts reveals persistent, independently phased circadian rhythms of clock gene expression. Current Biology. 14 (24), 2289-2295 (2004).
  2. Talaei, K., et al. A mathematical model of the dynamics of cytokine expression and human immune cell activation in response to the pathogen Staphylococcus aureus. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 711153(2021).
  3. Kemas, A. M., Youhanna, S., Zandi Shafagh, R., Lauschke, V. M. Insulin-dependent glucose consumption dynamics in 3D primary human liver cultures measured by a sensitive and specific glucose sensor with nanoliter input volume. FASEB Journal. 35 (3), 21305(2021).
  4. Muzzey, D., van Oudenaarden, A. Quantitative time-lapse fluorescence microscopy in single cells. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 25, 301-327 (2009).
  5. Calligaro, H., Kinane, C., Bennis, M., Coutanson, C., Dkhissi-Benyahya, O. A standardized method to assess the endogenous activity and the light-response of the retinal clock in mammals. Molecular Vision. 26, 106-116 (2020).
  6. Battat, S., Weitz, D. A., Whitesides, G. M. An outlook on microfluidics: the promise and the challenge. Lab on a Chip. 22 (3), 530-536 (2022).
  7. Petrenko, V., Saini, C., Perrin, L., Dibner, C. Parallel measurement of circadian clock gene expression and hormone secretion in human primary cell cultures. Journal of Visualized Experiments. (117), e54673(2016).
  8. Yamagishi, K., Enomoto, T., Ohmiya, Y. Perfusion-culture-based secreted bioluminescence reporter assay in living cells. Analytical Biochemistry. 354 (1), 15-21 (2006).
  9. Watanabe, T., et al. Multichannel perfusion culture bioluminescence reporter system for long-term detection in living cells. Analytical Biochemistry. 402 (1), 107-109 (2010).
  10. Murakami, N., Nakamura, H., Nishi, R., Marumoto, N., Nasu, T. Comparison of circadian oscillation of melatonin release in pineal cells of house sparrow, pigeon and Japanese quail, using cell perfusion systems. Brain Research. 651 (1-2), 209-214 (1994).
  11. Erickson, P., Houwayek, T., Burr, A., Teryek, M., Parekkadan, B. A continuous flow cell culture system for precision cell stimulation and time-resolved profiling of cell secretion. Analytical Biochemistry. 625, 114213(2021).
  12. Saltzman, W. M. Drug Delivery: Engineering Principles for Drug Therapy. , Oxford University Press. (2001).
  13. Fogler, H. S. Elements of Chemical Reaction Engineering. 4th edn. , Prentice Hall PTR. Boston. (2006).
  14. Conesa, J. A. Chemical Reactor Design: Mathematical Modeling and Applications. , Wiley. (2019).
  15. Toson, P., Doshi, P., Jajcevic, D. Explicit residence time distribution of a generalised cascade of continuous stirred tank reactors for a description of short recirculation time (bypassing). Processes. 7 (9), 615(2019).
  16. Tamayo, A. G., Shukor, S., Burr, A., Erickson, P., Parekkadan, B. Tracking leukemic T-cell transcriptional dynamics in vivo with a blood-based reporter assay. FEBS Open Biology. 10 (9), 1868-1879 (2020).
  17. Newell, B., Bailey, J., Islam, A., Hopkins, L., Lant, P. Characterising bioreactor mixing with residence time distribution (RTD) tests. Water Science and Technology. 37 (12), 43-47 (1998).
  18. Dubois, J., Tremblay, L., Lepage, M., Vermette, P. Flow dynamics within a bioreactor for tissue engineering by residence time distribution analysis combined with fluorescence and magnetic resonance imaging to investigate forced permeability and apparent diffusion coefficient in a perfusion cell culture chamber. Biotechnology and Bioengineering. 108 (10), 2488-2498 (2011).
  19. Gaida, L. B., et al. Liquid and gas residence time distribution in a two-stage bioreactor with cell recycle. HAL Open Science. , (2008).
  20. Rodrigues, M. E., Costa, A. R., Henriques, M., Azeredo, J., Oliveira, R. Wave characterization for mammalian cell culture: residence time distribution. New Biotechnology. 29 (3), 402-408 (2012).
  21. Olivet, D., Valls, J., Gordillo, M. A., Freixó, A., Sánchez, A. Application of residence time distribution technique to the study of the hydrodynamic behaviour of a full-scale wastewater treatment plant plug-flow bioreactor. Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 80 (4), 425-432 (2005).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Verblijftijdverdelingspuitenpompfractiecollectoraxiale dispersiemodelmulti wellplaattraceroplossingsolutiedispersie
Multi-Stream Perfusion Bioreactor geïntegreerd met Outlet Fractionation voor dynamische celcultuur
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.