Dit protocol beschrijft de isolatie van muis preadipocyten uit onderhuids vet, hun differentiatie in volwassen adipocyten en de inductie van insulineresistentie. De werking van insuline wordt geëvalueerd door de fosforylering/activering van leden van de insulinesignaleringsroute door western blot. Deze methode maakt directe bepaling van insulineresistentie/gevoeligheid in primaire adipocyten mogelijk.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Gedifferentieerde muis adipocyten in primaire cultuur: een model van insulineresistentie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Insulineresistentie is een verminderd effect van insuline op de doelcellen, meestal afgeleid van verminderde insulinereceptorsignalering. Insulineresistentie draagt bij aan de ontwikkeling van diabetes type 2 (T2D) en andere van obesitas afgeleide ziekten met een hoge prevalentie wereldwijd. Daarom is het begrijpen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan insulineresistentie van groot belang. Verschillende modellen zijn gebruikt om insulineresistentie zowel in vivo als in vitro te bestuderen; Primaire adipocyten vormen een aantrekkelijke optie om de mechanismen van insulineresistentie te bestuderen en moleculen te identificeren die deze aandoening tegengaan en de moleculaire doelen van insuline-sensibiliserende geneesmiddelen. Hier hebben we een insulineresistentiemodel opgesteld met behulp van primaire adipocyten in cultuur behandeld met tumornecrosefactor-α (TNF-α).
Adipocytenvoorlopercellen (APC's), geïsoleerd uit collagenase-verteerd onderhuids vetweefsel van muizen door magnetische celscheidingstechnologie, worden gedifferentieerd in primaire adipocyten. Insulineresistentie wordt vervolgens geïnduceerd door behandeling met TNF-α, een pro-inflammatoir cytokine dat de tyrosinefosforylering / activering van leden van de insulinesignaleringscascade vermindert. Verminderde fosforylering van insulinereceptor (IR), insulinereceptorsubstraat (IRS-1) en eiwitkinase B (AKT) worden gekwantificeerd door western blot. Deze methode biedt een uitstekend hulpmiddel om de mechanismen te bestuderen die insulineresistentie in vetweefsel bemiddelen.
Inleiding
Insuline is een anabolisch hormoon geproduceerd door pancreas eilandje β-cellen en de belangrijkste regulator van glucose en lipiden metabolisme. Onder de vele functies reguleert insuline de opname van glucose, glycogeensynthese, gluconeogenese, eiwitsynthese, lipogenese en lipolyse1. Het initiële moleculaire signaal na insuline-interactie met zijn receptor (IR) is de activering van de intrinsieke tyrosine-eiwitkinaseactiviteit van IR2, resulterend in de autofosforylering3 en de daaropvolgende activering van een familie van eiwitten die bekend staat als insulinereceptorsubstraten (IRS), die bindt ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle knaagdierexperimenten werden goedgekeurd door de Commissie Bio-ethiek van het Instituut voor Neurobiologie van de UNAM, protocolnummer 075.
1. Isolatie van adipocytenvoorlopercellen van muizen
- Euthanaseer 8-10 weken oude mannelijke C57BL/6-muizen (bijv. door CO 2-inhalatie en daaropvolgende cervicale dislocatie) (vier dieren per isolatie). Desinfecteer de muizen door te wrijven met 70% ethanol en verkrijg het vetweefsel onmiddellijk na het offer.
OPMERKING: Isoleer na de euthanasie van knaagdieren het vetweefsel onmiddellijk en voer alle stappen uit in een steriele laminaire stroomkap. Muizen wo....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
In de afgelopen jaren heeft de toegenomen prevalentie van obesitas en T2D geleid tot een intense zoektocht naar de mechanismen die insulineresistentie in vetweefsel bemiddelen. Met het hier beschreven protocol kunnen APC's worden gedifferentieerd in volwassen adipocyten om insulineresistentie en -gevoeligheid te evalueren. Zodra de APC's confluentie bereiken, duurt het 10 dagen om hun differentiatie in volwassen adipocyten en hun TNF-α-gemedieerde inductie van insulineresistentie te voltooien (figuur.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit artikel biedt een methode voor het bestuderen van insulineresistentie die primaire adipocyten gebruikt in cultuur behandeld met TNF-α. Dit model heeft het voordeel dat primaire adipocyten gedurende lange tijd onder gedefinieerde omstandigheden kunnen worden gekweekt met een strakke controle van cellulaire omgevingsfactoren26. De testduur is 15-20 dagen, hoewel variaties in het percentage gedifferentieerde adipocyten kunnen optreden tussen experimenten. Primaire adipocyten hebben voordelen ten .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling te hebben.
Dankbetuigingen
We bedanken Daniel Mondragón, Antonio Prado, Fernando López-Barrera, Martín García-Servín, Alejandra Castilla en María Antonieta Carbajo voor hun technische assistentie, en Jessica Gonzalez Norris voor het kritisch bewerken van het manuscript. Dit protocol werd ondersteund door Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de México (CONACYT), Fondo Sectorial de Investigación para la Educación Grant 284771 (aan Y.M.).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1. Isolatie van muis adipocyte precursor cellen | |||
| ACK lysing buffer | LONZA | 10-548E | |
| Anti-Biotin Microbeads | Miltenyi | 130-090-485 | |
| Anti-CD31 | eBioscience | 13-0311-85 | |
| AutoMACS Pro Separator | Miltenyi | ||
| Basement membrane matrix (matrigel) | Corning | 354234 | |
| bFGF | Sigma | F0291 | Groeifactor |
| BSA | Equitech-Bio, Inc. | BAC63-1000 | |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) - Biotin | eBioscience | 13-0451-85 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington Biochem | LS004197 | |
| Dexamethasone | Sigma | D1756 | |
| DMEM | GIBCO | 12800017 | |
| DMEM low glucose | GIBCO | 31600-034 | |
| EGF | Peprotech | 315-09 | Groeifactor |
| FBS | GIBCO | 26140-079 | |
| ITS mix | Sigma | I3146 | |
| L-ascorbinezuur 2-fosfaat | Sigma | A8960 | |
| LIF | Millipore | ESG1107 | Groeifactor |
| Linolzuur-albumine | Sigma | L9530 | |
| MCDB 201 medium | Sigma | M6770 | |
| Normocin | InvivoGen | ant-nr-2 | |
| PDGF-BB | Peprotech | 315-18 | Groeifactor |
| Penicilline-Streptomycine | BioWest | L0022-100 | |
| Pre-Separation Filters (70 µm) | Miltenyi | 130-095-823 | |
| Gezuiverd rat anti-muis CD16 / CD32 | BD Pharmingen | 553142 | |
| Trypsin-EDTA | GIBCO | 25300062 | |
| 2. Differentiatie van adipocyten en inductie van insulineresistentie | |||
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine [IBMX] | Sigma | I5879 | Differentiatiecocktail |
| BMP4 | R&D Systems | 5020-BP-010 | Differentiatiecocktail |
| Dexamethasone | Sigma | D1756 | Differentiatiecocktail |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Rosiglitazone | Cayman | 71742 | Differentiatiecocktail |
| TNFα | R&D Systems | 210-TA-005 | |
| 3. Evaluatie van de insulinesignaleringsroute door middel van western blot | |||
| Anti-beta tubulin antilichaam | Abcam | ab6046 | |
| Bromofenolblauw | BioRad | 161-0404 | Laemmli buffer |
| EDTA | Sigma | E5134 | RIPA buffer |
| EGTA | Sigma | E4378 | RIPA buffer |
| FluorChem E systeem | ProteinSimple | ||
| Glycerol | Sigma | G6279 | Laemmli buffer |
| Glycine | Sigma | G7126 | Lopen en Overdracht buffer |
| Igepal | Sigma | I3021 | RIPA buffer |
| 2- mercaptoethanol | Sigma | M3148 | Laemmli buffer |
| Methanol | JT Baker | 907007 | Overdracht buffer |
| NaCl | JT Baker | 3624-05 | TBS-T |
| NaF | Sigma | 77F-0379 | RIPA buffer |
| NaOH | JT Baker | 3722-19 | |
| Na4P2O7 | Sigma | 114F-0762 | RIPA buffer |
| Na3VO4 | Sigma | S6508 | RIPA buffer |
| Nitrocellulose membraan | BioRad | 1620112 | |
| Vetvrije droge melk | BioRad | 1706404 | Blocking solution |
| Voorbehandelde eiwitstandaard | BioRad | 1610395 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340-5ML | |
| Peroxidase AffiniPure Ezel Anti-Konijn IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-035-132 | |
| Phospho- Insulin Receptor β | Cell signaling | 3024 | |
| Phospho-Akt (Ser473) Antilichaam | Cell signaling | 9271 | |
| Phospho-IRS1 (Tyr608) antilichaam | Millipore | 9432 | |
| Saccharose | JT Baker | 407205 | RIPA buffer |
| SDS | BioRad | 1610302 | Lopen en laemmli buffer |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substraat | Thermo Scientific | 34577 | |
| Tris-base | Promega | H5135 | Lopen, overdracht en laemmli buffer |
| Tris-HCl | JT Baker | 4103-02 | RIPA buffer - TBS |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | TBS-T |
Referenties
- Elmus, G. B. Insulin signaling and insulin resistance. Journal of Investigative Medicine. 61 (1), 11-14 (2013).
- Kasuga, M., Zick, Y., Blithe, D. L., Crettaz, M., Kahn, C. R. Insulin stimulates tyrosine phosphorylation of the insulin receptor in a cell-free system. ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
