Methodenartikel

Een fotodynamische benadering om de functie van intracellulaire vesikelruptuur te bestuderen

DOI:

10.3791/63962

⸱

17 maart 2023

 ,  ,  ,  , 
1Inflammation Core Facility, Institute of Biomedical Sciences, Academia Sinica

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AlPcS2a-gemedieerde chromofoor-geassisteerde laserinactivatie (CALI) is een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van spatiotemporale schade van intracellulaire blaasjes (IV's) in levende cellen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Intracellulaire blaasjes (IV's) worden gevormd door endocytose van blaasjes in cytoplasma. IV-formatie is betrokken bij het activeren van verschillende signaalroutes door permeabilisatie van IV-membranen en de vorming van endosomen en lysosomen. Een methode genaamd chromofoor-geassisteerde laserinactivatie (CALI) wordt toegepast om de vorming van IV's en de materialen bij het beheersen van IV-regulatie te bestuderen. CALI is een op beeldvorming gebaseerde fotodynamische methodologie om de signaalroute geïnduceerd door membraanpermeabilisatie te bestuderen. De methode maakt het mogelijk om spatiotemporale manipulatie van het geselecteerde organel in een cel te permeabiliseren. De CALI-methode is toegepast om specifieke moleculen te observeren en te monitoren door de permeabilisatie van endosomen en lysosomen. Van de membraanruptuur van IV's is bekend dat het selectief glycaanbindende eiwitten rekrutert, zoals galectine-3. Hier beschrijft het protocol de inductie van IV-breuk door AlPcS2a en het gebruik van galectine-3 als een marker om aangetaste lysosomen te labelen, wat nuttig is bij het bestuderen van de stroomafwaartse effecten van IV-membraanruptuur en hun stroomafwaartse effecten onder verschillende situaties.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Endosomen, een soort intracellulair blaasje (IV), worden gevormd door endocytose en rijpen vervolgens tot lysosomen. Verschillende intracellulaire signaalroutes zijn betrokken bij de vorming van IV's; bovendien kunnen verschillende intrinsieke en extrinsieke stimuli IV's beschadigen (pathogenen kunnen bijvoorbeeld tijdens infectie uit het begrensde membraan ontsnappen en cytoplasma1 binnendringen). Dit gaat meestal gepaard met het scheuren van endocytotische blaasjes2. Daarom kunnen de technieken voor het richten en beschadigen van IV's worden gebruikt in gerelateerde studies3.

Fotodynamische therapie (PDT) is een lichtafhankelijke therapie om ziekten te bestrijden door tumoren of ziekteverwekkers te doden4. In PDT worden gerichte cellen gelabeld met niet-toxische chromoforen, fotosensitizers genaamd, die lokaal kunnen worden geactiveerd door lichtverlichting 5,6. Fotosensitizers absorberen energie van licht en transformeren in een aangeslagen singlettoestand, wat leidt tot de langlevende aangeslagen triplettoestand. Fotosensitizers van de triplettoestand kunnen elektronen- of energieoverdracht ondergaan en reactieve zuurstofsoorten (ROS) vormen in aanwezigheid van zuurstof, en kunnen gelabelde cellen binnen het verlichtingsgebiedruimtelijk vernietigen 7. Het gevolg varieert afhankelijk van de kracht van licht8. Door de concentratie van fotosensitizers en de intensiteit van lichtverlichting te regelen, kunnen gerichte biomoleculen selectief worden geïnactiveerd zonder cellyse, aangeduid als chromofoorondersteunde lichtinactivatie (CALI)9. Met de aanzienlijke ontwikkeling van fotosensitizers die selectief verschillende subcellulaire doelen kunnen labelen, is CALI een waardevol hulpmiddel geworden om lichtgemedieerde inactivatie van biomoleculen voor kleine biomoleculen zoals nucleotiden en eiwitten, evenals organellen zoals mitochondriën en endo-lysosomen 3,10,11,12,13 te beheersen.

In vergelijking met CALI worden chemische of fysische methoden ook gebruikt om membranen aan te tasten, zoals bacteriële toxine 14,15 en Leu-Leu-OMe16-behandeling voor lysosomale schade. Deze methoden vertonen echter bulkbeschadiging van IV's in cellen. Robuuste fotosensitizers (d.w.z. Al(III) ftalocyaninechloridedisulfonzuur (AlPcS2a)) worden gebruikt in CALI; AlPcS2a, gericht op de lysosomen door middel van endocytose, wordt gebruikt om endosomen of lysosomen te scheuren in een gecontroleerd gebied17. AlPcS2a is een celmembraan-ondoordringbare ftalocyanine-gebaseerde chromofoor die bindt aan lipide op plasmamembraan en wordt geïnternaliseerd door endocytose en uiteindelijk accumuleert in het lysosoom via de endocytische route18. Het absorbeert licht in een nabij-infrarood spectraal gebied en genereert singlet zuurstof, een belangrijke ROS gegenereerd door geëxciteerde AlPcS2a18. Singlet zuurstof die snel vervalt, beperkt de diffusie- en reactieafstand binnen een klein gebied in cellen (ongeveer 10-20 nm)19. Door de duur van AlPcS2a-incubatie en lichtverlichting aan te passen, is spatiotemporele controle van de schade aan IV's binnen een subcellulair gebied mogelijk. CALI wordt daarom een krachtig instrument voor het onderzoeken van de gevolgen van IV-schade en de vorming en regulering van IV's.

In deze studie wordt een specifiek protocol van CALI met AlPcS2a als fotosensitizer behandeld. Dit protocol kan worden toegepast op verschillende soorten IV's, waaronder endosomen en lysosomen, en worden gebruikt om de follow-upreacties na membraanruptuur te onderzoeken. HeLa-cellen die fluorofoor-geconjugeerd galectine-316,20 tot expressie brengen, onthuld na lysosoomruptuur, worden gebruikt om dit protocol aan te tonen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. AlPcS2a voorraadvoorbereiding

  1. Los 10 mg AlPcS2a op in 400 μL van 0,1 M NaOH. Om de oplosbaarheid te verbeteren, verwarmt u de oplossing bij 50 °C en vortex.
  2. Meng de oplossing met 4 ml fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS). Filter vervolgens de oplossing met een filter van 0,22 μm om de onoplosbare neerslag te verwijderen.
  3. Meet de concentratie van de oplossing met behulp van een UV-Vis-spectrofotometer. De extinctiecoëfficiënt van AlPcS2a bij 672 nm is 4 x 104 cm-1 M-1. Verdun de AlPcS2a-oplossing met PBS om een oplossing van 1 mM te maken. Maak 1 ml aliquots en bewaar bij -20 °C.

2. Transfectie

OPMERKING: Gal3-GFP wordt toegepast als een indicator voor live-cell beeldvorming van lysosomale ruptuur.

  1. Behoud HeLa-celkweek in DMEM aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS). Na het wassen van de cellen met PBS, trypsiniseren van de cellen, vervolgens resuspenderen de cellen in DMEM aangevuld met 10% FBS.
    OPMERKING: De methode is van toepassing op de meeste aangesloten cellijnen, waaronder HeLa- en A549-cellijnen. In principe zouden CALI-testen, ondanks het niet testen van suspensiecellen, met hen kunnen worden uitgevoerd.
  2. Verdun 300 ng Gal3-GFP-plasmide in 25 μl gereduceerd serummedium en voeg vervolgens 0,6 μl P3000-reagens toe. Meng voorzichtig. Verdun 0,45 μl Lipofectamine 3000-reagens in 25 μl gereduceerd serummedium. Meng voorzichtig.
  3. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Meng verdund DNA en verdund Lipofectamine 3000 en incubeer vervolgens gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
  4. Meng het DNA-Lipofectamine mengsel, 3 x 105 gesuspendeerde HeLa-cellen en 200 μL DMEM + 10% FBS, en zaai de cellen vervolgens op het centrale glazen gebied van een glazen knopschaal van 35 mm.

3. AlPcS2a kleuring

  1. Om celaanhechting mogelijk te maken, incubeer de cellen bij 37 °C in de incubator die gedurende ten minste 4 uur wordt voorzien van 5% CO2.
  2. Verdun AlPcS 2a in DMEM aangevuld met 10% FBS om een 1 μM AlPcS2a oplossing te maken. Verwarm het AlPcS2a-bevattende medium voor in een waterbad van 37 °C. Vervang het kweekmedium door het AlPcS2a-bevattende medium.
  3. Incubeer de cellen bij 37 °C in de incubator die 's nachts (16-18 uur) wordt voorzien van 5% CO2 .
  4. Was de cellen de volgende dag tweemaal met PBS om extracellulaire AlPcS2a te verwijderen. Vervang het medium door vers medium en incubeer vervolgens gedurende 4 uur bij 37 °C om resterende kleurstof langs de endocytische route te laten accumuleren in lysosomen.
    OPMERKING: Om endosomen te kleuren, incubeert u cellen in 1 μM AlPcS2a in DMEM met 10% FBS gedurende 15 minuten bij 37 °C. Was vervolgens cellen twee keer met PBS en incuber ze in voorverwarmd medium voordat u beeldvorming uitvoert.

figure-protocol-1
Figuur 1. Een schematische figuur die de selectieve IV-schade met AlPcS2a weergeeft. De figuur toont de schema's van selectieve IV-schade. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-protocol-2
Figuur 2. Lysosomale kleuring met AlPcS2a. Lysosomen die 's nachts zijn gelabeld met 1 μM AlPcS2a in HeLa-cellen zijn positief gekleurd met 50 nM groene fluorescerende kleurstof. Schaalbalk: 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. Voorbeeldbeeldvorming en lichtverlichting

OPMERKING: IV-schade binnen een subcellulair gebied van een enkele cel of alle AlPcS2a-gelabelde cellen in een kweekschaal kan worden uitgevoerd. Bulkverlichting van de hele kweekschaal maakt kwantitatieve studie van deze schade mogelijk, inclusief biochemische studies.

  1. Manipuleer afzonderlijke cellen door lysosomen in een enkele cel te beschadigen, zoals hieronder beschreven.
    1. Plaats de kweekschaal op het podium van een confocale microscoop. Gebruik de 488 nm en 561 nm lasers voor spannende GFP en AlPcS2a, respectievelijk.
    2. Omcirkel een 5 x 5 μm2 interessegebied (ROI) op de AlPcS 2a-gelabelde blaasjes die zijn geselecteerd om te worden beschadigd.
    3. Pulse verlicht de ROI met een 633 nm laser van 0,21 mW voor 70 herhalingen. Controleer de vorming van Gal3 puncta als een indicator van lysosomale membraanpermeabilisatie.
  2. Beschadig alle gelabelde cellen in een kweekschaal zoals hieronder beschreven.
    1. Plaats de cultuurschaal op een platform. Verlicht de schotel met 660 nm gecollimeerd LED-licht (nabij-infrarood licht is de ideale basis op het excitatiespectrum van AlPcS2a).
    2. Plaats de kweekschaal op de microscoop en controleer de indicatoren van membraanpermeabilisatie zoals vermeld in stap 4.1.3.
  3. Beoordeel letsel van IV's met behulp van de volgende indicatoren.
    1. De inhoud van endosoom of lysosoom is het meest geglycosyleerd, die worden blootgesteld aan cytosol bij IV-breuk. Label deze snel met behulp van cytosolische glycaanbindende galectines, waaronder galectine-1, galectine-3, galectine-8 en galectine-9 16,20.
    2. De grootte van de wond kan worden bepaald door het vrijkomen van membraan-ondoordringbare kleurstof zoals beschreven in21.
    3. Het verschil tussen endosomen en lysosomen is hun luminale pH-waarde. Lysosomale breuk verstoort de luminale pH, die kan worden gemeten met behulp van pH-gevoelige kleurstof, zoals FITC-dextran3.

figure-protocol-3
Figuur 3. AlPcS2a-gemedieerde CALI induceert lokale rekrutering van TagRFP-galectine-3 (Gal3) naar de lysosomen binnen het verlichtingsgebied. Lysosomen in TagRFP-galectine-3-tot expressie gebrachte HeLa-cellen werden 's nachts gekleurd met 1 μM AlPcS2a, gevolgd door focusverlichting met nabij-infrarood licht (633 nm) binnen het gele vierkant. AlPcS 2a signaal binnen het gele vierkant is gefotoblekeerd, vergezeld van de vorming van TagRFP-galectine-3puncta . Schaalbalk: 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een schematische figuur die de door AlPcS2a geïnduceerde schade van IV weergeeft, inclusief endosoom en lysosoom, is getoond (figuur 1).

In de handel verkrijgbare markers kunnen worden gebruikt om de AlPcS 2a-kleuringscondities te bepalen. Bijvoorbeeld AlPcS 2apuncta en groene fluorescerende kleurstof22 colocalisatie (figuur 2).

Fluorofoor-gelabeld ga...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AlPcS2a bindt zich aan het plasmamembraan, wordt vervolgens geïnternaliseerd door endocytose en hoopt zich uiteindelijk op in lysosomen. AlPcS2a kan dus worden gelokaliseerd in de subcellulaire compartimenten door de incubatietijd aan te passen. Een beperking van deze methodologie is dat alleen een subpopulatie van IV's kan worden gelabeld door AlPcS2a door endocytose omdat er veel andere membraanbronnen van IV's zijn, zoals ER- en Golgi-apparaten. Bovendien zou de selectieve etikettering...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs willen de Academia Sinica Inflammation Core Facility, IBMS bedanken voor onderzoeksondersteuning. De kernfaciliteit wordt gefinancierd door de Academia Sinica Core Facility and Innovative Instrument Project (AS-CFII-111-213). De auteurs bedanken de Common Equipment Core Facility van het Institute of Biomedical Sciences (IBMS), Academia Sinica (AS) voor het assisteren bij de beeldacquisitie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Reagens
Al(III) Phthalocyanine Chloride Disulfonic acid (AlPcS2a)Frontier ScientificP40632
Kweekschaalibidi812128-200
KweekmediumDMEM aangevuld met 10% FBS en 100 U/mL penicilline G en 100 mg/mL Streptomycine
DMEMGibco11965092
FBSThermo Fisher ScientificA4736301
Gal3-GFP plasmideaddgene
Lipofectamine 3000 kitThermo Fisher ScientificL3000008
LysoTracker Green DND-26Thermo Fisher ScientificL7526groene fluorescerende kleurstof
Multiwall plaatperkinelmerPK-6005550
NaOHThermo Fisher ScientificQ15895
OptiMEMThermo Fisher Scientific31985070
Penicilline-streptomycineGibco15140163
Fosfaat-gebufferd zout (PBS)Gibco21600-069137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4
Cellijn
HeLa cellijnATCCCCL-2De methoden zijn toepasbaar voor de meeste van de bevestigde cellijnen. Voorwaarden moeten individueel worden bepaald.
Apparatuur
0,22 µm FilterMerckSLGV013SL
Gecollimeerde LED-licht  (660nm)ThorlabsM660L3-C1 en DC2100Naar-infrarood licht is ideaal op basis van het excitatiespectrum van AlPcS2a.
Confocale microscopieCarl ZeissLSM 780Een incubatiesysteem is vereist voor langdurige beeldvorming.
NanoDrop 2000/2000c SpectrofotometersThermo Fisher Scientific
Rode LED-lichtTholabsM660L4-C1

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cossart, P., Helenius, A. Endocytosis of viruses and bacteria. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 6 (8), 016972(2014).
  2. Daussy, C. F., Wodrich, H. 34;Repair me if you can": membrane damage, response, and control from the viral perspective. Cells. 9 (9), 2042(2020).
  3. Hung, Y. H., Chen, L. M., Yang, J. Y., Yang, W. Y. Spatiotemporally controlled induction of autophagy-mediated lysosome turnover. Nature Communications. 4, 2111(2013).
  4. Sharma, S. K., et al. Photodynamic therapy for cancer and for infections: what is the difference. Israel Journal of Chemistry. 52 (8-9), 691-705 (2012).
  5. Kübler, A. C. Photodynamic therapy. Medical Laser Application. 20 (1), 37-45 (2005).
  6. De Rosa, F. S., Bentley, M. V. Photodynamic therapy of skin cancers: sensitizers, clinical studies and future directives. Pharmaceutical Research. 17 (12), 1447-1455 (2000).
  7. Hamblin, M. R. New photosensitizers for photodynamic therapy. Biochemical Journal. 473 (4), 347-364 (2016).
  8. Lavie, G., et al. A photodynamic pathway to apoptosis and necrosis induced by dimethyl tetrahydroxyhelianthrone and hypericin in leukaemic cells: possible relevance to photodynamic therapy. British Journal of Cancer. 79 (3-4), 423-432 (1999).
  9. Jay, D. G. Selective destruction of protein function by chromophore-assisted laser inactivation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 85 (15), 5454-5458 (1988).
  10. Grate, D., Wilson, C. Laser-mediated, site-specific inactivation of RNA transcripts. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (11), 6131-6136 (1999).
  11. Lin, J. Y., et al. Optogenetic inhibition of synaptic release with chromophore-assisted light inactivation (CALI). Neuron. 79 (2), 241-253 (2013).
  12. Hsieh, C. W., Yang, W. Y. Triggering mitophagy with photosensitizers. Methods in Molecular Biology. 1880, 611-619 (2019).
  13. Yang, J. Y., Yang, W. Y. Spatiotemporally controlled initiation of Parkin-mediated mitophagy within single cells. Autophagy. 7 (10), 1230-1238 (2011).
  14. Molinari, M., et al. Vacuoles induced by Helicobacter pylori toxin contain both late endosomal and lysosomal markers. Journal of Biological Chemistry. 272 (40), 25339-25344 (1997).
  15. Prince, L. R., et al. Subversion of a lysosomal pathway regulating neutrophil apoptosis by a major bacterial toxin, pyocyanin. Journal of Immunology. 180 (5), 3502-3511 (2008).
  16. Aits, S., et al. Sensitive detection of lysosomal membrane permeabilization by lysosomal galectin puncta assay. Autophagy. 11 (8), 1408-1424 (2015).
  17. Prasmickaite, L., Hogset, A., Berg, K. Evaluation of different photosensitizers for use in photochemical gene transfection. Photochemistry and Photobiology. 73 (4), 388-395 (2001).
  18. Berg, K., et al. Photochemical internalization: a novel technology for delivery of macromolecules into cytosol. Cancer Research. 59 (6), 1180-1183 (1999).
  19. Moan, J., Berg, K. The photodegradation of porphyrins in cells can be used to estimate the lifetime of singlet oxygen. Photochemistry and Photobiology. 53 (4), 549-553 (1991).
  20. Thurston, T. L., Wandel, M. P., von Muhlinen, N., Foeglein, A., Randow, F. Galectin 8 targets damaged vesicles for autophagy to defend cells against bacterial invasion. Nature. 482 (7385), 414-418 (2012).
  21. Repnik, U., et al. L-leucyl-L-leucine methyl ester does not release cysteine cathepsins to the cytosol but inactivates them in transiently permeabilized lysosomes. Journal of Cell Science. 130 (18), 3124-3140 (2017).
  22. Griffiths, G., Hoflack, B., Simons, K., Mellman, I., Kornfeld, S. The mannose 6-phosphate receptor and the biogenesis of lysosomes. Cell. 52 (3), 329-341 (1988).
  23. Jia, J., et al. Galectin-3 Coordinates a cellular system for lysosomal repair and removal. Developmental Cell. 52 (1), 69-87 (2020).
  24. Chu, Y. P., Hung, Y. H., Chang, H. Y., Yang, W. Y. Assays to monitor lysophagy. Methods in Enzymology. 588, 231-244 (2017).
  25. Nguyen, L., Madsen, S. J., Berg, K., Hirschberg, H. An improved in vitro photochemical internalization protocol for 3D spheroid cultures. Lasers in Medical Science. 36 (8), 1567-1571 (2021).
  26. Daugelaviciene, N., et al. Lysosome-targeted photodynamic treatment induces primary keratinocyte differentiation. Journal of Photochemistry and Photobiology. B, Biology. 218, 112183(2021).
  27. Hong, M. H., et al. Intracellular galectins control cellular responses commensurate with cell surface carbohydrate composition. Glycobiology. 30 (1), 49-57 (2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Chromofoor geassisteerde laserinactivatielysosomale membraanpermeabilisatieendocytosepadGalectine 3 markerconfocale microscopieHeLa celcultuurAlPcS2a kleurstofendosoomvormingfotodynamische methode

Gerelateerde artikelen