Methodenartikel

Een weefselzuiveringsmethode voor neuronale beeldvorming van mesoscopische tot microscopische schalen

DOI:

10.3791/63941

⸱

10 mei 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroanatomy, Juntendo University Graduate School of Medicine, 2Department of Cell Biology and Neuroscience, Juntendo University Graduate School of Medicine, 3Advanced Research Institute for Health Sciences, Juntendo University, 4Department of Neuroscience, Graduate School of Medicine, Kyoto University, 5Japan Society for the Promotion of Science, 6Department of Oral Anatomy and Neurobiology, Graduate School of Dentistry, Osaka University, 7Department of Multi-Scale Brain Structure Imaging, Juntendo University Graduate School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het protocol biedt een gedetailleerde methode van neuronale beeldvorming in hersensegmenten met behulp van een weefselzuiveringsmethode, ScaleSF. Het protocol omvat hersenweefselvoorbereiding, weefselverheldering, behandeling van gewiste plakjes en confocale laserscanmicroscopie beeldvorming van neuronale structuren van mesoscopische tot microscopische niveaus.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een gedetailleerd protocol wordt hier verstrekt om neuronale structuren van mesoscopische tot microscopische niveaus in hersenweefsels te visualiseren. Neuronale structuren, variërend van neurale circuits tot subcellulaire neuronale structuren, worden gevisualiseerd in hersensneden van muizen die optisch zijn gewist met ScaleSF. Deze clearingmethode is een aangepaste versie van ScaleS en is een hydrofiele weefselzuiveringsmethode voor weefselplakken die krachtige clearingcapaciteit bereikt, evenals een hoog niveau van behoud van fluorescentiesignalen en structurele integriteit. Een aanpasbare driedimensionale (3D) geprinte beeldkamer is ontworpen voor betrouwbare montage van vrijgemaakte hersenweefsels. Muizenhersenen geïnjecteerd met een adeno-geassocieerde virusvector met verbeterd groen fluorescerend eiwitgen werden gefixeerd met 4% paraformaldehyde en in plakjes van 1 mm dikte gesneden met een trillende weefselsnijder. De hersenschijfjes werden gewist door het clearingprotocol te volgen, dat sequentiële incubaties in drie oplossingen omvat, namelijk ScaleS0-oplossing, fosfaatbufferzoutoplossing (–) en ScaleS4-oplossing, voor een totaal van 10,5-14,5 uur. De gewiste hersenplakken werden op de beeldkamer gemonteerd en ingebed in 1,5% agarose-gel opgelost in ScaleS4D25(0)-oplossing. De 3D-beeldacquisitie van de plakjes werd uitgevoerd met behulp van een confocale laserscanmicroscoop uitgerust met een multi-immersie objectieflens van een lange werkafstand. Beginnend met mesoscopische neuronale beeldvorming, slaagden we erin om fijne subcellulaire neuronale structuren, zoals dendritische stekels en axonale boutons, in de optisch geklaarde hersenplakken te visualiseren. Dit protocol zou het begrip van neuronale structuren van circuit- tot subcellulaire componentschalen vergemakkelijken.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Weefselopruimingsmethoden hebben de diepte-onafhankelijke beeldvorming van biologische en klinische monsters met lichtmicroscopie verbeterd, waardoor structurele informatie over intacte weefsels kan worden geëxtraheerd 1,2. Optische clearingtechnieken kunnen mogelijk ook versnellen en de kosten voor histologische analyse verlagen. Momenteel zijn er drie belangrijke clearingbenaderingen beschikbaar: hydrofiele, hydrofobe en hydrogel-gebaseerde methoden 1,2. Hydrofiele benaderingen overtreffen in het behoud van fluorescentiesignalen en weefselintegriteit en zijn minder toxisch in vergelijking met de andere twee benaderingen 3,4.

Een hydrofiele clearingmethode, ScaleS, heeft een onderscheidende positie met zijn behoud van structurele en moleculaire integriteit en krachtige clearingcapaciteit (clearing-preservation spectrum)5. In een eerdere studie ontwikkelden we een snel en isometrisch clearingprotocol, ScaleSF, voor weefselplakken (~ 1 mm dikte) door de clearingprocedure van ScaleS6 te wijzigen. Dit clearingprotocol vereist sequentiële incubaties van hersenplakken in drie oplossingen gedurende 10,5-14,5 uur. De methode is voorzien van een hoog clearing-preserveringsspectrum, dat zelfs compatibel is met elektronenmicroscopie (EM) -analyse (aanvullende figuur 1), waardoor multischaal hoge resolutie driedimensionale (3D) beeldvorming met nauwkeurige signaalreconstructiemogelijk is 6. ScaleSF zou dus effectief moeten zijn, vooral in de hersenen, waar neuronale cellen uitbundige processen van enorme lengte uitwerken en gespecialiseerde fijne subcellulaire structuren regelen voor het verzenden en ontvangen van informatie. Het extraheren van structurele informatie met schalen van circuit- tot subcellulaire niveaus op neuronale cellen is heel nuttig voor een beter begrip van hersenfuncties.

Hier bieden we een gedetailleerd protocol om neuronale structuren te visualiseren met schalen van het mesoscopische / circuit tot microscopisch / subcellulair niveau met behulp van ScaleSF. Het protocol omvat weefselvoorbereiding, weefselzuivering, behandeling van gewiste weefsels en confocale laserscanmicroscopie (CLSM) beeldvorming van gewiste weefsels. Ons protocol richt zich op het ondervragen van neuronale structuren van circuit- tot subcellulaire componentschalen. Voor een gedetailleerde procedure voor de bereiding van de oplossingen en stereotaxische injectie van adeno-geassocieerde virus (AAV) vectoren in muizenhersenen, zie respectievelijk Miyawaki et al. 20167 en Okamoto et al. 20218.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle experimenten werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committees van Juntendo University (Approval No. 2021245, 2021246) en uitgevoerd in overeenstemming met de Fundamental Guidelines for Proper Conduct of Animal Experiments door de Science Council of Japan (2006). Hier werden mannelijke C57BL/6J-muizen geïnjecteerd met AAV-vector met verbeterd groen fluorescerend eiwit (EGFP) gen en parvalbumine (PV)/myristoylation-EGFP-low-density lipoproteïne receptor C-terminale bacteriële kunstmatige chromosoom (BAC) transgene muizen (PV-FGL muizen)9 gebruikt. PV-FGL-muizen werden onderhouden in C57BL / 6J-achtergrond. Er werden geen op geslacht gebaseerde verschillen gevonden met betrekking tot deze studie.

1. Weefselvoorbereiding

  1. Perfusiefixatie
    OPMERKING: Voer de stappen 1.1.1 tot en met 1.1.3 uit in een zuurkast om de blootstelling aan paraformaldehyde (PFA) te beperken.
    1. Anesthetiseer volwassen mannelijke muizen (8-16 weken oud) door een intraperitoneale injectie van overdosering van natriumpentobarbital (200 mg / kg). Bevestig de adequaatheid van de anesthesie door de afwezigheid van teen-knijpneutrek en oogknipperreflexen.
    2. Open de thoracale holte en knip het rechter atriumaanhangsel met een chirurgische schaar. Perfuseer de muizen met 20 ml ijskoude fosfaatbufferzoutoplossing (PBS) met behulp van een naald van 23 G bevestigd aan een spuit van 20 ml, gevolgd door perfusie van 20 ml ijskoude 4% PFA in 0,1 M fosfaatbuffer (PB) met behulp van een andere spuit van 20 ml.
      LET OP: PFA is toxisch en teratogeen. Vermijd inademing of contact met huid, ogen en slijmvlies.
    3. Verwijder hersenweefsels uit de schedel met een pincet. Breng de hersenweefsels over naar een buis van 15 ml met 4% PFA in 0,1 M PB, bescherm de monsters tegen licht en schommel zachtjes een nacht bij 4 °C op een shaker bij 50-100 tpm.
    4. OPMERKING: De geoogste hersenweefsels kunnen enkele weken worden opgeslagen in 0,02% natriumazide (NaN3) in PBS bij 4 °C.
      LET OP: NaN3 is giftig. Vermijd inademing of contact met huid, ogen en slijmvlies. Behandel het in een zuurkast.
  2. Voorbereiding van hersensneden
    1. Bereid 4% agar in PBS door 2 g agar toe te voegen aan 50 ml PBS. Magnetron het mengsel totdat de agar volledig is opgelost. Laat de oplossing afkoelen tot 40-45 °C.
      OPMERKING: De viskeuze eigenschap van agaropectine, een belangrijk onderdeel van agar, verbetert het gemak van het snijden van plakjes weefsel.
    2. Voeg 10 ml van de agar-oplossing toe aan een kweekplaat met 6 putten. Dompel het hersenweefsel onder in de agar-oplossing met behulp van een tang. Laat de agar stollen op ijs.
    3. Verwijder het ingebedde hersenweefsel uit de put en trim de agar met een scheermesje. Bevestig het agarblok met secondelijm op de bodem van het vibratombad en giet 0,1 M PB in de bufferbak.
    4. Reinig een ander scheermesje met een pluisvrij tissuepapier gedrenkt in ethanol en bevestig het mesje aan de meshouder van de trillende weefselsnijder.
    5. Stel de sectiesnelheid in op 0,14 mm/s met 1,4 mm amplitude en de frequentie op 75-77 Hz. Snijd het hersenweefsel in plakken van 1 mm dik en verzamel de plakjes in een 6-well celkweekplaat met PBS.
      OPMERKING: De hersenplakken kunnen enkele weken worden bewaard in 0,02% NaN3 in PBS bij 4 °C.

2. Weefselverheldering

OPMERKING: De samenstellingen van de gebruikte ScaleS-oplossingen zijn vermeld in tabel 1. Monsters moeten worden beschermd tegen licht door af te dekken met een folie. De opruimstappen zijn weergegeven in figuur 1A.

  1. Voeg 8 ml ScaleS0-oplossing toe aan een putje van een 6-wells celkweekplaat en voeg 8 ml ScaleS4-oplossing toe aan een andere put van de plaat en verwarm voor tot 37 °C in een incubator.
  2. Breng de hersenschijfjes over naar de voorverwarmde ScaleS0-oplossing met een spatel en incubeer gedurende 2 uur bij 37 °C in een schuddende incubator bij 90 tpm.
  3. Breng de gepermeabiliseerde hersenschijfjes over in 8 ml PBS(–) in een 6-wells celkweekplaat met een spatel en was gedurende 15 minuten door in een orbitale shaker op 40-60 rpm te houden. Herhaal dit twee keer.
  4. Breng de hersenschijfjes over in de voorverwarmde 8 ml ScaleS4-oplossing met een spatel en maak ze schoon door ze gedurende 8-12 uur bij 37 °C in een schuddende incubator bij 90 tpm te broeden. Een opgeruimde hersenschijf is te zien in figuur 1.

3. Montage van hersensegmenten

OPMERKING: Een aanpasbare beeldkamer wordt gebruikt voor betrouwbare montage van vrijgemaakte hersensegmenten (figuur 2) 6. De kamer bestaat uit het kamerframe en de onderste afdekplaat. De microscooptrapadapters zijn ook ontworpen om de beeldkamer rechtstreeks op microscoopstadia te monteren (figuur 2A, B). Het kamerframe en de microscooptrapadapters kunnen worden 3D-geprint met behulp van interne of uitbestede 3D-printservices. 3D computer-aided design (CAD) gegevens van de beeldkamer zijn te vinden in Furuta et al. 20226.

  1. Bevestig voor de kamervoorbereiding het kamerframe aan een afdekplaat met behulp van een drukgevoelige lijm.
  2. Bereid 1,5% agarose in ScaleS4D25(0)-oplossing (ScaleS4-gel) door 1,5 g agarose toe te voegen aan 100 ml van de oplossing in een fles. Meng de oplossing goed door te roeren en magnetron de oplossing totdat de agarose volledig is opgelost. Laat de oplossing na afloop afkoelen tot 37 °C.
  3. Monteer de vrijgemaakte hersenschijf op de onderste deklip van de beeldvormende kamer met een spatel. Veeg de overtollige oplossing van de opgeruimde plak weg met een schoon pluisvrij tissuepapier.
  4. Voeg de ScaleS4-gel toe aan het hersenschijfje met behulp van een micropipette om de beeldkamer te vullen. Leg er nog een coverslip op met een tang en plaats in deze volgorde een stuk pluisvrij tissuepapier en een glasplaat op de coverslip.
  5. Breng de beeldkamer over in een koelkast bij 4 °C. Plaats metalen gewichten op de glazen glijbaan en laat ze 30 minuten staan.
  6. Verwijder de metalen gewichten, glasschuif, pluisvrij tissuepapier en coverslip uit de beeldkamer en veeg de overtollige gel weg (figuur 2A, B).
  7. Plaats de beeldkamer in een glazen petrischaal van 60 mm en bevestig de rand van de beeldkamer aan de schaal met een stopverfachtige drukgevoelige lijm. Bevestig de kamer op meerdere punten aan de petrischaal.
  8. Giet ScaleS4-oplossing in de schaal en schud voorzichtig gedurende 1 uur bij 20-25 °C op een orbitale shaker bij 40-60 tpm. Vervang door een verse oplossing en verwijder luchtbellen op het geloppervlak door het oppervlak voorzichtig te schrapen met een pipetpunt van 200 μL. Monteer de ondergedompelde beeldkamer op een microscooptrap (figuur 2C).

4. CLSM beeldvorming

  1. Verkrijg beelden met behulp van een CLSM uitgerust met een multi-immersie objectieflens van een lange werkafstand (WD) (16x / 0,60 numeriek diafragma [NA], WD = 2,5 mm).
    OPMERKING: Lenzen met een hoge NA-doelstelling kunnen een hoge diffractie-beperkte resolutie bieden.
  2. Schakel alle relevante beeldverwerkingsapparatuur in (werkstation, microscoop, scanner, lasers en kwiklamp) en start een CLSM-beeldvormingssoftware.
  3. Stel de correctiekraag van de multi-immersie objectieflens in op 1,47. ScaleS4-oplossing heeft een brekingsindex (RI) van ongeveer 1,47 5,7. RI mismatch-geïnduceerde aberraties kunnen de beeldvorming verstoren (figuur 3).
  4. Dompel de objectieflens onder in de oplossing en laat deze het segment langzaam benaderen. Verwijder alle luchtbellen die vastzitten op de punt van de objectieflens. Zoek interessante regio's (ROIs) in de geklaarde weefsels met behulp van epifluorescentie.
  5. Stel parameters voor het verkrijgen van afbeeldingen in door de juiste instellingen te testen.
    1. Bepaal de bitdiepte voor beeldacquisitie. De gegevensgrootte van de afbeelding neemt toe met de bitdiepte.
    2. Stel de detectiegolflengte in. Pas de juiste poort voor de detector aan volgens het emissiespectrum. Zorg ervoor dat de detectiegolflengte geen laserlijnen bedekt.
    3. Stel de xy-resolutie in. Grotere formaten bieden betere xy-resoluties , maar het duurt langer om de afbeeldingen te verzamelen.
    4. Stel de scansnelheid in. Een lagere scansnelheid zorgt voor een hoge signaal-ruisverhouding. Het verhoogt echter ook de pixelverblijftijd en het risico op fotobleaching. Kies dienovereenkomstig.
    5. Pas de grootte van het gaatje aan. De grootte van het gaatje regelt de dikte van de optische sectie. Een kleiner gaatje zorgt voor een dunner optisch gedeelte, en dus een betere z-resolutie , maar vermindert het fluorescentiesignaal. Door het gaatje groter te maken, krijgt u een dikker optisch gedeelte met een sterker fluorescentiesignaal.
    6. Stel het laservermogen, de versterking van de detector/versterker en de offset in. Verhoog geleidelijk het laservermogen en de versterking van de detector/versterker totdat een geschikt beeld is verkregen. Een hoog laservermogen brengt het risico van fotobleaching met zich mee. Pas de offset (contrast) op de juiste manier aan om een hoge signaal-ruisverhouding te verkrijgen.
    7. Bepaal het benodigde grondbewerkingsgebied op basis van de grootte van de ROI. Zorg ervoor dat de volledige lengte en breedte van de ROI wordt vastgelegd.
    8. Navigeer door de gewiste weefsels in alle vlakken en stel het begin- en eindpunt van de stapel in. Stel de z-step grootte in volgens de gewenste z-resolutie.
  6. Verzamel afbeeldingen wanneer u tevreden bent met de instellingen voor beeldacquisitie en neem vastgelegde afbeeldingen op. Verwerk de beelden met behulp van een beeldanalysesoftware.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Optische clearing van een muis hersenschijf van 1 mm dikte werd bereikt met behulp van dit protocol. Figuur 1B geeft transmissiebeelden weer van een muizenhersenschijf voor en na de clearingbehandeling. De weefselopruimingsmethode maakte een 1 mm dik muizenhersenschijfje transparant. Een lichte uitbreiding van de uiteindelijke grootte van hersenschijfjes werd gevonden na de incubatie in de clearingoplossing gedurende 12 uur (lineaire expansie: 102,5% ± 1,3%). Het behoud van fluorescentie en structurele i...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kritieke stappen binnen het protocol
Er zijn een paar kritieke stappen in het protocol die met de grootste voorzichtigheid moeten worden uitgevoerd om zinvolle resultaten te verkrijgen. Uniforme fixatie van monsters is noodzakelijk voor 3D-beeldvorming in grootschalige weefsels. De objectieflens, het monster en de onderdompelingsvloeistof moeten overeenkomende RI hebben. RI-mismatch tussen hen zal leiden tot zeer verstoorde beeldvorming van EGFP-expresserende cellen in de gewiste hersenplakken (

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs bedanken Yoko Ishida (Juntendo University) voor AAV vectorproductie en Kisara Hoshino (Juntendo University) voor technische assistentie. Deze studie werd ondersteund door JSPS KAKENHI (JP20K07231 tot K.Y.; JP21H03529 naar T.F.; JP20K07743 naar M.K.; JP21H02592 naar H.H.) en Wetenschappelijk onderzoek naar innovatief gebied "Resonantie Bio" (JP18H04743 tot H.H.). Deze studie werd ook ondersteund door het Japan Agency for Medical Research and Development (AMED) (JP21dm0207112 tot T.F. en H.H.), Moonshot R&D van het Japan Science and Technology Agency (JST) (JPMJMS2024 tot H.H.), Fusion Oriented Research for disruptive Science and Technology (FOREST) van JST (JPMJFR204D tot H.H.), Grants-in-Aid van het Research Institute for Diseases of Old Age aan de Juntendo University School of Medicine (X2016 tot K.Y.; X2001 tot H.H.), en het Private School Branding Project.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
16x multi-immersion objectieflensLeica MicrosystemsHC FLUOTAR 16x/0.60 IMM CORR VISIR
AgarNacalai Tesque01028-85
AgaroseTaKaRa BioL03
Dimethyl sulfaatNacalai Tesque13407-45
D-SorbitolNacalai Tesque06286-55
γ-cyclodextrineWako Pure Chemical Industries037-10643
GlycerolSigma-AldrichG9012
Huygens EssentialScientific Volume Imagingver. 18.10.0p8/21.10.1p0 64b
ImarisBitplanever. 9.0.0
Leica Application Suite XLeica MicrosystemsLAS X, ver. 3.5.5.19976
Methyl-β-cyclodextrineTokyo Chemical IndustryM1356
ParaformaldehydeMerck Millipore1.04005.1000
Fosfaat gebufferde zoutoplossing (10x; pH 7,4)Nacalai Tesque27575-3110x PBS(–)
NatriumazideNacalai Tesque31233-55
Natrium pentobarbitalKyoritsu SeiyakuN/A
TCS SP8Leica MicrosystemsN/A
Triton X-100Nacalai Tesque35501-15
UreaNacalai Tesque35940-65
Vibrating tissue slicerDosaka EMPRO7N

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: Toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
  2. Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annual Reviews of Cell and Developmental Biology. 32, 713-741 (2016).
  3. Ueda, H. R., et al. Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy. Neuron. 106 (3), 369-387 (2020).
  4. Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews. Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).
  5. Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
  6. Furuta, T., et al. Multi-scale light microscopy/electron microscopy neuronal imaging from brain to synapse with a tissue clearing method, ScaleSF. iScience. 25 (1), 103601(2022).
  7. Miyawaki, A., et al. Deep imaging of cleared brain by confocal laser-scanning microscopy. Protocol Exchange. , (2016).
  8. Okamoto, S., et al. Exclusive labeling of direct and indirect pathway neurons in the mouse neostriatum by an adeno-associated virus vector with Cre/lox system. STAR Protocols. 2 (1), 100230(2021).
  9. Kameda, H., et al. Parvalbumin-producing cortical interneurons receive inhibitory inputs on proximal portions and cortical excitatory inputs on distal dendrites. The European Journal of Neuroscience. 35 (6), 838-854 (2012).
  10. Sohn, J., et al. A single vector platform for high-level gene transduction of central neurons: Adeno-associated virus vector equipped with the Tet-off system. PLoS One. 12 (1), 0169611(2017).
  11. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).
  12. Stepanyants, A., Martinez, L. M., Ferecsko, A. S., Kisvarday, Z. F. The fractions of short- and long-range connections in the visual cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (9), 3555-3560 (2009).
  13. Kuramoto, E., et al. Two types of thalamocortical projections from the motor thalamic nuclei of the rat: a single neuron-tracing study using viral vectors. Cerebral Cortex. 19 (9), New York, N.Y. 2065-2077 (2009).
  14. Matsuda, W., et al. Single nigrostriatal dopaminergic neurons form widely spread and highly dense axonal arborizations in the neostriatum. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 29 (2), 444-453 (2009).
  15. Lin, R., et al. Cell-type-specific and projection-specific brain-wide reconstruction of single neurons. Nature Methods. 15 (12), 1033-1036 (2018).
  16. Winnubst, J., et al. Reconstruction of 1,000 projection neurons reveals new cell types and organization of long-range connectivity in the mouse brain. Cell. 179 (1), 268-281 (2019).
  17. Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Just, L., Mack, A. F. Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluation and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure. Scientific Reports. 6, 34331(2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

HersenplakjesConfocale MicroscopieOptische Klaring3D ReconstructieDendritische DoornsAxonale BoutonsBehoud van FluorescentieBeeldvormingskamer

Gerelateerde artikelen