Methodenartikel

Whole-Kidney Driedimensionale Kleuring met CUBIC

4.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/63986

⸱

18 juli 2022

 , 
1Division of Nephrology and Endocrinology, The University of Tokyo

In dit artikel

Samenvatting

Het huidige protocol beschrijft een weefselzuiveringsmethode en immunofluorescente kleuring met volledige mount voor driedimensionale (3D) nierbeeldvorming. Deze techniek kan macroscopische perspectieven bieden in de nierpathologie, wat leidt tot nieuwe biologische ontdekkingen.

Samenvatting

Hoewel conventionele pathologie veel informatie over de niermicrostructuur opleverde, was het moeilijk om de precieze structuur van bloedvaten, proximale tubuli, verzamelkanalen, glomeruli en sympathische zenuwen in de nier te kennen vanwege het gebrek aan driedimensionale (3D) informatie. Optische clearing is een goede strategie om deze grote hindernis te overwinnen. Meerdere cellen in een heel orgaan kunnen worden geanalyseerd met eencellige resolutie door weefselzuivering en 3D-beeldvormingstechniek te combineren. Celetiketteringsmethoden voor beeldvorming van hele organen blijven echter onderontwikkeld. In het bijzonder is het kleuren van organen in de hele montage een uitdaging vanwege de moeilijkheid bij de penetratie van antilichamen. Het huidige protocol ontwikkelde een nierkleuring van de hele muis voor 3D-beeldvorming met de CUBIC (Clear, Unobstructed Brain/ Body Imaging Cocktails and Computational analysis) weefselzuiveringsmethode. Het protocol heeft het mogelijk gemaakt om renale sympathische denervatie na ischemie-reperfusieletsel en glomerulomegalie in het vroege stadium van diabetische nierziekte vanuit een uitgebreid oogpunt te visualiseren. Deze techniek kan dus leiden tot nieuwe ontdekkingen in nieronderzoek door een macroscopisch perspectief te bieden.

Inleiding

De nier bestaat uit verschillende celpopulaties. Hoewel conventionele pathologie ons veel informatie geeft over de micro-omgeving van de nieren, is driedimensionale (3D) beeldvorming nodig om de intercellulaire overspraak tijdens de progressie van de nierziekte nauwkeurig te begrijpen. In het verleden moest een groot aantal seriële secties en beeldreconstructies worden uitgevoerd voor de 3D-beeldvorming van het hele orgaan1. Deze methode vergde echter te veel inspanning en had problemen op het gebied van reproduceerbaarheid.

Optische clearing is een goede strategie om deze horde te nemen 2,3. Weefselopaciteit is voornamelijk te wijten aan lichtverstrooiing en absorptie omdat elk orgaan bestaat uit verschillende stoffen, waaronder water, eiwitten en lipiden. De basisstrategie van weefselzuivering is dus het vervangen van water en lipiden in weefsels door refractieve index (RI) overeenkomende reagentia die dezelfde optische eigenschappen hebben als eiwitten4. Om een transparant monster te observeren, is een lichtblad fluorescerende microscopie nuttig5. Lichtplaten verlichten het transparante monster vanaf de zijkant en excitatiesignalen worden verkregen door de objectieflens in een verticale positie6. Deze microscopie verkrijgt in één beweging dwarsdoorsnede-informatie, die verschilt van de confocale of multifoton fluorescerende microscopie. Zo kan het snel z-stack-afbeeldingen verkrijgen met een laag niveau van fotobleaching.

Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational Analysis (CUBIC) is een van de weefselzuiveringsmethoden die beeldvorming van hele organen mogelijk maakt door fluorescentiemicroscopie 2,7,8. CUBIC en whole-mount immunofluorescente kleuring zijn in deze studie geoptimaliseerd om 3D-structuren van muizennieren te visualiseren 9,10,11. Met behulp van deze whole-mount kleuringsmethode wordt de verandering in renale sympathische zenuwen gevisualiseerd na ischemie-reperfusieletsel 9,10 en glomerulomegallie in het vroege stadium van diabetische nierziekte11, evenals bloedvaten, proximale tubuli en verzamelkanalen in een hele nier9.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle experimenten werden goedgekeurd door de Institutional Review Board van de Universiteit van Tokio. Alle dierprocedures werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de National Institutes of Health. Mannelijke C57BL/6NJcl muizen, 8 weken oud, werden gebruikt voor deze studie. De muizen werden verkregen uit commerciële bronnen (zie Tabel van Materialen).

1. Bereiding van dieren en nierfixatie

  1. Voer perfusiefixatie uit volgens de onderstaande stappen.
    1. Verdoof de muis door inhalatie van isofluraan (3%, 2,0 l/min) en intraperitoneale toediening van medetomidinehydrochloride (0,3 mg/kg), butorfanoltartraat (5 mg/kg) en midazolam (4 mg/kg) (zie materiaaltabel).
    2. Perfuseer het dier met 20 ml PBS (pH 7,4) en 30 ml 4% PFA in fosfaatbuffer (PB) door de linker ventrikel van het hart12.
  2. Voer de onderdompelingsfixatie uit net na de perfusiefixatie en nierbemonstering9.
    1. Dompel de nier onder in 4% PFA bij 4 °C gedurende nog eens 16 uur en was deze vervolgens 2 uur (driemaal) met PBS (9 ) (figuur 1).
      LET OP: Formaldehyde en paraformaldehyde zijn giftige irriterende stoffen. Behandel reagentia in een zuurkast met de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen.

2. Ontkleuring en delipidatie

  1. Bereid CUBIC-L voor ontkleuring en delipidatie bestaande uit 10 wt% Triton X-100 en 10 wt% N-buthyldiethanolamine (zie Materiaaltabel), volgens eerder gepubliceerde rapporten 4,8,9.
  2. Voer ontkleuring en delipidatie uit door CUBIC-L volgens de onderstaande stappen.
    1. Dompel de vaste nier onder in 7 ml van 50% (v / v) CUBIC-L (1: 1 mengsel van water en CUBIC-L) in een ronde bodembuis van 14 ml (zie materiaaltabel) met zacht schudden bij kamertemperatuur gedurende 6 uur (figuur 2A). Dompel het vervolgens onder in 7 ml CUBIC-L in een ronde bodembuis van 14 ml met zacht schudden bij 37 ° C gedurende 5 dagen.
    2. Ververs CUBIC-L elke dag tijdens dit proces. Was na het ontkleurings- en delipidatieproces de nier met PBS op kamertemperatuur gedurende 2 uur (driemaal)9 (figuur 1). Gebruik een doseerlepel voor het hanteren van monsters (figuur 2B).

3. Immunofluorescente kleuring in de hele montage

  1. Bereid de kleuringsbuffers voor.
    1. Bereid de kleuringsbuffer voor primaire antilichamen voor door 0,5% (v/v) Triton X-100, 0,5% caseïne in PBS en 0,05% natriumazide9 te mengen.
    2. Bereid de kleuringsbuffer voor secundaire antilichamen voor door 0,5% (v/v) Triton X-100, 0,1% caseïne in PBS en 0,05% natriumazide9 te mengen.
  2. Voer kleuring uit met primaire antilichamen.
    1. De gedelipideerde nier met primaire antilichamen (1:100 of 1:200, zie Materiaaltabel) in de kleuringsbuffer bij 37 °C bij zacht schudden gedurende 7 dagen.
      OPMERKING: De hoeveelheid van de kleuringsbuffer die nodig is voor één nier is 500-600 μL (figuur 2C).
    2. Was de nier met 0,5% (v/v) Triton X-100 in PBS (PBST) bij kamertemperatuur gedurende 1 dag9 (figuur 1).
  3. Voer kleuring uit met secundaire antilichamen.
    1. Immunostain de nier met secundaire antilichamen (1:100 of 1:200, zie Tabel van materialen) in de kleuringsbuffer bij 37 °C met zacht schudden gedurende 7 dagen. Was de nier met PBST bij kamertemperatuur gedurende 1 dag9 (figuur 1).
    2. Dompel na fixatie9 de nier onder in 1% formaldehyde in PB (1:36 mengsel van 37% formaldehyde en PB) gedurende 3 uur en was deze met PBS bij kamertemperatuur gedurende 6 uur (figuur 1).

4. Refractie index (RI) matching

  1. Bereid CUBIC-R+ voor.
    1. Bereid CUBIC-R door 45 wt% 2,3-dimethyl-1-fenyl-5-pyrazolon/antipyrine en 30 wt% nicotinamide te mengen (zie materiaaltabel).
    2. Bereid CUBIC-R+ voor op refractieve index (RI) matching door 0,5 v% N-buthyldiethanolamine toe te voegen aan CUBIC-R volgens de eerder gepubliceerde rapporten 4,8,9.
  2. Voer de RI-matching uit.
    1. Dompel de nier onder in 7 ml van 50% (v / v) CUBIC-R + (1: 1 mengsel van water en CUBIC-R +) in een ronde onderbuis van 14 ml met zacht schudden bij kamertemperatuur gedurende 1 dag. Dompel het vervolgens onder in 7 ml CUBIC-R + in een ronde onderbuis van 14 ml met zacht schudden bij kamertemperatuur gedurende 2 dagen9 (figuur 1).
      OPMERKING: Hoewel de nier aan het begin van de RI-matching in 50% CUBIC-R+ drijft, zinkt deze en wordt hij aan het einde van het proces transparant in CUBIC-R+ (figuur 2D).

5. Beeldacquisitie en reconstructie

  1. Dompel de RI-gematchte nier onder in een mengsel van siliciumolie (RI = 1.555) en minerale olie (RI = 1.467) (55:45) tijdens beeldacquisitie (RI = 1.51)5 (Figuur 3).
  2. Verkrijg 3D-beelden van de hele nier met een op maat gemaakte fluorescerende microscoop met9 lichtplaten (zie Materiaaltabel). Verzamel alle onbewerkte afbeeldingsgegevens in een 16-bits TIFF-indeling. Visualiseer en leg de 3D-gerenderde beelden vast met de imaging analyse software (Imaris, zie Tabel van Materialen).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Met behulp van deze kleuringsmethode werden sympathische zenuwen [anti-tyrosinehydroxylase (TH) antilichaam] en slagaders [anti-α-gladde spieractine (αSMA) antilichaam] in een hele nier (figuur 4A, B en video 1) gevisualiseerd9. Abnormale renale sympathische zenuwen werden ook gevisualiseerd na ischemie/reperfusieletsel (IRI)9,10 (figuur 4C). Bove...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het huidige protocol maakte 3D-beeldvorming van de hele nier mogelijk van verschillende structuren zoals sympathische zenuwen, verzamelkanalen, slagaders, proximale tubuli en glomeruli 9,10,11. Deze kleuringsmethode bood macroscopische observatie en leidde tot nieuwe biologische ontdekkingen, door de verandering in renale sympathische zenuwen na ischemie-reperfusieletsel 9,10<...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Een deel van dit werk werd uitgevoerd door samenwerking met Prof. Hiroki R. Ueda (Universiteit van Tokio), Prof. Etsuo A. Susaki (Juntendo University), Prof. Tetsuhiro Tanaka (Tohoku University), Prof. Masafumi Fukagawa, Dr. Takehiko Wada en Dr. Hirotaka Komaba (Tokai University).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
14 mL Round Bottom High Clarity PP Test TubeFalcon352059Weefselklaring, kleuring, wassen
2,3-dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone/antipyrineTokyo Chemical IndustryD1876CUBIC-R+
37%-Formaldehyde SolutionNacalai Tesque16223-55Post fixatie
4%-Paraformaldehyde Fosfaat Buffer SolutionNacalai Tesque09154-85Nieraffixatie
Alexa Flour 555-geconjugeerd ezel anti-schapen IgG-antilichaamInvitrogenA-21436Secundair antilichaam (1:100)
Alexa Flour 647-geconjugeerd ezel anti-konijn IgG-antilichaamInvitrogenA-31573Secundair antilichaam (1:200)
Anti-aquaporine 2 (AQP2) antilichaamAbcamab199975Primair antilichaam (1:100)
Anti-podocine antilichaamSigma-AldrichP0372Primair antilichaam (1:100)
Anti-natrium glucose cotransporter 2 (SGLT2) antilichaamAbcamab85626Primair antilichaam (1:100)
Anti-tyrosine hydroxylase (TH) antilichaamAbcamab113Primair antilichaam (1:100)
Anti-α-smooth muscle actine (α-SMA) antilichaamAbcamab5694Primair antilichaam (1:200)
Blocker Caseïne in PBSThermo Fisher Scientific37528Kleurbuffer
ButorfanoltartraatMeiji005526Anestheticum
C57BL/6NJclNippon Bio-Supp.CenterN/AMuisstam
ImarisBitplaneN/ABeeldanalysesoftware
Macro-zoom microscoopOLYMPUSMVX10De observatie-eenheid van de op maat gebouwde microscoop
Medetomidine HydrochlorideKyoritsu-Seiyaku008656Anestheticum
MidazolamSANDOZ27803229Anestheticum
MineralolieSigma-AldrichM8410Immersiol
N-buthyldiethanolamineTokyo Chemical IndustryB0725CUBIC-L, CUBIC-R+
NicotinamideTokyo Chemical IndustryN0078CUBIC-R+
Polyethyleenglycol mono-p-isooctylfenylether/Triton X-100Nacalai Tesque12967-45CUBIC-L, PBST
Siliconeolië HIVAC-F4Shin-Etsu Chemical50449832Immersiol
NatriumazidWako195-11092Kleurbuffer

Referenties

  1. Velez-Fort, M., et al. The stimulus selectivity and connectivity of layer six principal cells reveals cortical microcircuits underlying visual processing. Neuron. 83 (6), 1431-1443 (2014).
  2. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  3. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
  4. Tainaka, K., et al. Chemical Landscape for Tissue Clearing Based on Hydrophilic Reagents. Cell Reports. 24 (8), 2196-2210 (2018).
  5. Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
  6. Keller, P. J., Dodt, H. U. Light sheet microscopy of living or cleared specimens. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 138-143 (2012).
  7. Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).
  8. Kubota, S. I., et al. Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution. Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).
  9. Hasegawa, S., et al. Comprehensive three-dimensional analysis (CUBIC-kidney) visualizes abnormal renal sympathetic nerves after ischemia/reperfusion injury. Kidney International. 96 (1), 129-138 (2019).
  10. Hasegawa, S., Inoue, T., Inagi, R. Neuroimmune interactions and kidney disease. Kidney Research and Clinical Practice. 38 (3), 282-294 (2019).
  11. Hasegawa, S., et al. The oral hypoxia-inducible factor prolyl hydroxylase inhibitor enarodustat counteracts alterations in renal energy metabolism in the early stages of diabetic kidney disease. Kidney International. 97 (5), 934-950 (2020).
  12. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).
  13. Hasegawa, S., et al. Activation of sympathetic signaling in macrophages blocks systemic inflammation and protects against renal ischemia-reperfusion injury. Journal of the American Society of Nephrology. 32 (7), 1599-1615 (2021).
  14. Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  15. Klingberg, A., et al. Fully automated evaluation of total glomerular number and capillary tuft size in nephritic kidneys using lightsheet microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).
  16. Zhao, S., et al. Cellular and molecular probing of intact human organs. Cell. 180 (4), 796-812 (2020).
  17. Susaki, E. A., et al. Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues. Nature Communications. 11 (1), 1-22 (2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

NierbeeldvormingCUBIC weefselklaringwhole mount kleuringimmunofluorescente kleuringantilichaampenetratierenale sympathische zenuwenvisualisatie van glomeruliproximale tubuliischemie reperfusieschade

Gerelateerde artikelen