Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Intracerebroventriculaire toediening van van de darm afgeleide microbiële metabolieten in vrij bewegende muizen

3.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/63972

⸱

2 juni 2022

 ,  , 
1Institute of Basic Medical Sciences, College of Medicine, National Cheng Kung University, 2Department of Physiology, College of Medicine, National Cheng Kung University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Van de darm afgeleide microbiële metabolieten hebben veelzijdige effecten die leiden tot complex gedrag bij dieren. We streven ernaar om een stapsgewijze methode te bieden om de effecten van van de darm afgeleide microbiële metabolieten in de hersenen af te bakenen via intracerebroventriculaire toediening via een gidscanule.

Samenvatting

De impact van darmmicrobiota en hun metabolieten op de fysiologie en het gedrag van de gastheer is in dit decennium uitgebreid onderzocht. Talrijke studies hebben aangetoond dat van darmmicrobiota afgeleide metabolieten hersengemedieerde fysiologische functies moduleren via ingewikkelde darm-hersenroutes in de gastheer. Korte keten vetzuren (SCFA's) zijn de belangrijkste van bacteriën afgeleide metabolieten die worden geproduceerd tijdens de fermentatie van voedingsvezels door het darmmicrobioom. Uitgescheiden SCFA's uit de darm kunnen op meerdere plaatsen in de periferie werken en de immuun-, endocriene en neurale reacties beïnvloeden vanwege de enorme distributie van SCFA-receptoren. Daarom is het een uitdaging om de centrale en perifere effecten van SCFA's te differentiëren door orale en intraperitoneale toediening van SCFA's. Dit artikel presenteert een op video gebaseerde methode om de functionele rol van SCFA's in de hersenen te ondervragen via een gidscanule bij vrij bewegende muizen. De hoeveelheid en het type SCFA's in de hersenen kunnen worden aangepast door het infusievolume en de snelheid te regelen. Deze methode kan wetenschappers een manier bieden om de rol van darm-afgeleide metabolieten in de hersenen te waarderen.

Inleiding

Het menselijke maagdarmkanaal herbergt diverse micro-organismen die de gastheerbeïnvloeden 1,2,3. Deze darmbacteriën kunnen darm-afgeleide metabolieten afscheiden tijdens hun gebruik van voedingscomponenten die door de gastheer worden geconsumeerd 4,5. Interessant is dat de darmmetabolieten die niet in de periferie worden gemetaboliseerd, via circulatie naar andere organen kunnen worden getransporteerd6. Van belang is dat deze uitgescheiden metabolieten kunnen dienen als mediatoren voor de darm-hersenas, gedefinieerd als de bidirectionele communicatie tussen het centrale zenuwstelsel en de darm7. Eerdere studies hebben aangetoond dat van de darm afgeleide metabolieten complex gedrag en emotie bij dieren kunnen moduleren 8,9,10,11.

Korte keten vetzuren (SCFA's) zijn de belangrijkste metabolieten geproduceerd door darmmicrobiota tijdens de fermentatie van voedingsvezels en onverteerbare koolhydraten6. Acetaat, propionaat en butyraat zijn de meest voorkomende SCFA's in de darm12. SCFA's dienen als de energiebron voor cellen in het maagdarmkanaal. Niet-gemetaboliseerde SCFA's in de darm kunnen via de poortader naar de hersenen worden getransporteerd, waardoor hersenen en gedrag worden gemoduleerd 6,12. Eerdere studies hebben gesuggereerd dat SCFA's een cruciale rol kunnen spelen bij neuropsychiatrischeaandoeningen 6,12. Bijvoorbeeld, intraperitoneale injectie van butyraat in BTBR T + Itpr3tf / J (BTBR) muizen, een diermodel van autismespectrumstoornis (ASS), redde hun sociale tekorten13. Met antibiotica behandelde ratten die microbiota kregen van depressieve proefpersonen vertoonden een toename van angstachtig gedrag en fecale SCFA's14. Klinisch werden veranderingen in fecale SCFA's waargenomen bij mensen met ASS in vergelijking met typisch ontwikkelende controles15,16. Mensen met een depressie hebben lagere fecale SCFA's dan gezonde proefpersonen 17,18. Deze studies suggereerden dat SCFA's het gedrag bij dieren en mensen via verschillende routes kunnen veranderen.

Microbiële metabolieten oefenen verschillende effecten uit op meerdere plaatsen in het lichaam, met invloed op de fysiologie en het gedrag van de gastheer 4,19, waaronder het maagdarmkanaal, de nervus vagus en de sympathische zenuw. Het is moeilijk om de precieze rol van darm-afgeleide metabolieten in de hersenen te bepalen bij het toedienen van de metabolieten via perifere routes. Dit artikel presenteert een op video gebaseerd protocol om de effecten van darm-afgeleide metabolieten in de hersenen van een vrij bewegende muis te onderzoeken (figuur 1). We toonden aan dat SCFA's acuut konden worden gegeven via de gidscanule tijdens gedragstests. Het type, het volume en de infusiesnelheid van metabolieten kunnen worden gewijzigd afhankelijk van het doel. De plaats van cannulisatie kan worden aangepast om de impact van darmmetabolieten in een specifiek hersengebied te onderzoeken. We willen wetenschappers een methode bieden om de potentiële impact van van de darm afgeleide microbiële metabolieten op de hersenen en het gedrag te onderzoeken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle experimentele protocollen en de verzorging van de dieren werden goedgekeurd door de National Cheng Kung University (NCKU) Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Voorbereiding op het proefdier

  1. Verkrijg 6-8 weken oude wild-type C57BL / 6JNarl mannelijke muizen van een leverancier.
  2. Huis de muizen in een standaard muizenkooi met standaard muizen chow en gesteriliseerd water ad libitum.
    OPMERKING: De huisvestingsomstandigheden voor het Proefdiercentrum van NCKU zijn 22 ± 1 °C temperatuur, 55% ± 10% luchtvochtigheid en een 13 h/11 h licht/donker cyclus.

2. Stereotaxische chirurgie

  1. Bereid en steriliseer het stereotaxische instrument, chirurgische instrumenten en gerelateerde items.
    OPMERKING: Alle items die rechtstreeks contact maken met de chirurgische site moeten worden gesteriliseerd om infectie te voorkomen.
  2. Verdoof de muis door hem in de plexiglas kooi te plaatsen met 1%-5% isofluraan in zuurstof.
    OPMERKING: Observeer de muis nauwlettend om ervoor te zorgen dat de ademhalingsfrequentie op ongeveer één ademhaling per seconde wordt gehandhaafd.
  3. Haal de muis uit de anesthesiekamer. Scheer de chirurgische site (muizenkop) met een trimmer voor huisdieren. Plaats de muis op het stereotaxische frame door de snijtanden van de muis op de snijbalk in de stereotaxische snijtandhouder te bevestigen. Bedek de neus met het neuskegelmasker.
  4. Verdoof de muis met 1% -2,5% isofluraan in zuurstof gedurende de stereotaxische operatie. Evalueer de nociceptie van de muis via de teenknijpreflex en zorg voor een constante ademhaling voordat de operatieplaats wordt ingesneden.
  5. Plaats een verwarmingskussen (37,0 °C) onder de muis op het stereotaxische frame om de lichaamstemperatuur tijdens de operatie te handhaven. U kunt ook de kerntemperatuur handhaven met behulp van een rectale thermische sonde die de geprogrammeerde warmer en het verwarmingskussen verbindt.
  6. Verwijder de getrimde vacht op het hoofd met plakband. Injecteer de muis subcutaan met pijnstillend Ketoprofen (5 mg/kg) om de pijn te verlichten. Breng oogzalf aan om droge ogen te voorkomen.
  7. Steek de puntige oorbalk in de gehoorgang om het hoofd te bevestigen.
  8. Centreer het hoofd door de schaal van de oorstang aan te passen.
  9. Draai de neusklem op de snijtandhouder vast om verticale beweging te voorkomen. Druk zachtjes op het hoofd om te controleren of het hoofd is gefixeerd en voorkom dat het hoofd losraakt tijdens de volgende operatie.
  10. Desinfecteer de hoofdhuid met drie afwisselende scrubs van chloorhexidine met behulp van een wattenstaafje. Start elke scrub van het midden naar de buitenkant (van het meest gedesinfecteerde centrale gebied naar het minst gedesinfecteerde gebied).
    OPMERKING: Het gebruik van scrubs van het midden naar de buitenkant kan wetenschappers helpen infectie en besmetting van de vacht te minimaliseren. Het buitengebied ligt dicht bij het ongeschoren hoofdgebied, dat nog steeds een grote hoeveelheid vacht heeft en niet gemakkelijk grondig te desinfecteren is.
  11. Snijd de hoofdhuid op een voorste/achterste manier (<1 cm) met behulp van een chirurgisch mesje. Open de incisie en veeg de schedel af met een wattenstaafje dat wordt vastgehouden door een microdissecterende tang.
    OPMERKING: De microdissecterende tang, het chirurgische mes en het wattenstaafje moeten vóór de operatie worden gesteriliseerd door autoclaveren. Steriliseer tijdens het chirurgische proces alle chirurgische apparatuur met behulp van een glazen kraalsterilisator (150 °C) gedurende ten minste 5 s voor en na elk dier. Bereid een gesteriliseerd bekerglas voor om het chirurgische mes en de tang vast te houden tijdens het chirurgische proces en tussen dieren.
  12. Identificeer de Bregma en Lambda op de schedel. Gebruik de Bregma als referentie om de regio van belang te lokaliseren.
    1. Optioneel: Monteer de stereotaxische boormachine op de stereotaxische boorhouder en gebruik de punt van de boor om Bregma als referentie aan te wijzen. Steriliseer de stereotaxische boor met behulp van de glazen kraalsterilisator (150 °C) gedurende ten minste 5 s.
  13. Kalibreer en lijn het horizontale vlak van de platte schedel in linker/rechter en voorste/achterste vlakken van Bregma/Lambda.
    OPMERKING: Als u zich niet in een correct horizontaal vlak bevindt, koppelt u de muis opnieuw op het stereotaxische instrument.

3. Commerciële op maat gemaakte gids canule implantatie

  1. Identificeer en label de positie van de rechter laterale ventrikel, op basis van de stereotaxische coördinaten: Afstand tot Bregma, voorste/achterste (A/P): 0,26 mm, mediaal/lateraal (M/L): -1,0 mm, dorsaal/ventraal (D/V): -2,0 mm20.
    OPMERKING: De coördinaten kunnen worden gewijzigd op basis van de regio van belang. De coördinaten voor de laterale ventrikel waren gebaseerd op volwassen C57BL/6J muizen met een gewichtsbereik van 26-30 g. Als jongere muizen worden gebruikt, raadpleeg dan de discussie.
  2. Boor een gat (diameter = 1,5 mm) door de schedel op de gelabelde plaats met behulp van een stereotaxische boor voor de implantatie van een commerciële geleidecanule.
  3. Boor nog twee tot vier gaten (diameter = 1,5 mm) op de schedel met behulp van een stereotaxische boor voor de montage van roestvrijstalen schroeven.
    OPMERKING: Steriliseer de stereotaxische boor met behulp van een glazen kraalsterilisator (150 °C) gedurende ten minste 5 s voor en na elk dier.
  4. Veeg de botresten af en stop het bloeden met een wattenstaafje.
  5. Veeg de schedel af met Lidocaïne (1 mg / kg) met een wattenstaafje voor lokale anesthetische, antipruritische en pijnstillende effecten. Als het bloeden niet stopt na het boren, plaats dan voorzichtig een wattenstaafje op het gat voor hemostase.
  6. Monteer twee tot vier roestvrijstalen schroeven op de gaten om ankers te bieden voor tandheelkundig acrylaat.
  7. Plaats de commerciële geleidecanule op de stereotaxische canulehouder en desinfecteer met de glazen kraalsterilisator (150 °C).
    OPMERKING: De commerciële gidscanule, commerciële dummy en commerciële injector (figuur 2A) zijn aangepast met de specificaties in de materiaaltabel.
  8. Verplaats de stereotaxische canulehouder naar het gat dat is geboord voor de laterale ventrikel en steek de commerciële geleidecanule langzaam in het gat tot de gewenste diepte (2,5 mm).
    OPMERKING: De dorsale/ventrale coördinaat kan worden gedefinieerd door de punt van de commerciële geleidecanule als referentie in te stellen wanneer de punt nauwelijks in het gat wordt gestoken.
  9. Breng 10 μL n-butylcyanoacrylaatlijm (weefsellijmlijm) aan om de commerciële geleidecanule in het geboorde gat te bevestigen en wacht 3-4 minuten. Laat de commerciële geleidecanule voorzichtig los van de stereotaxische canulehouder en beweeg de houder weg.
  10. Breng het tandheelkundige acrylaat aan op de ingesneden hoofdhuid om de commerciële gidscanule te fixeren en wacht minstens 5 minuten. Implanteer de commerciële dummy in de commerciële gidscanule om canuleverstopping door bloed of lichaamsvocht te voorkomen (figuur 2B).
  11. Laat de oorstang los van de gehoorgang en verwijder de muis uit het stereotaxische frame.
  12. Plaats de muis in een nieuwe kooi met een verwarmingskussen eronder voor herstel van de anesthesie en observeer continu totdat de muis volledig ontwaakt.
    OPMERKING: Laat het dier niet onbeheerd achter totdat het weer voldoende bewustzijn heeft gekregen om de strengale lighouding te behouden. Een dier dat een operatie heeft ondergaan, mag niet terugkeren naar het gezelschap van andere dieren totdat het volledig is hersteld.
  13. Breng de muis terug naar één behuizing of groepshuisvesting, afhankelijk van het institutionele IACUC-protocol en het experimentele ontwerp. Zorg er voor groepshuisvesting voor dat er minder muizen in een kooi worden gehuisvest om ongewenste verwondingen of het loslaten van de canule te minimaliseren.
  14. Dien Ibuprofen (0,2 mg /ml) toe in het drinkwater gedurende ten minste 3 dagen voor postoperatieve zorg en controleer tweemaal daags op tekenen van pijn en angst gedurende ten minste 3 dagen.
    1. Breng tijdens postoperatieve zorg roxitromycinezalf rond de huid aan om ontsteking en infectie bij de muizen te voorkomen.
    2. Blijf de toestand van het dier controleren en geef tijdig een intraperitoneale injectie van 5% glucose en/of 0,9% natriumchloride om voldoende energie te leveren.
    3. Als de toestand van pijn, angst of infectie gestaag verslechtert, euthanaseer de muis dan door CO 2-inademing.
  15. Wacht 1 week na de operatie totdat de muis klaar is voor de intracerebroventriculaire levering van SCFA's en gedragstests.

4. Voorbereiding van SCFA's

  1. Los het natriumacetaat, natriumbutyraat en natriumpropionaat op in kunstmatige hersenvocht (ACSF) (zie de tabel met materialen).
  2. Zorg ervoor dat de chemicaliën volledig zijn opgelost, pas vervolgens de pH aan op 7,4 en filter het SCFAs-mengsel door een filter van 0,22 μm voor sterilisatie.

5. Het infuussysteem instellen voor intracerebroventriculaire toediening van SCFA's tijdens gedragstests

  1. Monteer een plafondcamera om het gedrag vast te leggen. Sluit de camera aan op een computer om de video-opnamesoftware te bedienen (figuur 3).
  2. Vul een spuit van 10 μL met gedestilleerd water.
    OPMERKING: Vermijd luchtbellen in de microliterspuit.
  3. Sluit een micro-injectiepomp aan op de microinjectieregelaar.
  4. Monteer de microliterspuit op de micro-injectiepomp. Om de spuit te installeren, drukt u op de knop om de klem los te maken en installeert u de spuit op de overeenkomstige positie. Sluit de klem en draai de zuigerbevestigingsschroef op de micro-injectiepomp vast (figuur 4A).
  5. Steek de commerciële injector in de polyethyleenbuis (figuur 2A).
  6. Hang de polyethyleenbuis aan de plafondcamera boven de testarena.
  7. Vul de polyethyleenbuis met gedestilleerd water met behulp van een insulinespuit. Sluit de microliterspuit aan op de hangende polyethyleenbuis.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de polyethyleenbuis lang genoeg is om de muis vrij door de testarena te laten bewegen.

6. Systeeminstellingen van de micro-injectiecontroller

  1. Schakel de micro-injectiecontroller in en druk op Alle kanalen weergeven om toegang te krijgen tot het opdrachtscherm (afbeelding 4C). Druk op Configuratie en stel volumedoel in op 9.800 nL met leveringssnelheid op 100 nL/s. Injecteer 9.800 ml gedestilleerd water uit de polyethyleenbuis die is aangesloten op de microliterspuit (druk op Direction om over te schakelen naar de infuse-modus en druk op RUN) (zie rode vierkantjes in het opdrachtscherm van figuur 4C).
  2. Druk op Configuratie en stel volumedoel in op 3.000 nL met leveringssnelheid op 100 nL/s. Trek 3.000 nL minerale olie op (druk op Direction om over te schakelen naar de modus Terugtrekken en druk op RUN) (zie rode vierkanten in het opdrachtscherm van figuur 4C).
    OPMERKING: Een duidelijke olie-water fasescheiding moet in acht worden genomen op de polyethyleenbuis.
  3. Demonteer de polyethyleenbuis van de naald van de microliterspuit. Spuug 3.000 ml gedestilleerd water uit de naald van de microliterspuit (druk op Direction om over te schakelen naar de Infuse-modus en druk op RUN).
  4. Steek de microliterspuit terug in de polyethyleenbuis. Druk op Configuratie en stel volumedoel in op 9.500 nL met delivery rate op 100 nL/s. Neem 9.500 nL SCFA's op (druk op Direction om over te schakelen naar de modus Terugtrekken en druk op RUN). Label de olie-SCFA's fase om te valideren of de SCFA's met succes zijn geïnfundeerd.
  5. Druk op Configuratie en stel het gewenste volumedoel met leveringssnelheid in op 7 nL/s. Druk op Direction om over te schakelen naar de infuse-modus (zie rode vierkantjes in het opdrachtscherm van Figuur 4C).
    OPMERKING: Bepaal het volume op basis van de infusietijd. Als de infusietijd bijvoorbeeld 3 minuten is voor de toedieningssnelheid van 7 nL/s, is het streefvolume = 1.260 nL.
  6. Druk op RUN om de microliterspuit naar voren te laten trekken totdat de vloeistof aan de voorkant van de commerciële injector naar buiten komt voordat u de injector in de canule inbrengt voor scfa-injectie.

7. Infusie van SCFA's in de laterale ventrikel via de commerciële gidscanule in vrij bewegende muis

  1. Verdoof de muis door hem in de plexiglas kooi te plaatsen met 1%-5% isofluraan in zuurstof.
    OPMERKING: Observeer de muis nauwlettend om ervoor te zorgen dat de ademhalingsfrequentie op ongeveer één ademhaling per seconde wordt gehandhaafd.
  2. Krabbel de muis en steek de commerciële injector in de commerciële geleidecanule (figuur 4B).
    OPMERKING: Als de commerciële gidscanule is aangesloten op bloed of lichaamsvloeistof, ontstop deze dan voorzichtig met een pincet.
  3. Laat de muis gedurende 15 minuten herstellen van de anesthesie in een kooi voorafgaand aan gedragstests.
  4. Voor de basisbewegingstest plaatst u de muis in een nieuwe kooi en laat u hem 35 minuten vrij verkennen. Infundeer SCFA's met een leveringssnelheid van 7 nL/s voor een doelvolume van 2.100 nL in de eerste 5 minuten (druk op Direction to the Infuse mode en druk op RUN).
    OPMERKING: De voortbeweging in de nieuwe kooi kan worden geanalyseerd met behulp van videotrackingsoftware voor diergedrag21,22.
  5. Verdoof de muis (herhaal stap 7.1) en verwijder de commerciële injector uit de commerciële geleidecanule.
    OPMERKING: De muis kan herhaaldelijk worden geïnjecteerd met verschillende controles/metabolieten nadat de juiste tijd is gegeven om de vorige injectie uit te spoelen. Zolang de canule op de muiskop is bevestigd, kan de muis herhaaldelijk worden getest met verschillende metabolieten.

8. Herstel van het micro-injectiesysteem

  1. Demonteer de polyethyleenbuis van de microliterspuit.
  2. Injecteer lucht in de buis met behulp van de insulinespuit om het gedestilleerde water in de polyethyleenbuis weg te gooien. Leeg de microliterspuit.
  3. Druk op Reset Pos op het scherm Configuratie om het scherm Spuitstopdefinitie te openen (Figuur 4C).
  4. Druk op Terugtrekken totdat er een piepend geluid optreedt om de micro-injectiepomp terug te zetten naar de volledig teruggetrokken positie (figuur 4C).
  5. Ga terug naar het opdrachtscherm en schakel de micro-injectiecontroller uit als er een **END REACHED**- teken op dit scherm staat (figuur 4C).

9. Optioneel: Validatie van intracerebroventriculaire injectie door neurale tracer

  1. Infundeer 2.100 nL van de neurale tracer met de toedieningssnelheid van 7 nL/s om de infusieplaats te verifiëren.
    OPMERKING: Laat de injector 5 minuten in de geleidecanule zitten om terugstroming te voorkomen.
  2. Verdoof de muis door een overdosis isofluraan (5%) 30 minuten na de infusie van neurale tracer.
  3. Controleer de ademhalingsfrequentie en de staart/poot knijpreflex bij de verdoofde muis.
    OPMERKING: Muizen moeten niet reageren voor de volgende stap.
  4. Maak een incisie van 4-5 cm door de huid, spier en buikwand onder de ribbenkast.
  5. Beweeg de lever voorzichtig weg van het diafragma.
  6. Snijd het diafragma in om het hart van de muis bloot te leggen.
  7. Perfuseer de muis door het hart met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) en ijskoude 4% paraformaldehyde in PBS.
  8. Onthoofd de muis en ontleed de hersenen zorgvuldig met een microdissecterende tang en een microdissecterende schaar om het hele brein eruit te halen23. Plaats de hersenmonsters in ijskoude 4% paraformaldehyde in PBS gedurende 3-4 dagen en was ze 3 x 5 minuten met PBS.
  9. Snijd de hersenen in twee delen in de hersenschijfhouder van de muis bij de achtste snede van de hersenschijfhouder van de muis (1 mm / sectie) van de voorste naar de achterste richting. Plaats de hersenen in de insluitvorm en integreer de hersenmonsters in laagsmeltpunt agarose (4% in PBS).
  10. Lijm de hersenen ingebed in agarose op het stadium van het vibratoom met behulp van secondelijm. Sectie van de hersenen coronaal in 50 μm hersenplakken met behulp van het vibratoom.
  11. Incubeer de hersenschijfjes in het antilichaam gericht op de neurale tracer verdund in blokkerende buffer (1:1.000 verdunning) 's nachts bij kamertemperatuur.
    OPMERKING: De blokkerende buffer bevatte 10% paardenserum, 0,1% Triton X-100 en 0,02% natriumazide.
  12. Was de plakjes 3 x 5 min met PBST (PBS met 0,1% triton X-100).
  13. Incubeer de hersenschijfjes in fluorescentiekleurstof geconjugeerd secundair antilichaam verdund in blokkerende buffer (1:500 verdunning) gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
  14. Was de plakjes 3 x 5 min met PBS.
  15. Monteer de hersenschijfjes op de dia met een montagemedium dat 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) bevat.
  16. Bedek de dia met een microscoop coverslip.
  17. Breng nagellak aan op de schuifrand om lekkage van het montagemedium te voorkomen.
  18. Na nachtelijke incubatie bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht, brengt u het fluorescentiesignaal op de infusieplaats in beeld met behulp van een fluorescentiemicroscoop.

10. Optioneel: Infusie van metabolieten via een aangepaste roestvrijstalen geleidecanule in de laterale ventrikel bij muizen

  1. Volg protocol secties 1-8 en vervang de commerciële gidscanule door een roestvrijstalen geleidecanule om chemicaliën door een roestvrijstalen injector in de muis te injecteren.
    OPMERKING: De voor- en nadelen van de verschillende commerciële en roestvrijstalen canules worden uitgewerkt in de discussiesectie.
  2. Voer het chirurgische protocol uit op dezelfde manier als beschreven in protocolsecties 2 en 3, behalve dat u de commerciële geleidecanule moet vervangen door een roestvrijstalen geleidecanule (figuur 5B).
    OPMERKING: De roestvrijstalen geleidecanule, de roestvrijstalen dummy en de roestvrijstalen injector (figuur 5A) zijn aangepast aan de specificaties in de materiaaltabel. Steek de aangepaste roestvrijstalen geleidecanule in het gat tot de gewenste diepte (2,0 mm).
  3. Infundeer SCFA's via de roestvrijstalen geleidecanule met behulp van het microinjectiesysteem dat bestaat uit de micro-injectieregelaar en de micro-injectiepomp (figuur 4B) (hetzelfde als protocolsecties 4-7). Voor de roestvrijstalen dummy van de roestvrijstalen geleidecanule buigt u de ene kant van de roestvrijstalen injector voorzichtig totdat de punt van de andere kant 1 mm langer is dan de roestvrijstalen geleidecanule.
  4. Injecteer 2.100 nL van de neurale tracer door de roestvrijstalen geleidecanule in de laterale ventrikel bij muizen (hetzelfde als protocolsectie 9).
  5. Verzamel het monster gedurende 30 minuten na de infusie van neurale tracers (hetzelfde als protocolparagraaf 9).
  6. Voer beeldacquisitie uit in de neurale tracer geïnfundeerde hersensegmenten (hetzelfde als protocolsectie 9).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De muis werd 1 week na herstel van de implantatie van de gidscanule toegediend met SCFA's om de locomotorische activiteit in een nieuwe kooi te evalueren. De muis werd in een nieuwe kooi geplaatst en toegediend met 2.100 nL SCFA's of ACSF in de eerste 5 minuten (afgiftesnelheid van 7 nL / s) in de hersenen via de commerciële gidscanule geïmplanteerd in de laterale ventrikel van de hersenen. De locomotorische activiteit in een nieuwe kooi werd geregistreerd gedurende nog eens 30 minuten na infusie. Er werd geen verschil w...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Van de darm afgeleide metabolieten zijn in verband gebracht met hersengemedieerde ziekten zonder veel nauwkeurig mechanisme, gedeeltelijk vanwege hun meerdere bindingsplaatsen in het lichaam 6,12,24. Eerdere rapporten gaven aan dat SCFA's kunnen dienen als liganden voor G-eiwitgekoppelde receptoren, epigenetische regulatoren en bronnen voor energieproductie op meerdere locaties in het lichaam 6,12

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten met betrekking tot dit werk.

Dankbetuigingen

We erkennen het personeel van het Laboratory Animal Center van de National Cheng Kung University (NCKU) voor de zorg voor de dieren. Dit werk werd ondersteund door de beurs van Prof. Kun-Yen Huang Education Fund van CHENG-HSING Medical Foundation aan C.-W.L.; de fondsen van het Ministerie van Wetenschap en Technologie (MOST) in Taiwan: (Undergraduate Research MOST 109-2813-C-006-095-B) aan T.-H.Y.; (MOST 107-2320-B-006-072-MY3; 109-2314-B-006-046; 110-2314-B-006-114; 110-2320-B-006-018-MY3) naar W.-L.W.; en het Higher Education Sprout Project, Ministerie van Onderwijs aan het hoofdkantoor van University Advancement bij NCKU naar W.-L.W.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Materiaal
Advil Liqui-Gels Gesolubiliseerde Ibuprofen A2:D41Pfizern/a
Alexa Fluor 488 ezel anti-konijnThermoFisher ScientificA-21206
Anti-Fluorescent Gold (konijn polyklonaal)MilliporeAB153-I
Bottle Top Vacuum Filter, 500 mL, 0.22 μm, PES, sterieleNEST121921LA01
CaCl2 Sigma-AldrichC1016ACSF: 0.14 g/L
Chlorhexidine scrub 2%PhoenixNDC 57319-611-09
Chlorhexidine oplossingPhoenixNDC 57319-599-09
Commerciële dummyRWD Life Science62004Single_OD 0.20 mm/ M3.5/G = 0.5 mm
Commerciële geleide cannuleRWD Life Science62104Single_OD 0.41 mm-27G/ M3.5/C = 2.5 mm 
Commerciële injectorRWD Life Science62204Single_OD 0.21 mm-33G/ Mates with M3.5/C = 3.5 mm/G = 0.5 mm
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG8270ACSF: 0.61 g/L
Tandheelkundig acrylHYGENICn/a
BevestigingsschroevenRWD Life Science62521
Fluoroshield montagemedium met DAPIAbcamAB104139
Paarden serumThermoFisher Scientific16050130
InsulinespuitBBraunXG-LBB-9151133S-1BX1 mL
Isoflurane Panion & BF biotechDG-4900-250D
KCl Sigma-AldrichP3911ACSF: 0.19 g/L
Ketoprofen Swiss Pharmaceuticaln/a
Lidocaine AstraZenecan/a
Low melting point agaroseInvitrogen16520
MgCl2 Sigma-AldrichM8266ACSF: 0.19 g/L
Microscoop dekpannetjesMARIENFELD101242
MicroscoopglaasjesThermoFisher Scientific4951PLUS-001E
Minerale olie licht, witte NFMacron Fine ChemicalsMA-6358-04
NaCl Sigma-AldrichS9888ACSF: 7.46 g/L
NaH2PO4 Sigma-AldrichS8282ACSF: 0.18 g/L
NaHCO3 Sigma-AldrichS5761ACSF: 1.76 g/L
N-butyl cyanoacrylaatlijm (weefsellijm)3M1469SB3M Vetbond
Neural tracer Santa CruzSC-358883FluoroGold
ParaformaldehydeSigma-AldrichP6148
PolyethyleenbuisRWD Life Science62329OD 1.50, I.D 0.50 mm en OD 1.09, I.D 0.38 mm
Puralube Vet (oog) ZalfDechra 12920060
Natriumacetaat Sigma-AldrichS2889SCFAs: 13.5 mM
Natriumazide Sigma-AldrichS2002
Natriumbutyraat Sigma-AldrichB5887SCFAs: 8 mM
Natriumpropionaat Sigma-AldrichP1880SCFAs: 5.18 mM
Roestvrijstalen geleide canuleChun Ta roestvrijstalen onderneming CO., LTD.n/aOD 0.63 mm; Lokale leverancier
Roestvrijstalen injectorChun Ta roestvrijstalen onderneming CO., LTD.n/aOD 0.3 mm; dummy is gemaakt van injector; lokale leverancier
SuperlijmKrazy GlueKG94548R
Triton X-100Merck1.08603.1000
Apparatuur
Cannula houderRWD Life ScienceB485-68217
PlafondcameraFOSCAMR2
Digitale stereotaxische instrumentenStoelting51730D
DissectiemicroscoopINNOVIEWSEM-HT/TW
Glaskralen sterielisatieRWD Life ScienceRS1501
VerwarmingskussenStoelting53800M
Leica microscoop LeicaDM2500
Micro DissectietangROBOZRS-5136Gekarteld, Licht Gebogen; Extra Delicaat; 0.5mm Tip Breedte; 4" Lengte 
Micro DissectiescharenROBOZRS-59184.5" Hoekscharp
Microinjectie controllerWorld Precision Instruments (WPI)MICRO2TSMARTouch Controller
Microinjectie spuitpompWorld Precision Instruments (WPI)UMP3T-1UltraMicroPump3  
Microliter spuitHamilton8001410 µL
Optische Vezel Koud Licht met dubbele VezelStepLGY-150Lokaal leverancier
Dier trimmerWAHL09962-2018
Verdamper voor IsofluraneStepAS-01Lokaal leverancier
VibratomeLeicaVT1000S
Software
Dier gedrag video tracking software

Referenties

  1. Lynch, J. B., Hsiao, E. Y. Microbiomes as sources of emergent host phenotypes. Science. 365 (6460), 1405-1409 (2019).
  2. Dinan, T. G., Cryan, J. F. The microbiome-gut-brain axis in health and disease. Gastroenterology Clinics of North America. 46 (1), 77-89 (2017).
  3. Sharon, G., Sampson, T. R., Geschwind, D. H., Mazmanian, S. K. The central nervous system and the gut microbiome. Cell. 167 (4), 915-932 (2016).
  4. Krautkramer, K. A., Fan, J., Backhed, F. Gut microbial metabolites as multi-kingdom intermediates. Nature Reviews: Microbiology. 19 (2), 77-94 (2021).
  5. Lavelle, A., Sokol, H. Gut microbiota-derived metabolites as key actors in inflammatory bowel disease. Nature Reviews: Gastroenterology & Hepatology. 17 (4), 223-237 (2020).
  6. Dalile, B., Van Oudenhove, L., Vervliet, B., Verbeke, K. The role of short-chain fatty acids in microbiota-gut-brain communication. Nature Reviews: Gastroenterology & Hepatology. 16 (8), 461-478 (2019).
  7. Morais, L. H., Schreiber, H. L. T., Mazmanian, S. K. The gut microbiota-brain axis in behaviour and brain disorders. Nature Reviews: Microbiology. 19 (4), 241-255 (2021).
  8. Sharon, G., et al. Human gut microbiota from autism spectrum disorder promote behavioral symptoms in mice. Cell. 177 (6), 1600-1618 (2019).
  9. St Laurent, R., O'Brien, L. M., Ahmad, S. T. Sodium butyrate improves locomotor impairment and early mortality in a rotenone-induced Drosophila model of Parkinson's disease. Neuroscience. 246, 382-390 (2013).
  10. Govindarajan, N., Agis-Balboa, R. C., Walter, J., Sananbenesi, F., Fischer, A. Sodium butyrate improves memory function in an Alzheimer's disease mouse model when administered at an advanced stage of disease progression. Journal of Alzheimer's Disease. 26 (1), 187-197 (2011).
  11. Needham, B. D., et al. A gut-derived metabolite alters brain activity and anxiety behaviour in mice. Nature. 602 (7898), 647-653 (2022).
  12. Silva, Y. P., Bernardi, A., Frozza, R. L. The role of short-chain fatty acids from gut microbiota in gut-brain communication. Frontiers in Endocrinology. 11, 25(2020).
  13. Kratsman, N., Getselter, D., Elliott, E. Sodium butyrate attenuates social behavior deficits and modifies the transcription of inhibitory/excitatory genes in the frontal cortex of an autism model. Neuropharmacology. 102, 136-145 (2016).
  14. Kelly, J. R., et al. Transferring the blues: Depression-associated gut microbiota induces neurobehavioural changes in the rat. Journal of Psychiatric Research. 82, 109-118 (2016).
  15. Wang, L., et al. Elevated fecal short chain fatty acid and ammonia concentrations in children with autism spectrum disorder. Digestive Diseases and Sciences. 57 (8), 2096-2102 (2012).
  16. Adams, J. B., Johansen, L. J., Powell, L. D., Quig, D., Rubin, R. A. Gastrointestinal flora and gastrointestinal status in children with autism--comparisons to typical children and correlation with autism severity. BMC Gastroenterology. 11, 22(2011).
  17. Skonieczna-Zydecka, K., et al. Faecal short chain fatty acids profile is changed in Polish depressive women. Nutrients. 10 (12), 1939(2018).
  18. Szczesniak, O., Hestad, K. A., Hanssen, J. F., Rudi, K. Isovaleric acid in stool correlates with human depression. Nutritional Neuroscience. 19 (7), 279-283 (2016).
  19. Martin, A. M., Sun, E. W., Rogers, G. B., Keating, D. J. The influence of the gut microbiome on host metabolism through the regulation of gut hormone release. Frontiers in Physiology. 10, 428(2019).
  20. Franklin, K. B. J., Paxinos, G. Paxinos and Franklin's The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. (2013).
  21. York, J. M., Blevins, N. A., McNeil, L. K., Freund, G. G. Mouse short- and long-term locomotor activity analyzed by video tracking software. Journal of Visualized Experiments. (76), e50252(2013).
  22. Berg, L., Gerdey, J., Masseck, O. A. Optogenetic manipulation of neuronal activity to modulate behavior in freely moving mice. Journal of Visualized Experiments. (164), e61023(2020).
  23. Meyerhoff, J., et al. Microdissection of mouse brain into functionally and anatomically different regions. Journal of Visualized Experiments. (168), e61941(2021).
  24. Needham, B. D., Kaddurah-Daouk, R., Mazmanian, S. K. Gut microbial molecules in behavioural and neurodegenerative conditions. Nature Reviews: Neuroscience. 21 (12), 717-731 (2020).
  25. Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. Journal of Visualized Experiments. (20), e880(2008).
  26. Xiaoguang, W., et al. Establishment of a valuable mimic of Alzheimer's disease in rat animal model by intracerebroventricular injection of composited amyloid beta protein. Journal of Visualized Experiments. (137), e56157(2018).
  27. Venniro, M., Shaham, Y. An operant social self-administration and choice model in rats. Nature Protocols. 15 (4), 1542-1559 (2020).
  28. Ucal, M., et al. Rat model of widespread cerebral cortical demyelination induced by an intracerebral injection of pro-inflammatory cytokines. Journal of Visualized Experiments. (175), e57879(2021).
  29. Oberrauch, S., et al. Intraventricular drug delivery and sampling for pharmacokinetics and pharmacodynamics study. Journal of Visualized Experiments. (181), e63540(2022).
  30. Shultz, S. R., et al. Intracerebroventricular injections of the enteric bacterial metabolic product propionic acid impair cognition and sensorimotor ability in the Long-Evans rat: further development of a rodent model of autism. Behavioural Brain Research. 200 (1), 33-41 (2009).
  31. Shultz, S. R., et al. Intracerebroventricular injection of propionic acid, an enteric metabolite implicated in autism, induces social abnormalities that do not differ between seizure-prone (FAST) and seizure-resistant (SLOW) rats. Behavioural Brain Research. 278, 542-548 (2015).
  32. Perry, R. J., et al. Acetate mediates a microbiome-brain-beta-cell axis to promote metabolic syndrome. Nature. 534 (7606), 213-217 (2016).
  33. Muller, P. A., et al. Microbiota modulate sympathetic neurons via a gut-brain circuit. Nature. 583 (7816), 441-446 (2020).
  34. Pardridge, W. M. CSF, blood-brain barrier, and brain drug delivery. Expert Opinion on Drug Delivery. 13 (7), 963-975 (2016).
  35. Wu, J. -T., et al. Oral short-chain fatty acids administration regulates innate anxiety in adult microbiome-depleted mice. Neuropharmacology. , (2022).
  36. Lee, J., et al. Gut microbiota-derived short-chain fatty acids promote poststroke recovery in aged mice. Circulation Research. 127 (4), 453-465 (2020).
  37. Chiu, C., et al. Temporal course of cerebrospinal fluid dynamics and amyloid accumulation in the aging rat brain from three to thirty months. Fluids Barriers CNS. 9 (1), 3(2012).
  38. Schuler, B., Rettich, A., Vogel, J., Gassmann, M., Arras, M. Optimized surgical techniques and postoperative care improve survival rates and permit accurate telemetric recording in exercising mice. BMC Veterinary Research. 5, 28(2009).
  39. Hurst, J. L., West, R. S. Taming anxiety in laboratory mice. Nature Methods. 7 (10), 825-826 (2010).
  40. Shuman, T., et al. Breakdown of spatial coding and interneuron synchronization in epileptic mice. Nature Neuroscience. 23 (2), 229-238 (2020).
  41. de Groot, A., et al. NINscope, a versatile miniscope for multi-region circuit investigations. Elife. 9, 49987(2020).
  42. Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. Journal of Visualized Experiments. (91), e51863(2014).
  43. Wolter, J. M., et al. Cas9 gene therapy for Angelman syndrome traps Ube3a-ATS long non-coding RNA. Nature. 587 (7833), 281-284 (2020).
  44. Graybuck, L. T., et al. Enhancer viruses for combinatorial cell-subclass-specific labeling. Neuron. 109 (9), 1449-1464 (2021).
  45. Xie, M., et al. TREM2 interacts with TDP-43 and mediates microglial neuroprotection against TDP-43-related neurodegeneration. Nature Neuroscience. 25 (1), 26-38 (2022).
  46. Hsiao, E. Y., et al. Microbiota modulate behavioral and physiological abnormalities associated with neurodevelopmental disorders. Cell. 155 (7), 1451-1463 (2013).
  47. Bermudez-Martin, P., et al. The microbial metabolite p-Cresol induces autistic-like behaviors in mice by remodeling the gut microbiota. Microbiome. 9 (1), 157(2021).
  48. Needham, B. D., et al. A gut-derived metabolite alters brain activity and anxiety behaviour in mice. Nature. 602 (7898), 647-653 (2022).
  49. Stewart Campbell, A., et al. Safety and target engagement of an oral small-molecule sequestrant in adolescents with autism spectrum disorder: an open-label phase 1b/2a trial. Nature Medicine. 28 (3), 528-534 (2022).
  50. Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
  51. Deisseroth, K. Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience. Nature Neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).
  52. Roth, B. L. DREADDs for neuroscientists. Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).
  53. Kaelberer, M. M., et al. A gut-brain neural circuit for nutrient sensory transduction. Science. 361 (6408), (2018).
  54. Needham, B. D., Tang, W., Wu, W. L. Searching for the gut microbial contributing factors to social behavior in rodent models of autism spectrum disorder. Developmental Neurobiology. 78 (5), 474-499 (2018).
  55. Schretter, C. E., et al. A gut microbial factor modulates locomotor behaviour in Drosophila. Nature. 563 (7731), 402-406 (2018).
  56. Chu, C., et al. The microbiota regulate neuronal function and fear extinction learning. Nature. 574 (7779), 543-548 (2019).
  57. Wu, W. L., et al. Microbiota regulate social behaviour via stress response neurons in the brain. Nature. 595 (7867), 409-414 (2021).
  58. Buchanan, K. L., et al. The preference for sugar over sweetener depends on a gut sensor cell. Nature Neuroscience. 25 (2), 191-200 (2022).
  59. Han, W., et al. A neural circuit for gut-induced reward. Cell. 175 (3), 665-678 (2018).
  60. Yamawaki, Y., et al. Antidepressant-like effect of sodium butyrate (HDAC inhibitor) and its molecular mechanism of action in the rat hippocampus. World Journal of Biological Psychiatry. 13 (6), 458-467 (2012).
  61. Ho, L., et al. Protective roles of intestinal microbiota derived short chain fatty acids in Alzheimer's disease-type beta-amyloid neuropathological mechanisms. Expert Review of Neurotherapeutics. 18 (1), 83-90 (2018).
  62. Liu, J., et al. Anti-neuroinflammatory effect of short-chain fatty acid acetate against Alzheimer's disease via upregulating GPR41 and inhibiting ERK/JNK/NF-kappaB. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 68 (27), 7152-7161 (2020).
  63. van de Wouw, M., et al. Short-chain fatty acids: microbial metabolites that alleviate stress-induced brain-gut axis alterations. Jounal of Physiology. 596 (20), 4923-4944 (2018).
  64. Olson, C. A., et al. The gut microbiota mediates the anti-seizure effects of the ketogenic diet. Cell. 173 (7), 1728-1741 (2018).
  65. Stewart Campbell, A., et al. Safety and target engagement of an oral small-molecule sequestrant in adolescents with autism spectrum disorder: an open-label phase 1b/2a trial. Nature Medicine. 28 (3), 528-534 (2022).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Darmmicrobiotakortketenvetzurengeleide canulestereotactische chirurgiedarm-hersenasgedragstestenfluorescentiemicroscopie
Intracerebroventriculaire toediening van van de darm afgeleide microbiële metabolieten in vrij bewegende muizen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.