Methodenartikel

Fabricage en karakterisering van laag-voor-laag Janus Base Nano-Matrix om kraakbeenregeneratie te bevorderen

DOI:

10.3791/63984

⸱

6 juli 2022

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Connecticut

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft de assemblage van een laag-voor-laag Janus base nano-matrix (JBNm) scaffold door janus base nanotubes (JBNts), matrilin-3 en Transforming Growth Factor Beta-1 (TGF-β1) sequentieel toe te voegen. De JBNm werd gefabriceerd en gekarakteriseerd; bovendien vertoonde het een uitstekende bioactiviteit, waardoor celfuncties zoals adhesie, proliferatie en differentiatie werden aangemoedigd.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Verschillende biomateriaalsteigers zijn ontwikkeld om celhechting en proliferatie te begeleiden in de hoop specifieke functies voor in vitro en in vivo gebruik te bevorderen. De toevoeging van groeifactoren aan deze biomateriaalsteigers wordt over het algemeen gedaan om een optimale celkweekomgeving te bieden, celdifferentiatie en de daaropvolgende functies te bemiddelen. De groeifactoren in een conventionele biomateriaalsteiger zijn echter meestal ontworpen om vrij te komen bij implantatie, wat kan leiden tot onbedoelde bijwerkingen op het omliggende weefsel of de omliggende cellen. Hier heeft de op DNA geïnspireerde Janus base nano-matrix (JBNm) met succes een zeer gelokaliseerde micro-omgeving bereikt met een laag-voor-laag structuur voor zelfvoorzienende kraakbeenweefselconstructies. JBNms zijn zelf geassembleerd uit Janus base nanobuisjes (JBNts), matriline-3, en transformerende groeifactor beta-1 (TGF-β1) via bioaffiniteit. De JBNm werd geassembleerd in een TGF-β1:matrilin-3:JBNt-verhouding van 1:4:10, omdat dit de bepaalde verhouding was waarbij een goede montage in de laag-voor-laag structuur kon plaatsvinden. Eerst werd de TGF-β1-oplossing toegevoegd aan de matriline-3-oplossing. Vervolgens werd dit mengsel meerdere keren gepipetteerd om voldoende homogeniteit te garanderen voordat de JBNt-oplossing werd toegevoegd. Deze vormde de laag-voor-laag JBNm, na meerdere malen opnieuw pipetteren. Een verscheidenheid aan experimenten werd uitgevoerd om de laag-voor-laag JBNm-structuur te karakteriseren, JBNts alleen, matrilin-3 alleen en TGF-β1 alleen. De vorming van JBNm werd bestudeerd met UV-Vis absorptiespectra en de structuur van de JBNm werd waargenomen met transmissie-elektronenmicroscopie (TEM). Omdat de innovatieve laag-voor-laag JBNm-steiger op moleculaire schaal wordt gevormd, kan de fluorescerende kleurstof-gelabelde JBNm worden waargenomen. De TGF-β1 is beperkt tot de binnenste laag van de injecteerbare JBNm, die de afgifte van groeifactoren naar omliggende gebieden kan voorkomen, gelokaliseerde chondrogenese kan bevorderen en een anti-hypertrofische micro-omgeving kan bevorderen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Steigers in tissue engineering spelen een vitale rol bij het bieden van structurele ondersteuning voor celaanhechting en daaropvolgende weefselontwikkeling1. Doorgaans zijn conventionele weefselconstructies zonder steigers afhankelijk van de celkweekomgeving en toegevoegde groeifactoren om celdifferentiatie te bemiddelen. Bovendien is deze toevoeging van bioactieve moleculen aan steigers vaak de voorkeursbenadering bij het begeleiden van celdifferentiatie en functie 2,3. Sommige steigers kunnen de biochemische micro-omgeving van inheemse weefsels onafhankelijk nabootsen, terwijl andere de celfuncties rechtstreeks kunnen beïnvloeden via groeifactoren. Onderzoekers komen echter vaak uitdagingen tegen bij het selecteren van steigers die de celhechting, groei en differentiatie positief kunnen beïnvloeden, terwijl ze optimale structurele ondersteuning en stabiliteit bieden gedurende een lange periode 4,5. De bioactieve moleculen zijn vaak losjes gebonden aan de steiger, wat leidt tot een snelle afgifte van deze eiwitten bij implantatie, wat resulteert in hun afgifte op ongewenste locaties. Dit culmineert in bijwerkingen op weefsels of cellen die niet opzettelijk zijn gericht 6,7.

Steigers zijn meestal gemaakt van polymere materialen. De Janus base nano-matrix (JBNm) is een biomimetisch steigerplatform gemaakt met een nieuwe laag-voor-laag methode voor zelfvoorzienend kraakbeenweefsel construct8. Deze nieuwe DNA-geïnspireerde nanobuisjes hebben de naam Janus base nanotubes (JBNts) gekregen, omdat ze de structuur en oppervlaktechemie van collageen in de extracellulaire matrix (ECM) goed nabootsen. Met de toevoeging van bioactieve moleculen, zoals matriline-3 en Transforming Growth Factor Beta-1 (TGF-β1), kan de JBNm een optimale micro-omgeving creëren die vervolgens de gewenste cel- en weefselfunctionaliteit kan stimuleren9.

JBNts zijn nieuwe nanobuisjes afgeleid van synthetische versies van de nucleobase adenine en thymine. De JBNts worden gevormd door zelfassemblage10; zes synthetische nucleobasen binden zich om een ring te vormen, en deze ringen ondergaan π-π stapelingsinteracties om een nanobuisje van 200-300 μm in lengte11 te creëren. Deze nanobuisjes zijn structureel vergelijkbaar met collageeneiwitten; door een aspect van de inheemse kraakbeenmicro-omgeving na te bootsen, is aangetoond dat JBNts een gunstige hechtingsplaats bieden voor chondrocyten en menselijke mesenchymale stamcellen (hMSCs)11,12,13,14. Omdat de nanobuisjes zelfassemblage ondergaan en geen enkele vorm van initiator nodig hebben (zoals UV-licht), vertonen ze een opwindend potentieel als een injecteerbare steiger voor moeilijk bereikbare defectgebieden15.

Matrilin-3 is een structureel extracellulair matrixeiwit dat voorkomt in kraakbeen. Dit eiwit speelt een belangrijke rol bij chondrogenese en een goede kraakbeenfunctie16,17. Onlangs is het opgenomen in biomateriaalsteigers, wat chondrogenese zonder hypertrofie bevordert 9,18,19. Door dit eiwit in het JBNm op te nemen, worden kraakbeencellen aangetrokken door een stellage die vergelijkbare componenten bevat als die van de oorspronkelijke micro-omgeving. Bovendien is aangetoond dat matriline-3 nodig is voor een goede TGF-β1-signalering binnen chondrocyten20. Groeifactoren functioneren als signaalmoleculen, die specifieke groei van een bepaalde cel of weefsel veroorzaken. Om een optimale kraakbeenregeneratie te bereiken, zijn matriline-3 en TGF-β1 dus essentiële componenten binnen de JBNm. De toevoeging van TGF-β1 aan de laag-voor-laag steiger kan de kraakbeenregeneratie in een weefselconstructie verder bevorderen. TGF-β1 is een groeifactor die wordt gebruikt om het genezingsproces van osteochondrale defecten aan te moedigen, chondrocyten en hMSC-proliferatie en differentiatiete stimuleren 21,22. TGF-β1 speelt dus een sleutelrol in de kraakbeenregeneratie JBNm (J/T/M JBNm)23 en stimuleert een goede groei, vooral wanneer deze gelokaliseerd is in de JBNm-lagen.

Zoals eerder vermeld, worden groeifactoren meestal aan de buitenkant van steigers geassembleerd zonder specifieke inbouwmethoden. Hier, met de nauwkeurig ontworpen nano-architectuur van de biomaterialen, werd de JBNm ontwikkeld voor specifieke targeting van beoogde cellen en weefsels. De JBNm bestaat uit TGF-β1 geplakt op JBNt oppervlakken in de binnenste laag en matrilin-3 geplakt op JBNt oppervlakken in de buitenste laag24,25. De opname van TGF-β1 in de binnenste laag van de laag-voor-laag structuur zorgt voor een sterk gelokaliseerde micro-omgeving langs de JBNm-vezels, waardoor een homeostatisch weefselconstruct ontstaat met een veel langzamere afgifte van het eiwit12. De injecteerbaarheid van de JBNm maakt het een ideaal kraakbeenweefselconstruct voor verschillende toekomstige biomateriaaltoepassingen26.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Synthese van JBNts

  1. Bereid het JBNt-monomeer voor met behulp van eerder gepubliceerde methoden, waarbij de synthese van een verscheidenheid aan verbindingenbetrokken is 12.
  2. Zuiver ruw JBNt monomeer nadat het is gesynthetiseerd met high-performance vloeistofchromatografie (HPLC) met behulp van een omgekeerde fasekolom. Gebruik oplosmiddel A: 100% water, oplosmiddel B: 100% acetonitril en oplosmiddel C: HCl wateroplossing met pH = 1. Gebruik een debiet van 3 ml/min. Verzamel de grootste piek verkregen in de HPLC op 7,2 min.

2. Fabricage voor JBNt /Matn1 / TGF-β1 (Video 1)

OPMERKING: Video 1 laat zien dat de JBNm een injecteerbare vaste stof is die wordt gevormd in een fysiologische omgeving (wateroplossing, geen UV-licht, geen chemische additieven en geen verwarming), die ook biologisch geïnspireerd is.

  1. Voeg 8 μL 1 mg/ml TGF-β1 gesuspendeerd in H2O toe aan 32 μL van 1 mg/ml matriline-3 gesuspendeerd in H2O. Pipet om een goede menging van deze eiwitten te garanderen.
  2. Voeg 80 μL 1 mg/ml JBNts gesuspendeerd in H2O toe aan de TGF-β1/matriline-3 oplossing. Pipetteer herhaaldelijk om een goede menging te garanderen. De aanwezigheid van witte vlokjes kan onmiddellijk na de toevoeging van JBNts worden waargenomen, wat wijst op de vorming van de JBNm (video 1).

3. Observatie van monsters met ultraviolet-zichtbare (UV-Vis) absorptie

OPMERKING: De UV-Vis absorptiespectra werden bestudeerd om de assemblage van de JBNm te karakteriseren. Deze meting werd geanalyseerd voor vier categorieën: JBNts alleen, matrilin-3 alleen, TGF-β1 alleen en de volledige laag-voor-laag JBNm, bestaande uit alle drie de delen. Alle aanvangsconcentraties worden gesuspendeerd in H2O.

  1. Voeg voor de JBNt-groep 5 μL van 1 mg/ml JBNts toe aan 50 μL H2O om een oplossing van 90,9 μg/ml te maken.
  2. Voeg voor de matriline-3-groep 40 μL van 10 μg/ml matriline-3 toe aan 15 μL H2O om een oplossing van 7,3 μg/ml te maken.
  3. Voeg voor de TGF-β1-groep 10 μL van 10 μg/ml TGF-β1 toe aan 45 μL H2O om een oplossing van 1,8 μg/ml te maken.
  4. Voeg voor de JBNm-groep 40 μL van 10 μg/ml matriline-3 toe aan 10 μL van 10 μg/ml TGF-β1. Roer om een goede menging te garanderen en voeg vervolgens 5 μL 1 mg / ml JBNts toe aan de oplossing, waarbij u herhaaldelijk pipetteert om het monster te mengen.
  5. Meet met behulp van een spectrofotometer het absorptiespectrum van elke groep.

4. Zeta-potentiaalmeting van monsters

OPMERKING: Het zeta-potentieel werd geanalyseerd om beter te voorspellen hoe de JBNm zou interageren met in vivo weefsel. Drie groepen werden gemeten: matrilin-3 alleen, matrilin-3 met TGF-β1 en de volledige laag-voor-laag JBNm.

  1. Voeg voor de matriline-3-groep 160 μL 10 mg/ml matriline-3 toe aan 640 μL H2O om een oplossing van 800 μL te maken.
  2. Voeg voor de matriline-3/TGF-β1-verbinding 160 μL van 10 μg/ml matriline-3 toe aan 40 μL van 10 μg/ml TGF-β1. Pipetteer herhaaldelijk om een goede homogeniteit te garanderen. Voeg het vervolgens toe aan 600 μL H2O, wat resulteert in een oplossing van 800 μL.
  3. Voeg voor de JBNm-groep 160 μL van 10 μg/ml matriline-3 toe aan 40 μL van 10 μg/ml TGF-β1. Pipetteer meerdere keren om de eiwitten te mengen. Voeg vervolgens 20 μL 1 mg/ml JBNts toe aan de oplossing en pipet om homogeniteit te garanderen. Voeg ten slotte de JBNm-oplossing toe aan 580 μL H2O om een oplossing van 800 μL te produceren.
  4. Meet de zeta-potentialwaarden voor de drie groepen.

5. Bereiding van JBNt/matrilin-3 nanomatrix voor transmissie-elektronenmicroscopie (TEM)

OPMERKING: TEM-karakterisering wordt uitgevoerd om de morfologie van JBNts en JBNm te karakteriseren.

  1. Plaats twee roosters in een plasmareiniger om de roosters goed te reinigen vóór de negatieve kleuring van de JBNts en JBNm volgens de gepubliceerde protocollen en protocollen van de fabrikant12.
  2. Maak een JBNt-oplossing van 200 μg/ml door 10 μL 1 mg/ml JBNts te mengen met 40 μL gedestilleerd water.
  3. Meng 30 μL van 100 μg/ml matriline-3 met 20 μL van 100 μg/ml TGF-β1 en pipet meerdere keren. Voeg 10 μL 1 mg/ml JBNts toe aan het matriline-3/TGF-β1 mengsel om het JBNm-monster te bereiden. Nogmaals, pipetteer herhaaldelijk.
  4. Voeg 3 μL jbnt-oplossing (200 μg/ml) en 3 μl JBNm-oplossing toe aan afzonderlijke roosters en laat ze 2 minuten staan.
  5. Spoel elk rooster af met 100 μL uranylacetaatoplossing (0,5%). Gebruik filterpapier om de overtollige oplossing te verwijderen en de roosters aan de lucht te laten drogen.
  6. Gebruik een transmissie-elektronenmicroscoop om de monsters goed te observeren en te karakteriseren, zoals eerder gepubliceerd11,12.

6. Absorptiespectrameting van fluorescerende eiwitten

OPMERKING: De structuur van JBNm wordt geverifieerd door de structuren van de JBNm te observeren met absorptiespectrale analyse.

  1. Label de TGF-β1 met behulp van een eiwitetiketteringskit volgens de instructies van de fabrikant. Voeg 20 μL van 20 μg/ml met het label TGF-β1 toe aan 25 μL H2O om een testoplossing van 8,9 μg/ml te maken.
  2. Label de matrilin-3 met behulp van een aparte labeling kit. Voeg 20 μL van 80 μg/ml matriline-3 toe aan 25 μL H2O om een testoplossing van 36 μg/ml te maken.
    OPMERKING: De fluorescerende kleurstofetikettering van de TGF-β1 resulteerde in een eindconcentratie van 20 μg / ml, terwijl de etikettering van het matriline-3 resulteerde in een eindconcentratie van 80 μg / ml.
  3. Meng 20 μL van 80 μg/ml gelabeld matriline-3 met 20 μL van 20 μg/ml gelabeld TGF-β1 en 5 μL H2O, wat resulteert in een gelabelde TGF-β1/matrilin-3-verbinding. Pipetteer het mengsel meerdere keren om te mengen.
  4. Voeg 5 μL 1 mg/ml JBNts toe aan 40 μL H2O, wat resulteert in een oplossing van 111 μg/ml.
  5. Voeg 20 μL van 20 μg/ml met het label TGF-β1 toe aan 20 μL van 80 μg/ml met het label matriline-3 en pipet meerdere keren. Voeg 5 μL 1 mg/ml JBNts toe aan de gelabelde TGF-β1/matriline-3 oplossing en pipetteer herhaaldelijk om de verbinding goed te mengen.
    OPMERKING: De uiteindelijke concentraties van de JBNt, gelabeld TGF-β1, en gelabelde matriline-3 monsters waren respectievelijk 111 μg / ml, 8,9 μg / ml en 36 μg / ml.
  6. Breng elke monstergroep (d.w.z. gelabeld TGF-β1 (stap 6.1), gelabeld matriline-3 (stap 6.2), gelabeld TGF-β1/matrilin-3 (stap 6.3), JBNts (stap 6.4), JBNm (stap 6.5)) over naar hun eigen put van een zwarte 384-well plaat.
  7. Laad de zwarte 384-well plaat in een multi-mode microplaatlezer en voer metingen uit bij excitatiegolflengten van 488 nm en 555 nm volgens het protocol van de fabrikant.

7. In vitro biologische functietest

  1. Celhechtingstest op voorgecoate dekglaskamers
    1. Bereid twee kamerdekglazen met vijf groepen monsters voor, omdat voor elk celtype één coverglass wordt gebruikt.
    2. Voeg 1,25 μL 1 mg/ml JBNts toe aan 198,75 μL gedestilleerd water, wat resulteert in een oplossing van 6,25 μg/ml.
    3. Voeg 10 μL matriline-3 toe aan 10 μL matriline-3 tot 190 μL gedestilleerd water, wat resulteert in een 0,5 μg/mlolution.
    4. Voeg 2,5 μL van 10 μg/ml TGF-β1 toe aan 197,5 μg/mLof gedestilleerd water, wat resulteert in een 0,125 μg/mloplossing.
    5. Voeg voor de JBNm-groep 10 μL van 10 μg/ml matriline-3 toe aan 2,5 μL van 10 μg/mLTGF-β1 en pipetteer herhaaldelijk. Voeg 1,25 μL JBNts met een concentratie van 1 mg/ml toe aan de mengseloplossing en pipet. Voeg ten slotte 186,25 μL gedestilleerd water toe om te resulteren in een JBNm-oplossing van 200 μL.
      1. Gebruik voor de controlegroep 200 μL gedestilleerd water.
    6. Voeg elke monstergroep toe aan hun eigen put van een no. 1.5 kamerzeil. Plaats het afdekglas gedurende 1 uur in een vriezer van -80 °C en vriesdroog het vervolgens met een lyofilisatorinstrument.
    7. Zaai menselijke mesenchymale stamcellen (hMSCs) en menselijke chondrocytencellen (10.000 cellen per put) in elk putje van de voorbereide kamerdekglazen.
    8. Incubeer de twee afdekglazen gedurende 4 uur in een couveuse van 37 °C. Aspirateer vervolgens het celkweekmedium en spoel tweemaal met PBS.
    9. Fix cellen met 4% paraformaldehyde gedurende 5 minuten en verwijder en spoel monsters vervolgens met PBS. Spoel het monster een tweede keer af om de 4% paraformaldehyde volledig te verwijderen.
    10. Incubeer cellen met 100 μL van 0,1% Triton-X gedurende 10 minuten en was met PBS. Voeg 100 μL van 0,165 μM rhodamine-falloidine toe aan elk putje. Wacht 30 minuten en was dan opnieuw met PBS.
    11. Voeg 0,1 μg /ml DAPI toe aan elk putje om de kernen te kleuren. Wacht 5 minuten en spoel de putjes twee keer af met PBS.
    12. Gebruik een spectrale confocale microscoop om celmorfologie te observeren en fluorescerende beelden vast te leggen.
    13. Analyseer verder het celnummer en de morfologie met behulp van beeldverwerkingssoftware. Open de software en laad de afbeeldingen. Voeg een schaalbalk toe en kalibreer de software. Tel het aantal cellen in een bepaald gebied voor elk monster. Gebruik vervolgens het meetinstrument om gegevens over celmorfologie voor elk monster te verzamelen.
  2. Celproliferatie
    1. Bereid drie onbehandelde platen met 96 putten voor en voeg vijf groepen monsters aan elk toe.
      1. Voeg voor de JBNt-groep 3,75 μL 1 mg/ml JBNts toe aan 596,25 μL gedestilleerd water, wat resulteert in een JBNt-oplossing van 600 μL met een concentratie van 6,25 μg/ml.
      2. Voeg voor de TGF-β1-groep 7,5 μL van 10 μg/ml TGF-β1 toe aan 592,5 μL gedestilleerd water, wat resulteert in een testoplossing van 0,125 μg/ml.
      3. Voeg voor de matriline-3-groep 30 μL 10 μg/ml matriline-3 toe aan 570 μL gedestilleerd water, wat resulteert in een testoplossing van 0,5 μg/ml.
      4. Meng voor de JBNm-groep 7,5 μL van 10 μg/ml TGF-β1 met 30 μL van 10 μg/ml matriline-3 en pipet meerdere keren, gevolgd door toevoeging van 3,75 μL 1 mg/ml JBNts aan de oplossing.
      5. Verdun JBNm-oplossing met 558,75 μL gedestilleerd water om de eindconcentraties van respectievelijk 6,25 μg/ml, 0,125 μg/ml en 0,5 μg/ml te verkrijgen voor JBNt-, TGF-β1- en matriline-3-monsters.
      6. Gebruik voor de controlegroep 600 μL gedestilleerd water.
    2. Verdeel elke monstergroep in zes putjes (100 μL monster per putje).
    3. Plaats de drie platen met alle monsters gedurende 1 uur in een vriezer van -80 °C en vriesdroog vervolgens met een lyofiliseerinstrument.
    4. Zaai hMSCs op deze platen en ontvang elk een celsuspensie van 100 μL (per put) met 5.000 cellen. Incubeer de drie platen bij 37 °C gedurende 1 dag, 3 dagen of 5 dagen bij 5% CO2.
    5. Voeg 10 μL CCK-8-oplossing toe aan elk putje met de cellen en incubeer bij 37 °C gedurende nog eens 2 uur.
    6. Meet de absorptiewaarden van elke put met multi-mode microplaatlezers bij 450 nm.
    7. Zaai een bekende gradiënt van hMSCs op een 96-well plaat en incubeer gedurende 4 uur. Gebruik de CCK-8-test om de absorptiewaarden van het bekende aantal cellen te meten en een standaardcurve te genereren.
    8. Bereken de celproliferatie met behulp van de absorptiestandaardcurve.
  3. Stabiliteitstest
    OPMERKING: Een humane TGF-β1 gerichte ELISA-kit werd gebruikt om het percentage afgifte van TGF-β1 uit de JBNm in een agarose hydrogel te bepalen.
    1. Bereid 2% agarose door 400 mg agarosepoeder toe te voegen aan 20 ml PBS en het te verwarmen tot 100 °C om het agarosepoeder volledig op te lossen.
    2. Bereid de JBNm in de afgekoelde 2% agarose hydrogel.
      1. Combineer 10 μL van 10 μg/ml TGF-β1, 40 μL van 10 μg/ml matriline-3, 5 μL van 1 mg/ml JBNts en 195 μL PBS. Meng deze oplossing met 250 μL van 2% agarose, waardoor de JBNm hydrogel ontstaat.
    3. Voeg 500 μL PBS toe, gebruik het als een release-oplossing en zorg ervoor dat het elke 3 dagen wordt vervangen. Bewaar elke vrijgegeven oplossing en laat het monster 15 dagen staan.
    4. Gebruik een ELISA-kit om elk van de vastgelegde release-oplossingen te testen, door de instructies van de fabrikant te volgen.
      OPMERKING: Door de hoeveelheid TGF-β1 die in de PBS vrijkomt af te trekken van de theoretische belastingswaarde van 100%, kan de resterende hoeveelheid TGF-β1 worden bepaald.
  4. Celdifferentiatie analyse met PCR26.
    1. Bereid zeven groepen monsters met elk monster dat 20 μL celsuspensie (4 x 104 cellen), 30 μL van de specifieke oplossing (of PBS, afhankelijk van de monstergroep) en 50 μL 2 wt % agarose bevat.
      1. Voeg voor de TGF-β1-groep 5 μL van 10 μg/ml TGF-β1 toe aan 25 μL PBS, wat resulteert in een oplossing van 1,6 μg/ml.
      2. Voeg voor de matriline-3-groep 20 μL van 10 μg/ml matriline-3 toe aan 10 μL PBS, wat resulteert in een oplossing van 6,7 μg/ml.
      3. Voeg voor de JBNt-groep 2,5 μL 1 mg/ml JBNts toe aan 27,5 μL PBS, wat resulteert in een oplossing van 83,3 μg/ml.
      4. Voeg voor de J/T/M JBNm-groep 10 μL van 10 μg/ml matriline-3 toe aan 5 μL van 10 μg/ml TGF-β1 en pipetteer op en neer om de oplossing te mengen. Voeg vervolgens 2,5 μL 1 mg/ml JBNts toe en pipetteer opnieuw. Verdun ten slotte met 2,5 μL PBS.
      5. Gebruik voor elke controlegroep 30 μL PBS als monster.
    2. Voeg 0,5 ml celkweekmedium toe aan elke put en zorg ervoor dat u deze om de 3 dagen vervangt.
      1. Gebruik voor de positieve controlegroep een in de handel verkrijgbaar hMSC chondrogeen medium met toegevoegde TGF-β1. Deze extra TGF-β1 is gelijk aan de hoeveelheid in zowel de TGF-β1- als de J/T/M JBNm-groep.
      2. Gebruik voor een van de negatieve controlegroepen een commercieel hMSC chondrogeen medium dat geen TGF-β1 bevat. Gebruik voor de andere negatieve controlegroep een DMEM-celkweekmedium dat 10% foetaal runderserum (FBS) bevat.
      3. Gebruik voor elke andere groep een commercieel hMSC chondrogene celkweekmedium zonder TGF-β1.
    3. Kweek de monsters gedurende 15 dagen.
    4. Extraheer het RNA van de monsters en voer PCR uit om de differentiatie van de monsters te bestuderen zoals eerder beschreven26.
  5. Immunostaining voor type X collageenexpressietest
    1. Bereid zeven monsters op basis van agarose op dezelfde manier als de celdifferentiatie met de sectie PCR-methode (stap 7.4).
    2. Kweek de monsters gedurende 15 dagen.
    3. Bevestig de monsters met 4% formaldehyde gedurende 1 dag, week 's nachts in 30% sucrose-oplossing en vries vervolgens een nacht in bij -80 °C met vloeibare stikstof. Bevestig de monsters met behulp van het optimale snijtemperatuurverbindingsreagens (OCT), een mengsel van in water oplosbare glycolen en harsen, bij -10 °C.
    4. Gebruik een cryostaatmicrotoom om 20 μm dikke bevroren secties van elk monster te verkrijgen.
    5. Kleur elke sectie met een Anti-Collageen X-antilichaam met 1:800 verdunning en een fluorescerend labelend secundair antilichaam verdund met PBS, volgens de protocollen van de fabrikant.
    6. Observeer elke sectie met een confocale microscoop, met behulp van een excitatie van 488 nm en een vergroting van 40x op het oculair.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Volgens het protocol werden JBNts met succes gesynthetiseerd en gekarakteriseerd met UV-Vis-absorptie en TEM. De JBNm is een injecteerbare vaste steiger die een snel biomimetisch proces ondergaat. Nadat JBNts waren toegevoegd aan een mengsel van TGF-β1/matrilin-3-oplossing in een fysiologische omgeving, werd een stevige witgaassteiger gevormd die de succesvolle assemblage van JBNm aangeeft, zoals te zien is in figuur 1. Dit werd aangetoond in de karakteriseringsmethoden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het doel van deze studie is om een biomimetisch steigerplatform te ontwikkelen, de JBNm, om de beperkingen van conventionele weefselconstructies te overwinnen die afhankelijk zijn van celkweekomgevingen om celdifferentiatie te bemiddelen. De JBNm is een laag-voor-laag structuur scaffold voor een zelfvoorzienend kraakbeenweefsel construct. Het innovatieve ontwerp is gebaseerd op nieuwe DNA-geïnspireerde nanomaterialen, de JBNts. De JBNm, samengesteld uit JBNts30, TGF-β1 en matrilin-3, wordt geassem...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dr. Yupeng Chen is mede-oprichter van Eascra Biotech, Inc. en NanoDe Therapeutics, Inc.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk wordt ondersteund door NIH-subsidies 7R01AR072027 en 7R03AR069383, NSF Career Award 1905785, NSF 2025362 en de Universiteit van Connecticut. Dit werk wordt ook gedeeltelijk ondersteund door NIH-subsidie S10OD016435.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
10 % Normal Goat SerumThermo Fisher50062ZAgent gebruikt om niet-specifieke antilichaambindingsacties tijdens kleuring te blokkeren.
24-well plateCorning07-200-74024-well plate gebruikt voor vergelijkende celcultuur.
384-Well Black Untreated PlateThermo Fisher262260384-well plate gebruikt voor absorptiemetingen.
8-well chambered coverglassThermo Fisher155409PK8-well coverglass gebruikt voor vergelijkende celcultuur.
96-well flat bottomCorning07-200-9196-well plate gebruikt voor vergelijkende celcultuur.
96-Well Plate non- treatedThermo Fisher26089596-well plate gebruikt voor vergelijkende celcultuur en analyse.
Agarose GelSigma-AldrichA9539Hydrogel gebruikt voor celcultuur.
Agarose GelSigma AldrichA9539Hydrogel gebruikt als omgeving voor celcultuur.
Alexa Fluor Microscale Protein Labeling KitThermo FisherA30006 (488) en A30007 (555)Fluorescente kleurstof gebruikt om eiwitten te labelen.
Anti-Collagen X AntibodyThermo Fisher41-9771-82Antilichaam gebruikt om collageen-X te kleuren.
Bio-Rad PCR MachineBio-RadApparatuur gebruikt om PCR op monsters uit te voeren.
C28/I2 Chondrocyte Cell LineCellen gebruikt om proliferatieve capaciteiten van verschillende monsters te analyseren.
Cell Counting Kit 8Milipore Sigma96992Celproliferatie assay.
Cell ProfilerBroad InstituteSoftware gebruikt om celafbeeldingen te analyseren.
Cryostat MicrotomeApparatuur gebruikt om dunne segmenten van monsters te produceren voor gebruik in kleuring en microscopie.
DAPIInvitrogenD1306Blauwe fluorescerende kleurstof die bindt aan adenine-thymine DNA-regio's.
Disposable cuvettesFISHER Scientific14-955-128Container gebruikt voor spectrofotometrie.
DMEM Cell Culture MediumThermo Fisher10566032Media gebruikt om cellulaire groei te ondersteunen.
Fetal Bovine SerumGIBCOA4766801Serum gebruikt in celcultuurmedium om celgroei te ondersteunen.
Fluoromount-G Mounting MediumThermo Fisher00-4958-02Oplossing gebruikt om dia's te monteren voor immunokleuring.
FormaldehydeVerbinding gebruikt om monsters te fixeren voorafgaand aan microtomie.
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary AntibodyThermo FisherA16110Antilichaam gebruikt voor eiwitkleuring.
Human Mesenchymal Stem CellsLONZAPT-2501Cellen gebruikt om differentiatiecapaciteiten van verschillende monsters te analyseren.
Human Mesenchymal Stem Chondrogenic MediumLONZAPT-3003Cellmedium gebruikt om chondrogene differentiatie te bevorderen.
ImageJNational Institutes of HealthBeeldanalysesoftware gebruikt in combinatie met microscopie.
itaq Universal SYBR Green One-Step KitBioRad1725150Kit gebruikt voor PCR.
Janus-base nanotubes (JBNts)Nanobuis gemaakt van synthetische nucleobasen om te dienen als celscaffoldingtool.
LaB6 20-120 kV Transmission Electronic MicroscopeTecnaiApparatuur gebruikt om transmissie-elektronenmicroscopie op een monster uit te voeren.
MATLABMathWorksStatistisch software voor modellering en gegevensanalyse.
Matrilin-3Fisher Scientific3017MN050Structureel eiwit dat wordt gebruikt als hechtingsplaatsen voor chondrocyten.
NanoDrop SpectrophotometerThermo FisherApparatuur gebruikt om absorptiewaarden van een monster te meten.
Nikon A1R Spectral Confocal MicroscopeNikonA1R HD25Confocale microscoop gebruikt om monsters te analyseren.
Number 1.5 Chamber CoverglassThermo Fisher152250Omgeving voor steriele celcultuur en beeldvorming.
Optimal Cutting Temperature Compound ReagentVerbinding gebruikt om cellen in te bedden voorafgaand aan microtomie.
ParaformaldehydeThermo ScientificAAJ19943K2Verbinding gebruikt om cellen te fixeren.
PDC-32G Plasma CleanerHarrick PlasmaReiniger gebruikt om roosters voor te bereiden voor transmissie-elektronenmicroscopie.
penicillin-streptomycinGIBCO15-140-148Antibiotisch middel gebruikt om bacteriegroei tijdens celcultuur te ontmoedigen.
Phosphate Buffered SalineThermo Fisher10010023Oplossing gebruikt om celmedium te wassen en als buffer te dienen tijdens experimenten.
Rhodamine-phalloidinInvitrogenR415F-Actin rood fluorescerende kleurstof.
Rneasy Plant Mini KitQIAGEN74904Kit gebruikt om monsters te filteren en te homogeniseren tijdens RNA-extractie.
Sucrose SolutionOplossing gebruikt om monsters te verwerken voorafgaand aan microtomie.
TGF beta-1 Human ELISA KitInvitrogenBMS249-4Assaykit gebruikt om de aanwezigheid van TGF-β1 in een monster te bepalen.
TGF-β1PEPROTECH100-21CGroeifactor gebruikt voor de stimulatie van chondrogene differentiatie en proliferatie.
Triton-XInvitrogenHFH10Verbinding gebruikt om cellen te lyseren die niet zijn gefixeerd tijdens het kleuringsproces.
TRIzol ReagentThermo Fisher15596026Reagens gebruikt om RNA te isoleren.
ZetaSizer Nano ZSMalvern PanalyticalApparatuur gebruikt om zetapotentiaalwaarden van een monster te meten.

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chan, B. P., Leong, K. W. Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue-specific considerations. European Spine Journal. 17, Suppl 4 467-479 (2008).
  2. Heo, D. N., et al. 3D bioprinting of carbohydrazide-modified gelatin into microparticle-suspended oxidized alginate for the fabrication of complex-shaped tissue constructs. ACS Applied Material Interfaces. 12 (18), 20295-20306 (2020).
  3. Almeida, H. V., et al. Anisotropic shape-memory alginate scaffolds functionalized with either type i or type ii collagen for cartilage tissue engineering. Tissue Engineering. Part A. 23 (1-2), 55-68 (2017).
  4. Vinatier, C., Guicheux, J. Cartilage tissue engineering: From biomaterials and stem cells to osteoarthritis treatments. Annals of Physical and Rehabilitation Medicine. 59 (3), 139-144 (2016).
  5. Filardo, G., Kon, E., Roffi, A., Di Martino, A., Marcacci, M. Scaffold-based repair for cartilage healing: a systematic review and technical note. Arthroscopy. 29 (1), 174-186 (2013).
  6. James, A. W., et al. A review of the clinical side effects of bone morphogenetic protein-2. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 22 (4), 284-297 (2016).
  7. Blaney Davidson, E. N., vander Kraan, P. M., vanden Berg, W. B. TGF-beta and osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 15 (6), 597-604 (2007).
  8. Chen, Y., Yang, K. Intra-articular drug delivery systems for arthritis treatment. Rheumatology Current Research. 2, 106(2012).
  9. Liu, Q., et al. Suppressing mesenchymal stem cell hypertrophy and endochondral ossification in 3D cartilage regeneration with nanofibrous poly(l-lactic acid) scaffold and matrilin-3. Acta Biomaterialia. 76, 29-38 (2018).
  10. Song, S., Chen, Y., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. Self-assembled rosette nanotubes for incorporating hydrophobic drugs in physiological environments. International Journal of Nanomedicine. 6, 101-107 (2011).
  11. Zhou, L., et al. Self-assembled biomimetic Nano-Matrix for stem cell anchorage. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 108 (4), 984-991 (2020).
  12. Zhou, L., Yau, A., Zhang, W., Chen, Y. Fabrication of a biomimetic nano-matrix with janus base nanotubes and fibronectin for stem cell adhesion. Journal of Visualized Experiments. (159), e61317(2020).
  13. Chen, Y., Song, S., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. Self-assembled rosette nanotubes encapsulate and slowly release dexamethasone. International Journal of Nanomedicine. 6, 1035-1044 (2011).
  14. Chen, Y., et al. Self-assembled rosette nanotube/hydrogel composites for cartilage tissue engineering. Tissue Engineering. Part C, Methods. 16 (6), 1233-1243 (2010).
  15. Yu, H., Chen, Y. Advanced biomedical techniques for gene delivery. Recent Patents on Biomedical Engineering (Discontinued). 5 (1), 23-28 (2012).
  16. Muttigi, M. S., Han, I., Park, H. K., Park, H., Lee, S. H. Matrilin-3 role in cartilage development and osteoarthritis). International Journal of Molecular Sciences. 17 (4), 590(2016).
  17. Pei, M., Luo, J., Chen, Q. Enhancing and maintaining chondrogenesis of synovial fibroblasts by cartilage extracellular matrix protein matrilins. Osteoarthritis Cartilage. 16 (9), 1110-1117 (2008).
  18. Bello, A. B., et al. Matrilin3/TGFbeta3 gelatin microparticles promote chondrogenesis, prevent hypertrophy, and induce paracrine release in MSC spheroid for disc regeneration. NPJ Regenerative Medicine. 6 (1), 50(2021).
  19. Muttigi, M. S., et al. Matrilin-3 codelivery with adipose-derived mesenchymal stem cells promotes articular cartilage regeneration in a rat osteochondral defect model. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (3), 667-675 (2018).
  20. Jayasuriya, C. T., et al. Matrilin-3 chondrodysplasia mutations cause attenuated chondrogenesis, premature hypertrophy and aberrant response to TGF-beta in chondroprogenitor cells. International Journal of Molecular Sciences. 15 (8), 14555-14573 (2014).
  21. Poniatowski, L. A., Wojdasiewicz, P., Gasik, R., Szukiewicz, D. Transforming growth factor Beta family: insight into the role of growth factors in regulation of fracture healing biology and potential clinical applications. Mediators of Inflammation. 2015, 137823(2015).
  22. Sun, Y., Lu, Y., Hu, Y., Ma, F., Chen, W. Induction of osteogenesis by bovine platelet transforming growth factor-beta (TGF-beta) in adult mouse femur. Chinese Medical Journal (English). 108 (12), 914-918 (1995).
  23. Sun, X., et al. Anti-miRNA oligonucleotide therapy for chondrosarcoma). Molecular Cancer Therapeutics. 18 (11), 2021-2029 (2019).
  24. Jayasuriya, C. T., Chen, Y., Liu, W., Chen, Q. The influence of tissue microenvironment on stem cell-based cartilage repair. Annals of the New York Academy of Sciences. 1383 (1), 21-33 (2016).
  25. Chen, Y., et al. Deficient mechanical activation of anabolic transcripts and post-traumatic cartilage degeneration in matrilin-1 knockout mice. PLoS One. 11 (6), 0156676(2016).
  26. Zhou, L., Zhang, W., Lee, J., Kuhn, L., Chen, Y. Controlled self-assembly of DNA-mimicking nanotubes to form a layer-by-layer scaffold for homeostatic tissue constructs. ACS Applied Material Interfaces. 13 (43), 51321-51332 (2021).
  27. Belluoccio, D., Schenker, T., Baici, A., Trueb, B. Characterization of human matrilin-3 (MATN3). Genomics. 53 (3), 391-394 (1998).
  28. Yau, A., Yu, H., Chen, Y. mRNA detection with fluorescence-base imaging techniques for arthritis diagnosis. Journal of Rheumatology Research. 1 (2), 39-46 (2019).
  29. Lee, J., Sands, I., Zhang, W., Zhou, L., Chen, Y. DNA-inspired nanomaterials for enhanced endosomal escape. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (19), (2021).
  30. Zhang, W., Chen, Y. Molecular engineering of DNA-inspired Janus base nanomaterials. Juniper Online Journal Material Science. 5 (4), 555670(2019).
  31. Yau, A., Sands, I., Chen, Y. Nano-scale surface modifications to advance current treatment options for cervical degenerative disc disease (CDDD). Journal of Orthopedic Research and Therapy. 4 (9), 1147(2019).
  32. Mello, M. A., Tuan, R. S. Effects of TGF-beta1 and triiodothyronine on cartilage maturation: in vitro analysis using long-term high-density micromass cultures of chick embryonic limb mesenchymal cells. Journal of Orthopaedic Research. 24 (11), 2095-2105 (2006).
  33. Shi, Y., Massague, J. Mechanisms of TGF-beta signaling from cell membrane to the nucleus. Cell. 113 (6), 685-700 (2003).
  34. Sands, I., Lee, J., Zhang, W., Chen, Y. RNA delivery via DNA-inspired janus base nanotubes for extracellular matrix penetration. MRS Advances. 5 (16), 815-823 (2020).
  35. Zhou, L., Rubin, L. E., Liu, C., Chen, Y. Short interfering RNA (siRNA)-based therapeutics for cartilage diseases. Regenerative Engineering and Translational Medicine. 7 (3), 283-290 (2020).
  36. Bi, H., et al. Deposition of PEG onto PMMA microchannel surface to minimize nonspecific adsorption. Lab on a Chip. 6 (6), 769-775 (2006).
  37. Chen, Y., Webster, T. J. Increased osteoblast functions in the presence of BMP-7 short peptides for nanostructured biomaterial applications. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 91 (1), 296-304 (2009).
  38. Sun, M., Lee, J., Chen, Y., Hoshino, K. Studies of nanoparticle delivery with in vitro bio-engineered microtissues. Bioactive Materials. 5 (4), 924-937 (2020).
  39. Yau, A., Lee, J., Chen, Y. Nanomaterials for protein delivery in anticancer applications. Pharmaceutics. 13 (2), 155(2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Laag voor laag scaffoldinkapseling van groeifactorenMatrilin 3 eiwitTGF beta1Janus base nanobuisjesceladhesietransmissie elektronenmicroscopiefluorescentiemicroscopie

Gerelateerde artikelen