Method Article

Gelijktijdige beeldvorming en flowcytometrie-gebaseerde detectie van meerdere fluorescerende senescentiemarkers in therapie-geïnduceerde senescente kankercellen

DOI:

10.3791/63973

⸱

July 12th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Johannes Kepler University Linz, 2Charité - University Medicine Berlin, 3Max-Delbrück-Center for Molecular Medicine in the Helmholtz Association

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een op flowcytometrie gebaseerde methode voor visualisatie en kwantificering van meerdere senescentie-geassocieerde markers in enkele cellen.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chemotherapeutische geneesmiddelen kunnen onherstelbare DNA-schade in kankercellen veroorzaken, wat leidt tot apoptose of vroegtijdige senescentie. In tegenstelling tot apoptotische celdood is senescentie een fundamenteel andere machinerie die de voortplanting van kankercellen beperkt. Tientallen jaren van wetenschappelijke studies hebben de complexe pathologische effecten van senescente kankercellen in tumoren en micro-omgevingen onthuld die kankercellen en stromale cellen moduleren. Nieuw bewijs suggereert dat senescentie een krachtige prognostische factor is tijdens de behandeling van kanker, en daarom is snelle en nauwkeurige detectie van senescente cellen in kankermonsters essentieel. Dit artikel presenteert een methode om therapie-geïnduceerde senescentie (TIS) in kankercellen te visualiseren en te detecteren. Diffuse grote B-cellymfoom (DLBCL) cellijnen werden behandeld met mafosfamide (MAF) of daunorubicine (DN) en onderzocht op de senescentiemarker, senescentie-geassocieerde β-galactosidase (SA-β-gal), de DNA-synthesemarker 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) en de DNA-schademarker gamma-H2AX (γH2AX). Flowcytometer beeldvorming kan helpen bij het genereren van hoge resolutie eencellige beelden in een korte periode van tijd om tegelijkertijd de drie markers in kankercellen te visualiseren en te kwantificeren.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een verscheidenheid aan stimuli kan cellulaire senescentie veroorzaken, waardoor cellen in een staat van stabiele celcyclusstilstand komen. Deze stimuli omvatten intrinsieke signaleringsveranderingen of extrinsieke spanningen. Intrinsieke signalen omvatten progressieve telomeerverkorting, veranderingen in de telomeerstructuur, epigenetische modificatie, proteostasestoornissen, mitochondriale disfunctie en activering van oncogenen. Extrinsieke stress omvat ontstekings- en/of weefselschadesignalen, straling of chemische behandeling en voedingsdeprivatie 1,2,3,4.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. DLBCL-cellijnen met mafosfamide- of daunorubicinebehandeling om cellulaire senescentie te induceren

OPMERKING: Het protocol werkt ook voor adherente kankercellen. Afhankelijk van de celgrootte, zaad 1-2 × 105 cellen in één put van een 6-well plaat en incubeer de plaat in een 5% CO2, 37 ° C incubator 's nachts voor de behandeling. De protocolstappen zijn hetzelfde als voor suspensiecellen, maar met twee uitzonderingen. Eerst moeten cellen na stap 3.4 van de plaat worden gestoffeerd. Ten tweede worden wasstappen uitgevoerd zonder centrifugatie vóór trypsinisatie.

  1. Tel DLBCL-cellen en zaad 1 ×....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een compensatiematrix werd gegenereerd met behulp van beeldanalysesoftware door het laden van geregistreerde gegevens van eenkleurige controlemonsters. Zoals te zien is in aanvullende figuur S1, werd een niet-verwaarloosbare (coëfficiëntwaarde ≥ 0,1) lichtoverloop van EdU naar C12FDG gedetecteerd met een overspraakcoëfficiëntwaarde 0,248, terwijl de overspraak tussen andere kanalen niet significant was. Vier verschillende DLBCL-cellijnen werden behandeld met 5 μg / ml MAF of 20 ng / ml DN om c.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze methode onderzocht het senescentie-enter vermogen van vier verschillende DLBCL-cellijnen bij chemotherapiebehandeling, met bright-field imaging en flowcytometrie-gebaseerde kwantificering. Op eencellig niveau hebben we met succes belangrijke C12FDG + EdU-Ki67 + senescente populaties gedetecteerd in behandelde KARPAS422- en WSU-DLCL2-cellen, en in mindere mate in OCI-LY1-cellen, terwijl de SU-DHL6-cellijn resistent was tegen de behandeling. Het verschil in senescentie-enter.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door een beurs aan Yong Yu van de Johannes Kepler Universiteit Linz (BERM16108001).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa Fluor 647 anti-H2A.X Phospho (Ser139) AntibodyBiolegend613407
Anti-Ki-67 Mouse Monoclonal Antibody (Alexa Fluor 647)Biolegend350509
C12FDG (5-Dodecanoylaminofluorescein Di-β-D-Galactopyranoside)Fisher Scientific11590276
Chloroquin -diphosphatSigma aldrichC6628
Cleanser (Coulter Clenz)Beckman Coulter8546929
Click-iT EdU Pacific Blue Flow Cytometry Assay KitThermo ScientificC10418
DaunorubicinMedchemexpressHY-13062A
Debubbler (70% Isopropanol)Millipore1.3704
Image Analysis software (Amnis IDEAS 6.3)LuminexCN-SW69-12
Instrument and imaging software (Amnis ImageStreamX Mk II Imaging Flow Cytometer System and INSPIRE software)Luminex100220
KARPASDSMZACC 31
mafosfamide cyclohexylamineNiomechD-17272
OCI-LY1DSMZACC 722
ParaformaldehydeFisher Scientific11473704
PETG (2-Phenylethyl-β-D-thiogalactosid) Sigma aldrichP4902
saponinSigma aldrich47036
SheathMilliporeBSS-1006-B
SpeedBead Kit for ImageStreamLuminex400041
Sterilizer (0.4-0.7% Hypochlorite)VWRJT9416-1
SU-DHL6DSMZACC 572
WSU-DLCL2DSMZACC 575

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. The essence of senescence. Genes and Development. 24 (22), 2463-2479 (2010).
  2. Di Micco, R., et al. Oncogene-induced senescence is a DNA damage response triggered by DNA hyper-replication. Nature. 444 (7119),....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Imaging Flow CytometrySenescence MarkersTherapy Induced SenescenceFluorescent Marker DetectionDLBCL Cell LinesGamma H2AX DetectionEdU IncorporationC12 FDG StainingSingle Cell ImagingNuclear Foci Quantification

Related Articles