Karakterisering van RNA-modificaties in enkele neuronen met behulp van massaspectrometrie

Samenvatting

Post-transcriptionele modificaties van RNA vertegenwoordigen een onderbelichte laag van translatieregulatie die onlangs is gekoppeld aan de plasticiteit van het centrale zenuwstelsel. Hier wordt de monstervoorbereiding en vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometriebenadering beschreven voor gelijktijdige karakterisering van talrijke RNA-modificaties in afzonderlijke neuronen.

Samenvatting

Post-transcriptionele modificaties (PTM's) van RNA vertegenwoordigen een onderbelicht mechanisme dat betrokken is bij de regulatie van translatie in het centrale zenuwstelsel (CZS). Recent bewijs heeft specifieke neuronale RNA-modificaties gekoppeld aan leer- en geheugenparadigma's. Helaas zijn conventionele methoden voor de detectie van deze epitranscriptomische kenmerken alleen in staat om zeer overvloedige RNA-modificaties in bulkweefsels te karakteriseren, waardoor de beoordeling van unieke PTM-profielen die kunnen bestaan voor individuele neuronen binnen de geactiveerde gedragscircuits wordt uitgesloten. In dit protocol wordt een benadering beschreven - single-neuron RNA-modificatieanalyse door massaspectrometrie (SNRMA-MS) - om tegelijkertijd talrijke gemodificeerde ribonucleosiden in enkele neuronen te detecteren en te kwantificeren. De aanpak wordt gevalideerd met behulp van individuele neuronen van het mariene weekdier, Aplysia californica, te beginnen met chirurgische isolatie en enzymatische behandeling van belangrijke CZS-ganglia om neuroncellichamen bloot te leggen, gevolgd door handmatige isolatie van één neuron met behulp van scherpe naalden en een micropipette. Vervolgens wordt mechanische en thermische behandeling van het monster in een klein volume buffer uitgevoerd om RNA uit een individuele cel vrij te maken voor daaropvolgende RNA-vertering. Gemodificeerde nucleosiden worden vervolgens geïdentificeerd en gekwantificeerd met behulp van een geoptimaliseerde vloeistofchromatografie-massaspectrometriemethode. SNRMA-MS wordt gebruikt om RNA-modificatiepatronen vast te stellen voor enkele, geïdentificeerde neuronen van A. californica die morfologieën en functies hebben gekend. Voorbeelden van kwalitatieve en kwantitatieve SNRMA-MS worden gepresenteerd die de heterogene verdeling van RNA-modificaties over individuele neuronen in neuronale netwerken benadrukken.

Inleiding

Modificaties in de canonieke nucleosiden van RNA worden steeds meer erkend voor hun talloze rollen in de regulatie van eiwittransformatie. Tot op heden zijn meer dan 150 unieke RNA-modificaties gemeld die in complexiteit variëren van methylatie, heteroatom-toevoeging tot conjugatie met cellulaire metabolieten ^1,2. Dit uitgebreide RNA-alfabet, ook bekend als het epitranscriptoom, wordt gegenereerd door enzymatische schrijvers en is verantwoordelijk voor het veranderen van de stabiliteit³,^{vouwing 4} en translatie-efficiëntie ^5,6 van cellulaire RNA's. Geselecteerde RNA-modificaties kunnen ook worden omgekeerd via enzymatische gummen ^7,8, terwijl andere worden toegevoegd aan RNA's substoichiometrisch ^9,10, waardoor een complex landschap van gemodificeerde en ongewijzigde RNA-sequenties in biologische systemen wordt weergegeven.

Het belang van RNA-modificaties in de biologische functie wordt aangegeven door de ongelijke verdeling van modificaties over verschillende organen en weefsels, waaronder subregio's van het centrale zenuwstelsel (CZS)¹¹. Deze chemische heterogeniteit is in verband gebracht met CNS-ontwikkeling¹², stressrespons¹³ en activiteitsafhankelijke plasticiteit¹⁴. De CNS-subregio's omvatten verder heterogene populaties van cellen waarin individuele cellen verschillende chemische profielen vertonen 15,16,17,18. Zelfs enkele cellen van hetzelfde type kunnen unieke transcriptomen vertonen, deels als gevolg van weefselmicro-omgevingen¹⁹ en stochastische genexpressie²⁰. Hoewel karakterisering van het eencellige transcriptoom enigszins routinematig is, zijn er geen analoge methoden voor het vaststellen van eencellige epitranscriptomen voor meerdere RNA-modificaties. Nieuwe benaderingen die in staat zijn om de distributie van RNA-modificaties in individuele cellen te profileren, zijn nodig voor een uitgebreide analyse van de cellulaire heterogeniteit en regulerende invloed van post-transcriptionele modificaties (PTM's) in het CZS en andere biologische systemen.

Gelijktijdige meting van talrijke RNA-modificaties in bulkcellen/weefsels wordt gemakkelijk uitgevoerd met behulp van vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS) technieken. Voor LC-MS/MS-analyse van gemodificeerde ribonucleosiden wordt RNA geëxtraheerd uit cellen (meestal 10 3-10⁶ cellen), gezuiverd door precipitatie en resuspensie en vervolgens verteerd tot nucleosiden. Het monstermengsel bestaande uit canonieke en gemodificeerde nucleosiden wordt vervolgens geïnjecteerd in het LC-MS-systeem voor analytscheiding en detectie, wat leidt tot bepaling van het volledige complement van RNA-modificaties in een organisme 21,22,23. LC-MS/MS werd onlangs gebruikt om 26 RNA-modificaties in het CZS van het neurobiologische model Aplysia californica (A. californica) te bepalen. De abundanties van sommige van deze epitranscriptomische tekens vertoonden tijd- en regioafhankelijke dynamieken die correleerden met gedragsveranderingen bij het dier²⁴. Het was echter alleen mogelijk om RNA-modificaties te detecteren in bulkmonsters met > 10³ cellen vanwege de beperkte gevoeligheid van de methode. Deze grotere monsters verborgen waarschijnlijk unieke en functioneel belangrijke RNA-modificatieprofielen van individuele cellen met populatiegemiddelden. Hoewel zorgvuldige controle van de monstervoorbereidingsomstandigheden de detectielimieten voor RNA-modificaties in monsters met een klein volume heeft verbeterd 25,26,27,28, blijft er behoefte aan analytische methoden die meerdere gemodificeerde ribonucleosiden in afzonderlijke cellen kunnen detecteren en kwantificeren.

Dit protocol introduceert single-neuron RNA modificatie analyse door massaspectrometrie (SNRMA-MS), die de detectie van meer dan een dozijn RNA-modificaties in enkele neuronen uit het CZS van A. californica²⁹ mogelijk maakt. De aanpak bestaat uit chirurgische isolatie van enkele, geïdentificeerde cellen uit belangrijke CZS-ganglia gevolgd door een geoptimaliseerde monstervoorbereidingsworkflow met mechanische cellyse, RNA-denaturatie en enzymatische hydrolyse in een MS-compatibele buffer. Identificatie en kwantificering van post-transcriptioneel gemodificeerde nucleosiden wordt vervolgens bereikt met behulp van LC-MS / MS. SNRMA-MS voorziet in een onvervulde behoefte op het gebied van RNA-modificatieanalyse door de verwerving van post-transcriptionele RNA-modificatieprofielen voor afzonderlijke neuronen te vergemakkelijken en heeft potentieel voor toekomstige toepassing op andere celtypen.

Protocol

1. Bereiding van materialen en oplossingen

1. Bereid kunstmatig zeewater (ASW) met 460 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM CaCl₂, 22 mM MgCl₂, 26 mM MgSO₄ en 10 mM HEPES in water verkregen uit een streng zuiveringssysteem. Stel de pH in op 7,8 met 1 M NaOH of HCl. Bereid gewoonlijk 1 L ASW en bewaar bij 14 °C tot gebruik.
2. Bereid een ASW-antibioticaoplossing met 10.000 U/ml penicilline G, 10 μg/μL streptomycine en 10 μg/μL gentamicine en bewaar bij -20 °C. Ontdooi en verdun vlak voor het experiment de bevroren antibioticavoorraadoplossing 1:100 in 20-40 ml ASW. De uiteindelijke concentratie antibiotica in de werkende ASW-oplossing is 100 U / ml penicilline G, 100 μg / ml streptomycine en 100 μg / ml gentamicine.
3. Bereid een RNA-verteringsbuffer voor door 1 μL 10 μg/μL runderserumalbumine, 0,5 μL 0,5 μg/μL pentostatine, 0,495 μL 2 U/μL alkalische fosfatase, 1 μL 0,1 U fosfodiësterase I (in 10 mM MgCl₂) en 0,38 μL endonuclease uit Serratia marcescens (25 U) per monster te combineren. Als u meerdere monsters analyseert, bereidt u een hoofdmengsel voor in een afzonderlijke buis met het volume van elk reagens vermenigvuldigd met het aantal te analyseren monsters, plus nog een om rekening te houden met incidenteel reagensverlies door pipetoverdrachtsstappen.
4. Bereid verschillende scherpe naalden (glas of metaal) voor voor handmatige isolatie van neuronen. Maak metalen naalden in eigen huis door elektrochemisch etsen van wolfraamdraad zoals in³⁰ of koop ze. Bereid glazen naalden van dikke of standaard wand borosilicaat glazen haarvaten (1 mm buitendiameter) met behulp van een micropipette puller. Houd voor de huidige methode de diameter van de naaldpunt tussen 1-5 μm, met een neklengte van 100-150 μm.
   OPMERKING: De fabricage van zowel metalen als glazen naalden kan worden geoptimaliseerd om gereedschappen te produceren die voldoen aan de individuele behoeften van de onderzoeker en het specifieke biologische model dat wordt onderzocht.

2. Isolatie van een enkel neuron

1. Koel een 0,33 M MgCl₂ oplossing af tot 14 °C. Gebruik een spuit van 50 ml om A. californica (150-250 g) te verdoven door de MgCl_2-oplossing in de lichaamsholte van het dier te injecteren. De beste resultaten worden verkregen met een verhouding van 1:3 van het oplossingsvolume (ml) tot de lichaamsmassa van het dier (g). Wacht ongeveer 3 minuten totdat het dier ontspannen is en zorg ervoor dat het geen lichaamscontracties vertoont als reactie op tactiele stimulatie.
2. Plaats de ventrale kant van het dier (voetzijde) omhoog in een ontleedbak. Ontleed het dier met een chirurgische schaar met één stompe punt in de richting van het dier, waarbij u voorzichtig een longitudinale snee door de voet maakt.
3. Pin de rostrale, caudale en laterale zijden van het dierlijke lichaam om de interne organen en CNS-ganglia in de lichaamsholte bloot te leggen. Isoleer belangrijke CZS-ganglia van het dier door zenuwen en sommige verbindingen afkomstig van de ganglia operatief af te snijden.
4. Dompel de ganglia onder in een oplossing van protease type XIV uit Streptomyces griseus (10 mg/ml in ASW-antibiotica-oplossing) en incubeer bij 34 °C gedurende 30 min of 1 uur (voor hersen ganglion).
   OPMERKING: De duur van de incubatie hangt af van het seizoen, de grootte en conditie van het dier, evenals de beoogde neuronen. Isolatie van sommige neuronen vereist langere incubatie dan andere en moet experimenteel worden bepaald.
5. Spoel de ganglia 6x af met ASW-antibiotica oplossing en breng alle ganglia over in een met siliconenpolymeer gecoate schaal gevuld met ASW-antibiotica-oplossing met behulp van een polypropyleen transferpipet die is gesneden tot een opening van ~ 5 mm. Behandel de pipet met 1 mg/ml runderserumalbumine in ASW om het plakken van de ganglia aan de pipet te minimaliseren (optioneel). Houd ganglia te allen tijde ondergedompeld in ASW.
   OPMERKING: Enzymatische behandeling vermindert de mechanische stabiliteit van neuronen en het omliggende bindweefsel en als gevolg daarvan kunnen neuronale membranen worden beschadigd als gevolg van blootstelling aan lucht tijdens ganglia-overdracht.
6. Pin de ganglia vast en gebruik een microschaar en fijne tang om ganglionscheden te verwijderen. Gebruik bij voldoende sterke enzymatische behandeling glazen of metalen naalden voor het ontheathen.
7. Identificeer visueel A. californica neuronen van belang. In dit werk werden de volgende cellen bestudeerd: R2 in het abdominale ganglion, LPl1 in het pleurale ganglion, metacerebrale cellen (MCC's) in het cerebrale ganglion en B2-cellen in het buccale ganglion. Maak optische beelden van alle neurale en ganglionische preparaten met behulp van een gekalibreerde microscoop met een totale vergroting van 20x om de grootte en volumes van elk celtype te bepalen.
8. Gebruik een getrokken glazen capillair of scherpe wolfraamnaalden om de geïdentificeerde cel zorgvuldig te isoleren van het bulkganglion.
9. Trek een kleine hoeveelheid (1 μL) ASW in een plastic micropipette en breng de geïsoleerde cel vervolgens over in een PCR-monsterbuis met 4 μL ammoniumacetaat van 0,365 M ammoniumacetaat (pH 9,2). Verzamel voor blanco metingen 5 μL aliquots van de ASW-antibiotica-oplossing uit de schaal die het ganglion bevat en meng met de digestiebuffer (hieronder beschreven).

3. Cellyse en RNA-vertering voor SNRMA-MS

1. Lyse de geïsoleerde neuronen door herhaalde aspiratie en het afzien van een micropipette (~ 100 μm binnendiameter) in 0,365 M ammoniumacetaat. Sommige kleinere cellen kunnen niet onmiddellijk scheuren; om ze te lyseren, oefent u druk uit over de diameter van de cel met een capillair van getrokken glas.
2. Gebruik een thermische cycler om de monsters te verwarmen met het volgende temperatuurprogramma: 95 °C gedurende 3 minuten, 10 °C gedurende 3 minuten, vasthouden op 10 °C. Verwijder de monsterbuis uit de thermische cycler.
3. Voeg 3,375 μL RNA-vergistingsbuffer toe voor elk monster en meng de oplossing met behulp van een micropipette door de oplossing meerdere keren op te zuigen en te doseren. Gebruik een miniatuur benchtopcentrifuge bij 2700 x g gedurende 30 s om vloeistofdruppels die zich aan de wanden van de PCR-buis hechten, te laten draaien.
4. Incubeer de monsters in de thermische cycler bij 37 °C gedurende 3 uur, gevolgd door een houdgreep bij 10 °C (verwarmd deksel ingesteld op AAN). Breng onmiddellijk nadat het monster is afgekoeld tot 10 °C 7 μL van de oplossing over in een injectieflacon met autosampler die is uitgerust met een insert van 250 μL, waarbij u ervoor zorgt dat er geen bubbelvorming in de autosamplerbuis ontstaat.

4. Vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie

OPMERKING: Analyseer de single-neuron digests en authentieke gemodificeerde nucleoside-normen met behulp van een LC-MS / MS-systeem uitgerust met een elektrospray-ionisatiebron en een zespoorts omleidingsklep.

1. Om het LC-systeem voor te bereiden op de scheiding van canonieke en gemodificeerde nucleosiden, moet u een C18-kolom (150 mm x 2,1 mm, 2,2 μm deeltjesgrootte, 120 Å poriediameter) met 99% mobiele fase A (5 mM ammoniumacetaat, pH 5,6) en 1% mobiele fase B (60/40 mobiele fase A/acetonitril (ACN)) in evenwicht brengen met een stroomsnelheid van 0,2 ml/min gedurende 12 minuten bij 36 °C. Gebruik oplosmiddelen van LC-MS-kwaliteit voor de bereiding van mobiele fasen.
2. Terwijl de LC in evenwicht is, kalibreert u de massaspectrometer door een 1 mM-oplossing van natriumacetaat in 50/50 ACN/water op de massaspectrometer te introduceren via een spuitpomp met een debiet van 5 μL/min. Sluit na kalibratie de LC-stroom opnieuw aan op de massaspectrometer.
3. Programmeer de volgende lineaire gradiëntparameters: 1% B gedurende 0-5 min, 5% B bij 9 min, 7% B bij 11 min, 10% B bij 13 min, 15% B bij 32 min, 40% B bij 38 min, 50% B bij 43 min, 100% B bij 50 min, 100% B bij 60 min, 1% B bij 61 min, en een re-equilibratie van 12 minuten bij 1% B vóór de volgende injectie.
4. Bedien het MS-instrument in positieve modus met de volgende parameters: capillaire spanning ingesteld op 4.500 V, droogtemperatuur 275 °C, N₂ drooggas 5 l/min en vernevelgas 1 bar. Stel de omleidingsklep in op afval voor de eerste 2 minuten van de analyse en op bron voor de rest van de run.
5. Verzamel massaspectra over een m/z-bereik van 110-600. Selecteer ionen voor botsing-geïnduceerde dissociatie bij 35-40 eV over een cyclustijd van 3 s met behulp van een voorkeursmassalijst geconstrueerd met behulp van de database² en een isolatievenster van ± 0,5. Gebruik actieve uitsluiting om ionen uit te sluiten van fragmentatie na drie spectra.
6. Stel dynamische MS/MS-spectra-acquisitie in voor ionen met intensiteiten boven en onder 50.000 tellingen bij respectievelijk 4 Hz en 1 Hz, en een minimumdrempel voor ionenselectie op 1.990 tellen.
7. Voor kwantitatieve SNRMA-MS, construeer kalibratiecurven met behulp van geëxtraheerde ionchromatogram (EIC) piekgebieden verkregen voor gemodificeerde nucleosidenormen bij een minimum van vijf concentraties om interpolatie van onbekende endogene analytconcentraties mogelijk te maken.
   OPMERKING: Neuronen verkregen van dieren met lichaamsmassa's van 150-250 g vereisen meestal kalibratiecurven voor gemodificeerde nucleosiden variërend van 0,02 pmol tot 2 pmol, maar deze waarden kunnen variëren afhankelijk van de gevoeligheid van het instrument.

5. Data-analyse

1. Genereer EIC's voor gemodificeerde nucleosiden (m/z van databasewaarden²). Controleer de identiteit van vermeende gemodificeerde nucleosiden door hun MS2-spectra en LC-retentiekenmerken te vergelijken met databasewaarden². Zie tabel 1 voor een lijst van typische RNA-modificaties gedetecteerd in afzonderlijke neuronen van A. californica.
2. Integreer handmatig pieken die overeenkomen met gewijzigde en canonieke nucleosiden en noteer deze waarden in een spreadsheet. Normaliseer het piekgebied voor elk gemodificeerd nucleoside met de som van de piekgebieden voor canonieke cytidine, uridine en guanosine gedetecteerd in het monster.
   OPMERKING: Adenosine is niet opgenomen in de normalisatie vanwege zijn rol in het CZS als een dynamische neuromodulator³¹.
3. Construeer een gegevensmatrix bestaande uit elk single-neuron monster en de overeenkomstige genormaliseerde piekgebieden voor gemodificeerde nucleosiden die signaal-ruisverhoudingen vertoonden >10. Voer principal component analysis (PCA) uit en geef de eerste twee hoofdcomponenten weer in de scoreplot. Construeer lineaire kalibratiecurven van de EIC-piekgebieden die zijn verkregen uit de seriële verdunning van nucleosidenormen en bereken de concentraties van gedetecteerde analyten.

Resultaten

SNRMA-MS omvat de handmatige isolatie van geïdentificeerde neuronen in kleine monstervolumes voor lysis, spijsvertering en LC-MS / MS-analyse (figuur 1A). Deze workflow detecteerde routinematig meer dan een dozijn RNA-modificaties in afzonderlijke neuronen uit het CZS van A. californica (figuur 1B), wat neerkomt op een dekking van bijna de helft van het bekende epitranscriptoom van dit dier²⁴ in een enkele cel. Het onderwerpen van het LPl1-neuron (~ 500 μm diameter) aan SNRMA-MS resulteerde bijvoorbeeld in de detectie van 15 ± 1 RNA-modificaties (n = 3). Gemodificeerde nucleosiden werden positief geïdentificeerd op basis van drie kenmerken: LC-retentie-eigenschappen, exacte massa en MS2-fragmentatieprofielen in vergelijking met waarden in de database². Tabel 1 toont een lijst van alle RNA-modificaties die in het LPl1-neuron zijn gedetecteerd. De hoge resolutie quadrupole time-of-flight massaspectrometer die voor deze experimenten werd gebruikt, maakte een massanauwkeurigheid van 4 ppm mogelijk, evenals detectie van het karakteristieke MS2-fragmention bij m/z 164 voor het gemodificeerde nucleoside N6,6-dimethyladenosine (m⁶⁶A, figuur 1B). In combinatie met de LC-scheidingsgegevens, die overeenkomen met bevindingen die in de database zijn gedeponeerd (m⁶⁶A elueert na N6-methyladenosine (m⁶A)), toonde de SNRMA-MS-benadering een correcte toewijzing van gemodificeerde nucleoside-identiteiten.

Het SNRMA-MS-platform kan worden gebruikt voor het vaststellen van RNA-modificatieprofielen van afzonderlijke neuronen en het onderzoeken van hun relatie met bulkweefsels. R2 neuronen zijn grote (~ 500 μm in diameter) cholinerge cellen die zich in het abdominale ganglion bevinden. SNRMA-MS werd gebruikt om RNA-modificaties in R2-neuronen en het omliggende bulk abdominale ganglion te analyseren (figuur 2A). Genormaliseerde piekgebieden voor RNA-modificaties in elk neuron/ ganglionmonster (n = 7) werden gebruikt als input voor PCA, waaruit blijkt dat R2-neuronen verschillende RNA-modificatieprofielen vertonen in vergelijking met de ganglia waarin ze zich bevinden (figuur 2B). Dit blijkt uit gegevenspunten voor R2-neuronen en abdominale ganglia die verschillende regio's van de PCA-scoreplot bezetten. Verdere ondersteuning voor unieke gemodificeerde nucleosidepatronen werd verkregen van een afzonderlijk cohort van dieren (n = 7) waarin paarsgewijze vergelijkingen werden uitgevoerd voor 13 RNA-modificaties die gewoonlijk werden gedetecteerd in zowel de enkele neuronen als het bulkweefsel (figuur 2C). Twee gemodificeerde nucleosiden, pseudouridine (Ψ) en 2'-O-methylguanosine (Gm), hadden een significant hogere abundantie in de abdominale ganglia in vergelijking met R2-neuronen. Bij het bekijken van een subset van de RNA-modificaties met R2 neuron-ganglionparen aangegeven, vertoonden alle abdominale ganglia hogere niveaus van Ψ en Gm, en alle R2-neuronen hadden op één na hogere abundanties van 2'-O-methyladenosine (Am) dan hun overeenkomstige ganglion (figuur 2D). Over het algemeen laten de SNRMA-MS-resultaten voor het eerst zien dat RNA-modificatieprofielen van afzonderlijke cellen kunnen afwijken van bulkcellen in hetzelfde weefsel.

Het gebruik van SNRMA-MS om het modeldier A. californica te onderzoeken, biedt een unieke kans om RNA-modificatieprofielen te karakteriseren in geïdentificeerde, functioneel verschillende neuronen. RNA-modificaties werden geëvalueerd door SNRMA-MS in vier geïdentificeerde cellen: R2 en LPl1 (homologe, cholinerge cellen die betrokken zijn bij defensieve slijmafgifte)³², MCC's (serotonerge modulatorische neuronen die betrokken zijn bij voeding)³³ en B2-cellen (peptiderge neuronen die betrokken zijn bij darmmotiliteit)³⁴. PCA van zes RNA-modificaties in deze geïdentificeerde neuronen, ofwel geïsoleerd onmiddellijk na enzymatische behandeling of gekweekt in een ganglionpreparaat gedurende 48 uur, toonde de stabiliteit en dynamiek van eencellige epitranscriptomen aan. RNA-modificaties in functioneel verschillende cellen vormden unieke clusters in de scoreplot, terwijl homologe R2/LPl1-neuronen co-clusterden (figuur 3A). Uit de laadplot blijkt dat de verschillen voornamelijk werden veroorzaakt door de abundantie van positionele isomeren van methyladenosine, waaronder 2'-O-methyladenosine (Am) en N1-methyladenosine (m¹A) (figuur 3B). In dezelfde analyse werd een vergelijking uitgevoerd van vers geïsoleerde cellen en cellen gekweekt in situ (d.w.z. in hun respectievelijke ganglia) gedurende 48 uur. Zoals te zien is in de PCA-scoreplot, bleven functioneel verschillende cellen te onderscheiden door hun RNA-modificatieprofielen.

Kwantitatieve SNRMA-MS kan worden gebruikt voor het bepalen van absolute hoeveelheden geselecteerde RNA-modificaties waarvoor authentieke standaarden beschikbaar zijn. Externe kalibratiecurven werden gegenereerd voor m¹A, Ψ, 2'-O-methylcytidine (Cm), Am en m⁶A, en de hoeveelheid van elk gemodificeerd nucleoside in de MCC- en R2/LPl1-celparen werd bepaald door interpolatie (figuur 4A-E). De intracellulaire grootheden van m¹A en Ψ in twee paren symmetrische MCC's bleken vergelijkbaar te zijn, terwijl grotere verschillen in de hoeveelheden van deze modificaties werden waargenomen in drie paren R2/LPl1-cellen. Om rekening te houden met verschillen als gevolg van de fysieke grootte van de bestudeerde cellen, werden RNA-modificatiehoeveelheden genormaliseerd door celvolumes berekend op basis van optische meting van celdiameters om intracellulaire concentraties van gemodificeerde nucleosiden te verkrijgen. Significante verschillen in intracellulaire concentraties van Cm en Am werden waargenomen tussen MCC's en R2/LPl1 neuronen. Over het algemeen maakt SNRMA-MS zowel kwalitatieve als kwantitatieve profilering van RNA-modificaties in afzonderlijke neuronen mogelijk.

Figuur 1: SNRMA-MS workflow en detectie van meerdere RNA-modificaties in enkele neuronen door LC-MS/MS. (A) Foto's van gedesheathed buccaal ganglion en isolatie van één neuron in een monsterbuis. Schaalbalk = 200 μm, pijlen geven geïdentificeerde B1-cel aan. Er wordt ook een diagram van de monstervoorbereidingsprocedure voor LC-MS/MS-analyse getoond. (B) Overlayd EIC's voor RNA-modificaties in een enkel LPl1-neuron, met inzet met MS1- en MS2-spectra voor N6, N6-dimethyladenosine (m⁶⁶A). Zie tabel 1 voor m/z-waarden die worden gebruikt om EIC's voor gemodificeerde nucleosiden te genereren. Dit cijfer is gewijzigd van²⁹. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: SNRMA-MS onderscheidt RNA-modificatieprofielen van afzonderlijke neuronen en bulkweefsel. (A) Schematische weergave van A. californica CNS en workflow voor het analyseren van R2-neuronen en het omliggende abdominale ganglion. De foto toont het abdominale ganglion en R2-neuron (geïnjecteerd met Fast Green-kleurstof voor zichtbaarheid). (B) Relatieve piekgebieden van 13 RNA-modificaties werden gebruikt om de PCA-score (boven) en het laden (onder) plots te genereren. (C) Paarsgewijze vergelijking van RNA-modificaties in het abdominale ganglion en het R2-neuron. Foutbalken vertegenwoordigen ±1 standaarddeviatie (SD), *p < 0,05, ***p < 5 x 10⁻⁴, gepaarde t-test met Bonferroni−Holm-correctie. (D) Vergelijking van geselecteerde RNA-modificaties uit paneel C waarin R2-abdominale ganglionparen voor elk dier worden weergegeven met druppellijnen. Dit cijfer is gewijzigd van²⁹. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Profilering van RNA-modificaties in geïdentificeerde, functioneel verschillende neuronen van het A. californica CZS. (A) PCA-scoreplot voor MCC's en B2-, R2- en LPl1-cellen die vers geïsoleerd of geïsoleerd waren na in situcultuur gedurende 48 h (aangeduid met cMCC, cB2, cR2, cLPl1) en (B) laadplots voor zes RNA-modificaties die gewoonlijk in deze cellen worden gedetecteerd. Dit cijfer is gewijzigd van²⁹. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Kwantitatieve SNRMA-MS in A. californica neuronen. Kwantitatieve SNRMA-MS biedt absolute hoeveelheden en intracellulaire concentraties voor verschillende gemodificeerde nucleosiden in enkele, geïdentificeerde A. californica neuronen. Foto's van (A) links en rechts MCC's (respectievelijk LMCC en RMCC) in het cerebrale ganglion en (B) R2 in het abdominale ganglion en LPl1 in het pleurale ganglion. Cellen worden omcirkeld om de zichtbaarheid te verbeteren. Lineaire kalibratieplots voor (C) m¹A en (D) Ψ (driehoeken) die worden gebruikt voor interpolatie van gemodificeerde nucleosidehoeveelheden in enkele cellen (gekleurde stippen). Celparen van elk dier zijn gelabeld 1-3. (E) Intracellulaire concentraties van vijf gemodificeerde nucleosiden in MCC- en R2/LPl1-celparen. Dikke lijnen verbinden celparen. *p < 0,05, **p < 0,005, gepaard met Bonferroni-Holm-correctie, n = 2 dieren (vier cellen totaal) voor MCC's en n = 3 dieren (zes cellen totaal) voor R2/LPl1. Dit cijfer is gewijzigd van²⁹. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

RNA-modificatie	Afkorting	Elutievolgorde (C18)	m/z voor EIC	m/z voor MS2
dihydrouridine	D	1	247.09	115
pseudouridine	Y	2	245.08	209/179/155
3-methylcytidine	M3C	3	258.11	126
N1-methyladenosine	M1A	4	282.12	150
5-methylcytidine	M5C	5	258.11	126
N7-methylguanosine	M7G	6	298.12	166
2'-O-methylcytidine	Centimeter	7	258.11	112
inosine	I6A	8	269.09	137
2'-O-methylguanosine	Gm	9	298.12	152
N2-methylguanosine	M2G	10	298.12	166
N2,N2,N7-trimethylguanosine	M227G	11	326.15	194
N2,N2,-dimethylguanosine	M22G	12	312.13	180
2'-O-methyladenosine	Ben	13	282.12	136
N6-methyladenosine	M6A	14	282.12	150
N6,N6-dimethyladenosine	M66A	15	296.14	164
N6-isopentenyladenosine	i6A	16	336.17	204/136/148

Tabel 1: RNA-modificaties gedetecteerd in afzonderlijke neuronen van A. californica. Attributen voor karakterisering van gemodificeerde nucleosiden worden verstrekt, waaronder LC-retentievolgorde, m / z voor het genereren van EIC's en bijbehorende CID-fragmenten.

Discussie

SNRMA-MS maakt gebruik van een geoptimaliseerde monstervoorbereidingsaanpak, wat resulteert in een klein, MS-compatibel monstervolume dat kan worden geleverd aan het LC-MS-platform. De initiële enzymatische voorbehandeling van CNS-ganglia dicteert zowel het gemak waarmee ze kunnen worden gedesheathed als de duurzaamheid van enkele neuronen tijdens isolatie. Het cerebrale ganglion vereist vaak een uitgebreide enzymatische behandeling vanwege de relatief dikke schede in vergelijking met de buccale, pleurale en abdominale ganglia. Individuele onderzoekers die de isolaties van één neuron uitvoeren, kunnen verschillende voorkeuren hebben voor hoe duurzaam de schede moet zijn bij het gebruik van microscissors en fijne tangen. Het is echter belangrijk dat de ganglia niet oververteerd zijn, omdat dit kan leiden tot een verlies van hun structurele integriteit, verlies van positionele informatie die van cruciaal belang is voor het identificeren van doelcellen en / of cellyse. Na isolatie van het ganglion is het belangrijk om ervoor te zorgen dat een minimaal volume isolatiemedium wordt aangezogen bij het overbrengen van het neuron naar de monsterbuis. Het ASW-medium bevat een hoge concentratie zouten die tijdens RNA-hydrolyse kunnen interfereren met spijsverteringsenzymen en zal het monster ook verdunnen.

Tijdens de mechanische lysisstap is het gebruikelijk dat grote neuronen (> 250 μm diameter) scheuren bij herhaaldelijk passeren van een micropipette. Kleinere neuronen kunnen extra aandacht nodig hebben om cellysis te garanderen, wat meestal inhoudt dat een glazen capillair op de cel wordt gedrukt. In dit geval is het mogelijk dat een gedeeltelijk volume van de monsterbuffer in het capillair wordt getrokken vanwege capillaire krachten. Dit volume kan terug in de monsterbuis worden afgeleverd door druk uit te oefenen op het uiteinde van het glazen capillair om ervoor te zorgen dat er geen monster verloren gaat.

De beste resultaten worden verkregen door een verwarmingsstap op te nemen voorafgaand aan het toevoegen van enzymen voor RNA-vertering. Dit komt waarschijnlijk omdat verwarming bij 95 °C secundaire RNA-structuren denatureert die de activiteit van RNases³⁵ kunnen belemmeren en de hoeveelheid nucleosiden die vrijkomen uit RNA-biopolymeren kunnen verminderen. Controle-experimenten met behulp van monsters met stabiele isotoop-gelabelde methionine werden eerder uitgevoerd om te onderzoeken of warmte-geïnduceerde RNA-modificatieartefacten de oorzaak waren van de verhoogde piekgebieden die werden waargenomen voor RNA-modificaties ten opzichte van een SNRMA-MS-protocol^{zonder hitte 29}. Een dergelijke etikettering werd niet waargenomen, wat aangeeft dat de verbeterde signalen voor RNA-modificaties met behulp van de geoptimaliseerde SNRMA-MS-methode te wijten waren aan superieure vertering van RNA.

Conventionele methoden voor het isoleren van totaal RNA uit cellen omvatten vloeistof-vloeistofextractie (LLE) met fenol-chloroform en daaropvolgende RNA-precipitatie, wassen en resuspensie. Deze benaderingen zijn nuttig gebleken voor reverse transcriptie polymerase kettingreactie experimenten waarbij de expressie van geselecteerde genen gemakkelijk kan worden gevolgd in geïdentificeerde A. californica neuronen^36,37. LLE-methoden kunnen echter niet voldoende RNA herstellen voor de detectie van gemodificeerde ribonucleosiden door LC-MS, terwijl de hierin beschreven SNRMA-MS-methode detectie van talrijke RNA-modificaties mogelijk maakt²⁹. Om modificatieprofielen van specifieke RNA-typen (bijv. rRNA, tRNA, mRNA) in bulkweefsel/ celmonsters te beoordelen, zijn anion-uitwisseling vaste fase extractie²⁴, hybridisatie probe-gebaseerde verrijking³⁸ en chromatografische fractionering³⁹ benaderingen toegepast, maar soortgelijke methoden zijn nog niet beschikbaar voor eencellige RNA-zuivering. De ontwikkeling van RNA-fractioneringsbenaderingen die in staat zijn om specifieke RNA-typen uit afzonderlijke cellen te isoleren, zou extra inzicht geven in de functie van RNA-modificaties.

SNRMA-MS onthulde voorheen onkarakteristieke heterogeniteit in het RNA-modificatielandschap van enkele neuronen in A. californica en het is denkbaar dat er vergelijkbare verschillende PTM-profielen bestaan in zoogdiercellen. Omdat zoogdiercellen relatief klein zijn in vergelijking met de grote A. californica-neuronen die in dit protocol worden geanalyseerd, zijn verbeteringen in de behandeling van kleine monstervolumes nodig om lagere detectielimieten mogelijk te maken. Hoewel SNRMA-MS momenteel beperkt is tot volumes van ~ 5 μL, wordt verwacht dat aanzienlijke verbeteringen kunnen worden bereikt door microfluïdische vloeistofbehandelingsapparatuur in de workflow op te nemen. Bovendien zou de implementatie van geautomatiseerde of semi-geautomatiseerde celisolatie de monsterdoorvoer verhogen en eencellige RNA-modificatieanalyse van grotere celpopulaties mogelijk maken. Door te interfacing met nanoflow LC-scheidingen²⁷, zal de karakterisering van epitranscriptomische tekens in nog kleinere cellen haalbaar zijn.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Dieren
Aplysia californica	National Resource for Aplysia (Miami, FL)		150–250 g (volwassen)
Benchtop apparatuur
Glazen capillaire puller	Sutter	P-97
Milli-Q waterzuiveringssysteem	Millipore
Minicentrifuge voor PCR buizen	LW Scientific	ZS-1
Optische microscoop	Zeiss	Stemi 2000C
Thermocycler	Techne	EW-93945-01
HPLC kolom en verbruiksartikelen
Acclaim RSLC 120 C18 kolom	Thermo Scientific	71399
Autosampler vials	Thermo Scientific	C4011-13
LC en MS Instrumentatie en Software
DataAnalysis 4.4 software	Bruker
Dionex Ultimate 3000 nanoLC	Thermo Scientific		Uitgerust met online degasser, autosampler en thermostatische kolomcompartiment
Impact HD UHR QqTOF massaspectrometer	Bruker		Uitgerust met ESI bron
RStudio	RStudio
Microdissectie gereedschappen
Microschaar extra fijn vannas 3,5”	Roboz	RS-5640
Wolfraam naalden	Roboz	RS-6065
Reagentia/materialen
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethane-sulfonic acid (HEPES)	Fisher Scientific	H3375
Alkaline fosfatase	Worthington Biochemical Corp.	LS004081
Ammoniumacetaat	Honeywell	17836
Benzonase (endonuclease van S. marcescens)	EMD Millipore	70746-4
Bovien serum albumine	Sigma-Aldrich	A2153
Calciumchloride	Sigma-Aldrich	C4901
Gentamycin sulfaat	Fisher Scientific	G1264
Magnesiumchloride	Sigma-Aldrich	M9272
Magnesiumsulfaat	Sigma-Aldrich	208094
Nucleoside test mix	Sigma-Aldrich	47310-U
Penicilline G	Sigma-Aldrich	P7794
Pentostatin	Sigma-Aldrich	SML0508
Fosfodiesterase I	Worthington Biochemical Corp.	LS003926
Protease type XIV van Streptomyces griseus	Sigma-Aldrich	P5147
Natriumchloride	Sigma-Aldrich	S9888
Standaard glazen capillairen	A-M Systems	626000	1 mm o.d., 0.5 mm i.d., 4 in
Streptomycine sulfaat	Sigma-Aldrich	S9137