Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Gedifferentieerde muis adipocyten in primaire cultuur: een model van insulineresistentie

4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/63979

⸱

17 februari 2023

 ,  ,  ,  , 
1Instituto de Neurobiología, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM)

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de isolatie van muis preadipocyten uit onderhuids vet, hun differentiatie in volwassen adipocyten en de inductie van insulineresistentie. De werking van insuline wordt geëvalueerd door de fosforylering/activering van leden van de insulinesignaleringsroute door western blot. Deze methode maakt directe bepaling van insulineresistentie/gevoeligheid in primaire adipocyten mogelijk.

Samenvatting

Insulineresistentie is een verminderd effect van insuline op de doelcellen, meestal afgeleid van verminderde insulinereceptorsignalering. Insulineresistentie draagt bij aan de ontwikkeling van diabetes type 2 (T2D) en andere van obesitas afgeleide ziekten met een hoge prevalentie wereldwijd. Daarom is het begrijpen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan insulineresistentie van groot belang. Verschillende modellen zijn gebruikt om insulineresistentie zowel in vivo als in vitro te bestuderen; Primaire adipocyten vormen een aantrekkelijke optie om de mechanismen van insulineresistentie te bestuderen en moleculen te identificeren die deze aandoening tegengaan en de moleculaire doelen van insuline-sensibiliserende geneesmiddelen. Hier hebben we een insulineresistentiemodel opgesteld met behulp van primaire adipocyten in cultuur behandeld met tumornecrosefactor-α (TNF-α).

Adipocytenvoorlopercellen (APC's), geïsoleerd uit collagenase-verteerd onderhuids vetweefsel van muizen door magnetische celscheidingstechnologie, worden gedifferentieerd in primaire adipocyten. Insulineresistentie wordt vervolgens geïnduceerd door behandeling met TNF-α, een pro-inflammatoir cytokine dat de tyrosinefosforylering / activering van leden van de insulinesignaleringscascade vermindert. Verminderde fosforylering van insulinereceptor (IR), insulinereceptorsubstraat (IRS-1) en eiwitkinase B (AKT) worden gekwantificeerd door western blot. Deze methode biedt een uitstekend hulpmiddel om de mechanismen te bestuderen die insulineresistentie in vetweefsel bemiddelen.

Inleiding

Insuline is een anabolisch hormoon geproduceerd door pancreas eilandje β-cellen en de belangrijkste regulator van glucose en lipiden metabolisme. Onder de vele functies reguleert insuline de opname van glucose, glycogeensynthese, gluconeogenese, eiwitsynthese, lipogenese en lipolyse1. Het initiële moleculaire signaal na insuline-interactie met zijn receptor (IR) is de activering van de intrinsieke tyrosine-eiwitkinaseactiviteit van IR2, resulterend in de autofosforylering3 en de daaropvolgende activering van een familie van eiwitten die bekend staat als insulinereceptorsubstraten (IRS), die bindt aan adaptoreiwitten die leiden tot activering van een cascade van eiwitkinasen4 . Insuline activeert twee belangrijke signaalroutes: fosfatidylinositol 3-kinase (PI3K)-eiwitkinase B (AKT) en Ras-mitogeen-geactiveerd eiwitkinase (MAPK). De eerste vormt een belangrijk vertakkingspunt of knooppunt 4,5 voor de activering van talrijke downstream-effectoren die betrokken zijn bij diverse fysiologische functies, waaronder de regulatie van brandstofhomeostase, terwijl de laatste de celgroei en differentiatie reguleert 4,6. Insuline acties zijn uiteindelijk afhankelijk van het celtype en de fysiologische context7.

Een van de belangrijkste insuline-responsieve metabole weefsels is het vetweefsel. Wit vetweefsel is het meest voorkomende type vet bij mensen en knaagdieren, verdeeld in onderhuids vet (tussen de huid en spieren) en visceraal vet (rond de organen in de buikholte). Gezien hun grote volume zijn adipocyten of vetcellen het meest voorkomende celtype in vetweefsel. Deze vetcellen kunnen bruin/beige (thermogeen), roze (in de borstklier) en wit 8,9 zijn. Witte adipocyten houden de belangrijkste energiereserves in het lichaam in de vorm van triglyceriden, een insulineafhankelijk proces. Insuline bevordert glucosetransport en lipogenese, terwijl het lipolyse of lipidenafbraak remt 7,10. Het vergemakkelijkt ook de differentiatie van preadipocyten in adipocyten - de volwassen vetopslagcellen11.

Insulineresistentie treedt op wanneer een normaal insulineniveau een verzwakte biologische respons produceert, wat resulteert in compenserende hyperinsulinemie12. Insulineresistentie is een aandoening geassocieerd met overgewicht en obesitas5, die in combinatie leidt tot diabetes type 2 (T2D) en andere stofwisselingsziekten13. Hyperinsulinemie compenseert insulineresistentie in perifere weefsels om normale bloedglucosespiegels te handhaven14. Uiteindelijk β-celverlies of -uitputting, samen met verergerde insulineresistentie, leidt echter tot verhoogde bloedglucosespiegels die consistent zijn met T2D5. Daarom kunnen insulineresistentie en hyperinsulinemie bijdragen aan de ontwikkeling van van obesitas afgeleide metabole ziekten15. Bovendien kan obesitas chronische laaggradige lokale ontsteking veroorzaken die insulineresistentie in vetweefsel bevordert15,16,17. Bovendien leiden van obesitas afgeleide veranderingen in vetweefsel, zoals fibrose, ontsteking en verminderde angiogenese en adipogenese, tot lagere adiponectine-serumspiegels (een insulinesensibilisator) en verhoogde secretie van factoren zoals plasminogeenactivatorremmer 1 (PAI-1), vrije vetzuren en exosomen in de bloedbaan, waardoor insulineresistentie wordt verergerd17.

Veel aspecten die ten grondslag liggen aan insulineresistentie blijven onbekend. In vitro en in vivo modellen zijn ontwikkeld om de mechanismen te bestuderen die insulineresistentie bemiddelen in belangrijke doelweefsels, waaronder vetweefsel. Het voordeel van in vitro modellen is dat onderzoekers meer controle hebben over de omgevingscondities en insulineresistentie in specifieke celtypen kunnen evalueren. Met name adipocytenvoorlopercellen (APC's) hebben het individuele fenotype van het donorweefsel, dat de fysiologie beter kan weerspiegelen dan adipocytcellijnen. Een belangrijke factor die insulineresistentie in vitro induceert, is tumornecrosefactor-α (TNF-α). TNF-α is een pro-inflammatoir cytokine dat wordt uitgescheiden door adipocyten en macrofagen in vetweefsel18. Hoewel het nodig is voor een goede remodellering en expansie van vetweefsel19, induceert langdurige blootstelling aan TNF-α insulineresistentie in vetweefsel in vivo en in adipocyten in vitro20. Chronische TNF-α behandeling van verschillende celtypen leidt tot verhoogde serinefosforylering van zowel IR als IRS-1, waardoor verminderde tyrosinefosforylering wordt bevorderd21. Verhoogde fosforylering van IRS-1 op serineresiduen remt de IR-tyrosinekinaseactiviteit en kan een van de belangrijkste mechanismen zijn waardoor chronische TNF-α behandeling de insulinewerking schaadt22,23. TNF-α activeert routes waarbij de serine/threonine kinaseremmer van nucleaire factor ĸB kinase β (IKKβ) en c-Jun N terminal kinase (JNK)24 betrokken zijn. JNK induceert een complex pro-inflammatoir transcriptioneel programma, maar fosforyleert ook direct IRS-16.

Het begrijpen van de pathogenese van insulineresistentie is steeds belangrijker geworden om de ontwikkeling van toekomstige therapieën tegen T2D te begeleiden. APC's hebben bewezen een uitstekend model te zijn voor de studie van vetcelbiologie, inclusief de gevoeligheid en resistentie tegen insuline, en voor het identificeren van de intrinsieke eigenschappen van adipocyten onafhankelijk van de systemische omgeving. APC's kunnen gemakkelijk worden verkregen uit verschillende vetdepots en onder de juiste omstandigheden worden gedifferentieerd in volwassen adipocyten. Met deze methode kunnen directe effecten op insulineresistentie/gevoeligheid in adipocyten worden geëvalueerd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle knaagdierexperimenten werden goedgekeurd door de Commissie Bio-ethiek van het Instituut voor Neurobiologie van de UNAM, protocolnummer 075.

1. Isolatie van adipocytenvoorlopercellen van muizen

  1. Euthanaseer 8-10 weken oude mannelijke C57BL/6-muizen (bijv. door CO 2-inhalatie en daaropvolgende cervicale dislocatie) (vier dieren per isolatie). Desinfecteer de muizen door te wrijven met 70% ethanol en verkrijg het vetweefsel onmiddellijk na het offer.
    OPMERKING: Isoleer na de euthanasie van knaagdieren het vetweefsel onmiddellijk en voer alle stappen uit in een steriele laminaire stroomkap. Muizen worden onder 12 uur licht/donker cycli gehouden met vrije toegang tot voedsel en water.
  2. Ontleed het inguinale onderhuidse vetweefsel van elke muis. Verwijder alleen het vetweefsel, vermijd de verwijdering van spieren, huid of ander weefsel en verzamel het in een conische buis van 50 ml met 15 ml type 1 collagenase-oplossing (1,5 mg / ml) op ijs. Los type 1 collagenase op in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) hoog glucose-1% runderserumalbumine (BSA) en filtreer door spuitfilters van 0,2 μm.
  3. Snijd het vetweefsel in kleine stukjes met een steriele chirurgische schaar en verteer de monsters door incubatie met type 1 collagenase-oplossing bij 37 °C in een orbitale shaker (150 rpm) gedurende 30 minuten (plaats de buis met vet en collagenase in een horizontale positie voor een groter schudoppervlak). Controleer de spijsvertering elke 10 minuten om er zeker van te zijn dat deze werkt (weefselafbraak is zichtbaar) en om overdigestie te voorkomen (zie aanvullende figuur S1).
  4. Filter met een mesh-spuit van 200 μm (voorheen geautoclaveerd) om weefsel te verwijderen dat niet is verteerd met collagenase. Breng het filter over de rand van de buis om zoveel mogelijk cellen in de oplossing af te voeren. Voeg 15 ml koude DMEM-1% BSA toe om de spijsvertering te stoppen en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 400 × g bij 4 °C.
  5. Zuig de bovenste laag met rijpe adipocyten en het grootste deel van de vloeibare laag op; Vermijd het aanraken of verstoren van de pellet. Voeg 20 ml koud fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)-2% foetaal runderserum (FBS) toe en resuspensie van de pellet. Centrifugeer bij 400 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
  6. Verwijder het supernatant en zuig eerst de bovenste laag aan om de resterende adipocyten en vet te verwijderen. Resuspendeer de pellet in 1 ml ammoniumchloridekalium (ACK) lyseringsbuffer (om rode bloedcellen te lyseren) en incubeer gedurende 5 minuten op ijs. Voeg 10 ml PBS-2% FBS toe, meng en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 400 × g bij 4 °C.
  7. Zuig het supernatant op en resuspensie de pellet in 200 μL anti-Fc-oplossing (gezuiverde rat anti-muis CD16/CD32 verdund in PBS-2% FBS [1:150]) om de Fc-receptor-gemedieerde binding door antilichamen van belang te verminderen. Incubeer op ijs gedurende 5 min. Breng de celsuspensie over in een buis van 5 ml die in de voorgekoelde rekken van een magnetische celscheider past en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 400 × g bij 4 °C.
  8. Elimineer het supernatant, voeg 200 μL van het mengsel van CD31 (PECAM-1) monoklonaal antilichaam (390) -biotine (1:100) en CD45 monoklonaal antilichaam (30-F11)-biotine (1:100) toe, meng goed en incubeer gedurende 15 minuten op ijs (bereid antilichaamverdunningen in anti-Fc-oplossing; zie tabel 1). Voeg 400 μL PBS-2% FBS toe en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 400 × g bij 4 °C.
    OPMERKING: CD31 en CD45 zijn markers van respectievelijk endotheelcellen en hematopoëtische cellen.
  9. Zuig het supernatant op en incubeer in 100 μL anti-biotine microbeads (1:5) gedurende 15 minuten op ijs (bereid antilichaamverdunningen in anti-Fc-oplossing, zie tabel 1). Voeg 400 μL PBS-2% FBS toe en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 400 × g bij 4 °C.
  10. Gooi het supernatant weg en resuspensie van de pellet in 350 μL PBS-2% FBS. Verwijder celaggregaten of grote deeltjes uit de eencellige suspensies met een voorscheidingsfilter (70 μm). Activeer eerst het filter met 100 μL PBS-2% FBS, passeer de celsuspensie door het filter (verzamel in een schone buis) en was ten slotte het filter met 100 μL PBS-2% FBS.
  11. Voer magnetische scheiding van cellen uit met behulp van de negatieve scheidingsstrategie met een magnetische celscheider.
    1. Plaats het monster in positie A van het koelrek (zorg ervoor dat het rek is voorgekoeld) en twee lege buizen in positie B en C om respectievelijk de niet-gelabelde en gelabelde cellen terug te winnen.
    2. Laad de wasbuffer en de lopende buffer in de bijbehorende flessen voordat u de apparatuur inschakelt. Programmeer de apparatuur om de magnetische scheiding van cellen uit te voeren met het DEPLETE-protocol .
      OPMERKING: Dit protocol is voor uitputting in de standaardmodus voor het verwijderen van cellen met normale antigeenexpressie (in dit geval cellen gelabeld met anti-CD31 en anti-CD45), als herstel de hoogste prioriteit heeft.
    3. Selecteer in de scheidingssectie het aantal monsters dat moet worden gescheiden en selecteer het DEPLETE-protocol . Druk op Uitvoeren en start de scheiding. Aan het einde van het programma worden de niet-gelabelde cellen teruggewonnen en centrifugeer u gedurende 5 minuten bij 400 × g bij 4 °C.
  12. Verwijder het supernatant en resuspensie van de pellet in 500 μL groeimedium (tabel 1).
  13. Zaai de APC's in een put van een 12-putplaat die eerder is bedekt met 2,5% keldermembraanmatrix (ongeveer 50.000-75.000 cellen worden verkregen). Voeg 400 μL 2,5% keldermembraanmatrix toe om het hele oppervlak van elke put te bedekken. Laat de plaat onmiddellijk na het verwijderen van de overtollige oplossing en het achterlaten van slechts een kleine laag de plaat drogen (zonder deksel) in de laminaire stroomkap gedurende ten minste 1 uur. Incubeer bij 37 °C in een CO 2-atmosfeer van 5%. Verander het medium elke 48 uur totdat de cellen 80% samenvloeiing bereiken.
  14. Verwijder bij 80% samenvloeiing het medium volledig en was met 350 μL PBS-2% FBS. Oogst de cellen met 350 μL 0,05% trypsine-EDTA gedurende 2 minuten bij 37 °C. Voeg 2 ml groeimedium toe en verzamel de cellen in een nieuwe conische buis van 50 ml en centrifugeer vervolgens gedurende 5 minuten op 400 × g .
  15. Passeer de APC's naar 12-putplaten (10.000-20.000 cellen per put) die eerder zijn bedekt met 2,5% keldermembraanmatrix. Incubeer bij 37 °C met 5% CO2. Verander het medium elke 48 uur totdat de cellen 80% samenvloeiing bereiken.
    OPMERKING: APC's kunnen eenmaal worden gepasseerd. Vervolgens verliezen ze hun vermogen om zich te vermenigvuldigen en te differentiëren. Zie de workflow voor het APC-isolatieproces in aanvullende figuur S2.

2. Adipocytendifferentiatie en inductie van insulineresistentie

OPMERKING: Houd de cellen op 37 °C in 5% CO2 en voer stappen uit waarbij het medium wordt veranderd en behandelingen met TNF-α en insuline in een steriele kap.

  1. Begin bij 80% samenvloeiing met het differentiatieproces; zuig elk groeimedium af en vervang het door 500 μL differentiatiemedium (tabel 1) met 3,3 nM botmorfogenetisch eiwit (BMP4) in elk putje.
  2. Vervang het medium na 48 uur door het differentiatiemedium (500 μL per put) en de differentiatiecocktail (tabel 1).
  3. Verwijder het medium 72 uur later en voeg 100 nM insuline toe aan 500 μL vers differentiatiemedium.
    OPMERKING: Cellen beginnen een rond uiterlijk te vertonen met kleine lipidedruppeltjes erin.
  4. Zuig elk differentiatiemedium af en vervang het 48 uur later door 500 μL eenvoudig medium-2% FBS (tabel 1). Induceer insulineresistentie met 4 ng/ml TNF-α. Inclusief controleputten zonder TNF-α behandeling.
  5. Voeg na 24 uur incubatie 4 ng/ml TNF-α toe in eenvoudige medium-0% FBS (tabel 1). Onderhoud controleputten zonder TNF-α behandeling.
  6. Activeer de insulinesignaleringsroute 24 uur later door 100 nM insuline toe te voegen en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 °C in een 5% CO 2-atmosfeer. Verwijder het medium en was met 500 μL PBS. Inclusief controleputten zonder insulinebehandeling.

3. Evaluatie van de insulinesignaleringsroute door western blot

  1. Eiwitextractie en kwantificering
    1. Was elk putje van cellen met 500 μL PBS en houd het op ijs om de cellen te lyseren in 50 μL RIPA-buffer (tabel 1) met 1% proteaseremmercocktail toegevoegd net voor de monsterisolatie. Schraap het hele oppervlak van de put met een punt en breng het lysaat over in een microcentrifugebuis van 0,6 ml (op ijs houden).
    2. Incubeer gedurende 1 uur bij 4 °C in een roterende schudder, meng door vortexing en centrifugeer gedurende 15 minuten bij 8.000 × g bij 4 °C en win het supernatant terug (op ijs houden).
    3. Bepaal de eiwitconcentratie met behulp van de Bradford-test (verdun het monster niet om te kwantificeren).
    4. Neem het benodigde volume dat overeenkomt met 40-60 μg en denatureer met 6x Laemmli-buffer (tabel 1) door gedurende 15 minuten bij 97 °C te broeden terwijl u schudt bij 550 tpm. Invriezen tot gebruik.
  2. SDS-polyacrylamide gel elektroforese
    1. Voer SDS-polyacrylamide gel elektroforese (SDS-PAGE) uit met een 7,5% polyacrylamide gel van 1,5 mm dikte. Steek de gel in de tank en vul met loopbuffer (tabel 1).
    2. Voeg 3 μL voorgeroeste eiwitstandaard toe aan de eerste put van de gel en laad elk monster in volgende putjes.
    3. Laat de gel ongeveer 15 minuten op 80 V draaien om ervoor te zorgen dat het monster in de gelmatrix van de polyacrylamideconcentrator komt. Verhoog daarna de spanning tot 90 V gedurende 2,5 uur of totdat de 37 kDa molecuulgewichtsmarker aan de onderkant van de gel te zien is.
    4. Breng de eiwitten van de gel over naar een nitrocellulosemembraan in een halfdroge kamer gedurende 35 minuten bij 25 V. Dompel vooraf de gel, het membraan en de filters gedurende enkele minuten onder in de transferbuffer (tabel 1).
  3. Western blot
    1. Was het membraan na de overdracht gedurende 3 minuten met Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) met 0,1% Tween 20 (TBS-T 0,1%) (tabel 1) met schudden bij 30 tpm.
    2. Blokkeer het membraan met de blokkeringsoplossing (tabel 1) bij 4 °C gedurende 1 uur in constante rotatie.
    3. Snijd het membraan in drie delen volgens de molecuulgewichtsmarker om 's nachts te incuberen met verschillende primaire antilichamen (verdund in blokkerende oplossing) bij 4 °C in constante rotatie: fosfo-IRS1 (Tyr608) antilichaam (1:1.000), verwachte band bij 180 kDa; Fosfo-insulinereceptor β (Tyr1150/1151) antilichaam (1:1.000), verwachte band bij 95 kDa; Fosfo-Akt (Ser473) antilichaam (1:1.000), verwachte band bij 60 kDa.
    4. Was de vliezen 5x gedurende 5 min elk met TBS-T 0,1%.
    5. Incubeer de membranen met het overeenkomstige peroxidase-gekoppelde secundaire antilichaam (verdund in blokkerende oplossing) gedurende 2 uur bij kamertemperatuur in constante rotatie: peroxidase affiniPure ezel anti-konijn IgG (H + L) (1: 5.000).
    6. Was de vliezen 5x gedurende 5 min elk met TBS-T 0,1%.
    7. Detecteer de eiwitten met behulp van het chemiluminescentiedetectiesysteem. Bereid het substraat voor volgens de instructies van de fabrikant.
    8. Doe de vlek in een plastic zak en voeg 200 μL chemiluminescent substraat toe om het membraan volledig te bedekken. Laat overtollig substraat aftappen en verwijder eventuele luchtbellen.
    9. Stel elke vlek gedurende 30-60 s bloot in een hoogwaardig beeldvormingssysteem dat compatibel is met chemiluminescentie.
    10. Strip de membranen (stappen 10-13 van de western blot-sectie) om de antilichaam-antigeeninteracties te breken en zo nitrocellulosemembranen opnieuw te laten uitwissen. Recupereer de membranen en was 3x gedurende 5 min elk met TBS-T 1% bij 50 rpm.
    11. Incubeer gedurende 7 minuten met 10 ml van 0,2 M NaOH bij 50 tpm.
    12. Was 3x gedurende 5 min elk met kraanwater op 50 rpm.
    13. Was gedurende 10 minuten met TBS-T 1% bij 50 tpm.
    14. Herhaal stap 2-9 van de western blot-sectie om het membraan te incuberen met anti-bèta-tubuline (55 kDa) als belastingscontrole met behulp van 1:1.000 verdunning.
    15. Voer densitometrische analyse25 uit voor elk eiwit met behulp van ImageJ-software (https://imagej.nih.gov/).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

In de afgelopen jaren heeft de toegenomen prevalentie van obesitas en T2D geleid tot een intense zoektocht naar de mechanismen die insulineresistentie in vetweefsel bemiddelen. Met het hier beschreven protocol kunnen APC's worden gedifferentieerd in volwassen adipocyten om insulineresistentie en -gevoeligheid te evalueren. Zodra de APC's confluentie bereiken, duurt het 10 dagen om hun differentiatie in volwassen adipocyten en hun TNF-α-gemedieerde inductie van insulineresistentie te voltooien (figuur...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit artikel biedt een methode voor het bestuderen van insulineresistentie die primaire adipocyten gebruikt in cultuur behandeld met TNF-α. Dit model heeft het voordeel dat primaire adipocyten gedurende lange tijd onder gedefinieerde omstandigheden kunnen worden gekweekt met een strakke controle van cellulaire omgevingsfactoren26. De testduur is 15-20 dagen, hoewel variaties in het percentage gedifferentieerde adipocyten kunnen optreden tussen experimenten. Primaire adipocyten hebben voordelen ten ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling te hebben.

Dankbetuigingen

We bedanken Daniel Mondragón, Antonio Prado, Fernando López-Barrera, Martín García-Servín, Alejandra Castilla en María Antonieta Carbajo voor hun technische assistentie, en Jessica Gonzalez Norris voor het kritisch bewerken van het manuscript. Dit protocol werd ondersteund door Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de México (CONACYT), Fondo Sectorial de Investigación para la Educación Grant 284771 (aan Y.M.).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1. Isolatie van muis adipocyte precursor cellen
ACK lysing buffer LONZA10-548E
Anti-Biotin Microbeads Miltenyi130-090-485
Anti-CD31eBioscience13-0311-85
AutoMACS Pro SeparatorMiltenyi
Basement membrane matrix (matrigel)Corning354234
bFGFSigmaF0291Groeifactor
BSAEquitech-Bio, Inc.BAC63-1000
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) - Biotin eBioscience13-0451-85
Collagenase, Type 1Worthington BiochemLS004197
DexamethasoneSigmaD1756
DMEMGIBCO12800017
DMEM low glucoseGIBCO31600-034
EGFPeprotech315-09Groeifactor
FBSGIBCO26140-079
ITS mixSigmaI3146
L-ascorbinezuur 2-fosfaatSigmaA8960
LIFMilliporeESG1107Groeifactor
Linolzuur-albumineSigmaL9530
MCDB 201 mediumSigmaM6770
NormocinInvivoGenant-nr-2
PDGF-BB Peprotech315-18Groeifactor
Penicilline-StreptomycineBioWestL0022-100
Pre-Separation Filters (70 µm)Miltenyi130-095-823
Gezuiverd rat anti-muis CD16 / CD32 BD Pharmingen553142
Trypsin-EDTA GIBCO25300062
2. Differentiatie van adipocyten en inductie van insulineresistentie
3-Isobutyl-1-methylxanthine [IBMX]SigmaI5879Differentiatiecocktail
BMP4R&D Systems5020-BP-010Differentiatiecocktail
DexamethasoneSigmaD1756Differentiatiecocktail
InsulinSigmaI9278
RosiglitazoneCayman71742Differentiatiecocktail
TNFαR&D Systems210-TA-005 
3. Evaluatie van de insulinesignaleringsroute door middel van western blot
Anti-beta tubulin antilichaamAbcamab6046
BromofenolblauwBioRad161-0404Laemmli buffer
EDTASigmaE5134RIPA buffer
EGTASigmaE4378RIPA buffer
FluorChem E systeemProteinSimple
GlycerolSigmaG6279Laemmli buffer
GlycineSigmaG7126Lopen en Overdracht buffer
IgepalSigmaI3021RIPA buffer
2- mercaptoethanolSigmaM3148Laemmli buffer
MethanolJT Baker907007Overdracht buffer
NaClJT Baker3624-05TBS-T
NaFSigma77F-0379RIPA buffer
NaOH JT Baker3722-19
Na4P2O7Sigma114F-0762RIPA buffer
Na3VO4SigmaS6508RIPA buffer
Nitrocellulose membraan BioRad1620112
Vetvrije droge melkBioRad1706404Blocking solution
Voorbehandelde eiwitstandaard BioRad1610395
Protease inhibitor cocktail SigmaP8340-5ML
Peroxidase AffiniPure Ezel Anti-Konijn IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch711-035-132
Phospho- Insulin Receptor β Cell signaling3024
Phospho-Akt (Ser473) AntilichaamCell signaling9271
Phospho-IRS1 (Tyr608) antilichaamMillipore9432
Saccharose JT Baker407205RIPA buffer
SDSBioRad1610302Lopen en laemmli buffer
SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent SubstraatThermo Scientific34577
Tris-basePromegaH5135Lopen, overdracht en laemmli buffer
Tris-HClJT Baker4103-02RIPA buffer - TBS
Tween 20SigmaP1379TBS-T

Referenties

  1. Elmus, G. B. Insulin signaling and insulin resistance. Journal of Investigative Medicine. 61 (1), 11-14 (2013).
  2. Kasuga, M., Zick, Y., Blithe, D. L., Crettaz, M., Kahn, C. R. Insulin stimulates tyrosine phosphorylation of the insulin receptor in a cell-free system. Nature. 298 (5875), 667-669 (1982).
  3. Kasuga, M., Karlsson, F. A., Kahn, C. R. Insulin stimulates the phosphorylation of the 95,000-dalton subunit of its own receptor. Science. 215 (4529), 185-187 (1982).
  4. Taniguchi, C. M., Emanuelli, B., Kahn, C. R. Critical nodes in signalling pathways: insights into insulin action. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (2), 85-96 (2006).
  5. Freeman, A. M., Pennings, N. Insulin Resistance. StatPearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island (FL). Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK507839/ (2021).
  6. Petersen, M. C., Shulm, G. I. Mechanisms of insulin action and insulin resistance. Physiological Reviews. 98 (4), 2133-2223 (2018).
  7. Batista, T. M., Haider, N., Kahn, C. R. Defining the underlying defect in insulin action in type 2 diabetes. Diabetologia. 64 (5), 994-1006 (2021).
  8. Unamuno, X., Frühbeck, G., Catalán, V. Adipose Tissue. Encyclopedia of Endocrine Diseases. Second edition. , Academic Press. 370-384 (2019).
  9. Cinti, S. Pink adipocytes. Trends in Endocrinology & Metabolism. 29 (9), 651-666 (2018).
  10. Kahn, B. B., Flier, J. S. Obesity and insulin resistance. The Journal of Clinical Investigation. 106 (4), 473-481 (2000).
  11. Klemm, D. J., et al. Insulin-induced adipocyte differentiation. The Journal of Biological Chemistry. 276 (30), 28430-28435 (2001).
  12. Wilcox, G. Insulin and insulin resistance. The Clinical Biochemist. Reviews. 26 (2), 19-39 (2005).
  13. Yohannes, T. W. Obesity, insulin resistance, and type 2 diabetes: associations and therapeutic implications. Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 13, 3611-3616 (2020).
  14. James, D. E., Stöckli, J., Birnbaum, M. J. The etiology and molecular landscape of insulin resistance. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (11), 751-771 (2021).
  15. Wondmkun, Y. T. Obesity, insulin resistance, and type 2 diabetes: associations and therapeutic implications. Diabetes, Metabolic Syndrime and Obesity: Targets and Therapy. 9 (13), 3611-3616 (2020).
  16. Hardy, O. T., Czech, M. P., Corvera, S. What causes the insulin resistance underlying obesity. Current Opinion in Endocrinology, Diabetes, and Obesity. 19 (2), 81-87 (2012).
  17. Klein, S., Gastaldelli, A., Yki-Järvinen, H., Scherer, P. E. Why does obesity cause diabetes. Cell Metabolism. 34 (1), 11-20 (2022).
  18. Lo, K., et al. Analysis of in vitro insulin-resistance models and their physiological relevance to in vivo diet-induced adipose insulin resistance. Cell Reports. 5 (1), 259-270 (2013).
  19. Asterholm, I. W., et al. Adipocyte inflammation is essential for healthy adipose tissue expansion and remodeling. Cell Metabolism. 20 (1), 103-118 (2014).
  20. Hotamisligil, G. S., Murray, D. L., Choy, L. N., Spiegelman, B. M. Tumor necrosis factor alpha inhibits signaling from the insulin receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (11), 4854-4858 (1994).
  21. Ruan, H., Hacohen, N., Golub, T. R., Parijs, L. V., Lodish, H. F. Tumor necrosis factor-α suppresses adipocyte-specific genes and activates expression of preadipocyte genes in 3T3-L1 adipocytes. Nuclear factor-κB activation by TNF-α is obligatory. Diabetes. 51 (5), 1319-1336 (2002).
  22. Boucher, J., Kleinridders, A., Kahn, C. R. Insulin receptor signaling in normal and insulin-resistant states. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 6 (1), 009191(2014).
  23. Hotamisligil, G. S., et al. IRS-1-mediated inhibition of insulin receptor tyrosine kinase activity in TNF-alpha- and obesity-induced insulin resistance. Science. 271 (5249), 665-668 (1996).
  24. Copps, K. D., White, M. F. Regulation of insulin sensitivity by serine/threonine phosphorylation of insulin receptor substrate proteins IRS1 and IRS2. Diabetologia. 55 (10), 2565-2582 (2012).
  25. Gassmann, M., Grenacher, B., Rohde, B., Vogel, J. Quantifying western blots: pitfalls of densitometry. Electrophoresis. 30 (11), 1845-1855 (2009).
  26. Skurk, T., Hauner, H. Primary culture of human adipocyte precursor cells: expansion and differentiation. Methods in Molecular Biology. 806, 215-226 (2012).
  27. Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. Isolation and culture of preadipocytes from rodent white adipose tissue. Methods in Molecular Biology. 456, 201-219 (2008).
  28. Macotela, Y., et al. Intrinsic differences in adipocyte precursor cells from different white fat depots. Diabetes. 61 (7), 1691-1699 (2012).
  29. Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
  30. Hausman, D. B., DiGirolamo, M., Bartness, T. J., Hausman, G. J., Martin, R. J. The biology of white adipocyte proliferation. Obesity Reviews. 2 (4), 239-254 (2001).
  31. Kirkland, I. M., Tchkonia, T., Pirtskhalava, T., Han, J., Karagiannides, I. Adipogenesis and aging: does aging make fat go MAD. Experimental Geronotology. 37 (6), 757-767 (2002).
  32. Guo, W., et al. Aging results in paradoxical susceptibility of fat cell progenitors to lipotoxicity. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 292 (4), 1041-1051 (2007).
  33. Ruan, H., Hacohen, N., Golub, T. R., Van Parijs, L., Lodish, H. F.Tumor necrosis factor-a suppresses adipocyte-specific genes and activatesexpression of preadipocyte genes in 3T3-L1 adipocytes: nuclear factor-kappaB activation by TNF-a is obligatory. Diabetes. 51 (5), 1319-1336 (2002).
  34. Jager, J., Gre ́meaux, T., Cormont, M., Le Marchand-Brustel, Y., Tanti, J. F. Interleukin-1b-induced insulin resistance in adipocytes throughdown-regulation of insulin receptor substrate-1 expression. Endocrinology. 148 (1), 241-251 (2007).
  35. Rotter, V., Nagaev, I., Smith, U. Interleukin-6 (IL-6) induces insulinresistance in 3T3-L1 adipocytes and is, like IL-8 and tumor necrosis factor-a,overexpressed in human fat cells from insulin-resistant subjects. The Journal of Biological Chemistry. 278 (46), 45777-45784 (2003).
  36. Isidor, M. S., et al. Insulin resistance rewires the metabolic gene program and glucose utilization in human white adipocytes. International Journal of Obesity. 46 (3), 535-543 (2021).
  37. Houstis, N., Rosen, E. D., Lander, E. S. Reactive oxygen species have a causal role in multiple forms of insulin resistance. Nature. 440 (7086), 944-948 (2006).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Primaire adipocytenadipocytendifferentiatietumornecrosefactorinsulinesignaleringWestern blotadipocytenprecursorenmagnetische celseparatiesubcutaan vetweefselprote nefosforylering
Gedifferentieerde muis adipocyten in primaire cultuur: een model van insulineresistentie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.