Grootschalige SARS-CoV-2-tests met behulp van speeksel en pooling van transpositiemonsters

Summary

Het protocol is bedoeld als blauwdruk voor universiteiten en andere organisaties die overwegen om op grote schaal te testen op SARS-CoV-2 of om paraatheidsplannen te ontwikkelen voor toekomstige virale uitbraken.

Abstract

Identificatie en isolatie van besmettelijke personen, samen met quarantaine van nauwe contacten, is van cruciaal belang om de verspreiding van COVID-19 te vertragen. Grootschalige tests in een surveillance- of screeningcapaciteit voor asymptomatische dragers van COVID-19 leveren zowel gegevens op over de verspreiding van virussen als het follow-upvermogen om individuen snel te testen tijdens vermoedelijke uitbraken. Het COVID-19-programma voor vroege opsporing aan de Michigan State University maakt sinds het najaar van 2020 gebruik van grootschalige tests in een bewakings- of screeningcapaciteit. De hier aangepaste methoden maken gebruik van de betrouwbaarheid, het grote monstervolume en de voordelen van zelfafname van speeksel, in combinatie met een kosteneffectief, reagensbesparend tweedimensionaal poolingschema. Het proces is ontworpen om aanpasbaar te zijn aan tekorten aan voorraden, waarbij veel componenten van de kits en de test gemakkelijk kunnen worden vervangen. De processen die worden beschreven voor het verzamelen en verwerken van SARS-CoV-2-monsters kunnen worden aangepast om te testen op toekomstige virale pathogenen die op betrouwbare wijze tot expressie komen in speeksel. Door deze blauwdruk voor universiteiten of andere organisaties te verstrekken, kunnen paraatheidsplannen voor toekomstige virale uitbraken worden ontwikkeld.

Introduction

De COVID-19-pandemie, veroorzaakt door het SARS-CoV-2-virus, heeft tot nu toe de dood van meer dan 6.2 miljoen mensen veroorzaakt, en het aantal stijgt elke dag¹. De gouden standaard voor het testen op SARS-CoV-2 is kwantitatieve real-time (RT-q) PCR, met primers die zijn ontworpen om zich te richten op het virale genoom, zoals nucleocapside-, envelop-, spike- en RNA-afhankelijke RNA-polymerasegenen². Aan het begin van de pandemie ontbrak er ernstig aan voldoende capaciteit voor SARS-CoV-2-tests. Het kwam voort uit een gebrek aan gevalideerde tests, testcomponenten, klinisch personeel en een infrastructuur die niet voorbereid was om snel uit te breiden om massale tests op pandemieniveau mogelijk te maken. Vanwege tekorten hadden testcentra vaak een verwijzing van een arts nodig om in aanmerking te komen voor de test. Deze tekorten resulteerden in vertragingen bij de goedkeuring van tests, lange rijen voor ongemakkelijke nasofaryngeale monsterafname en lange wachttijden voor resultaten. Bovendien konden de testinspanningen vanwege deze beperkingen geen plaats bieden aan presymptomatische, milde of asymptomatische dragers die onbewust SARS-CoV-2 verspreiden. Het gebrek aan gemakkelijk toegankelijke, wijdverbreide tests heeft waarschijnlijk bijgedragen aan de ongecontroleerde verspreiding van COVID-19.

Grootschalige intervaltesten kunnen worden uitgevoerd als bewaking of screening. Beide kunnen worden gebruikt om lokale positiviteitspercentages te monitoren in transmissiegebieden met een hoge dichtheid of een hoog risico en kunnen worden gebruikt om beslissingen op het gebied van de volksgezondheid te nemen. Surveillancetests zijn bedoeld om de incidentie en prevalentie van ziekten in een populatie te monitoren en worden niet gebruikt voor individuele diagnostiek³. Surveillanceresultaten worden doorgaans geanonimiseerd en niet teruggestuurd naar de deelnemers; laboratoria die surveillancetests uitvoeren, hoeven niet klinisch gecertificeerd te zijn en hoeven ook geen door de FDA goedgekeurde test te gebruiken. Screening maakt het mogelijk om resultaten terug te sturen naar individuele deelnemers, maar screeninglaboratoria in de Verenigde Staten moeten een Clinical Laboratory Improvement Amendments (CLIA)-certificaat hebben en voldoen aan alle toepasselijke CLIA-vereisten.

Het vroege detectieprogramma van de Michigan State University (MSU) begon in september 2020 en heeft meer dan 350,000 monsters verwerkt. Het programma is voortgekomen uit de inspanningen van een onderzoeksgroep om een zeer gevoelige SARS-CoV-2-test te ontwerpen waarvoor geen veelgevraagde testbenodigdheden nodig waren 4,5,6,7,8. De doelen waren om klinische laboratoria te helpen de capaciteit te vergroten en flexibele processen te ontwikkelen om tekorten op te vangen, terwijl ook een screeningstrategie werd ontwikkeld om een plan voor terugkeer naar het werk op te stellen voor het MSU College of Human Medicine. De eerste inspanningen waren gericht op alternatieve verzamelings-, extractie- en kwantificeringsmethoden voor SARS-CoV-2. De grote vraag en de daaropvolgende tekorten aan nasofaryngeale uitstrijkjes leidden tot de evaluatie van monsters van de voorste neusgaten die waren verzameld met buccale uitstrijkjes, en tekorten aan reagentia resulteerden in de ontwikkeling van een monsterextractiemethode die was aangepast aan vroege rapporten uit Wuhan, China⁹. Om de gevoeligheid voor het detecteren van SARS-CoV-2 in monsters van de voorste neusgaten te verhogen, werd RT-qPCR ^6,7 vervangen door druppel digitale PCR. Hoewel digitale PCR met druppels zeer gevoelig is en absolute waarden kan leveren met een eindpuntuitlezing, werd vastgesteld dat het gebruik ervan niet haalbaar was voor grootschalige tests vanwege het gebrek aan betrouwbare high-throughput instrumentatie voor de technologie. Bovendien was het zelf verzamelen van monsters van de voorste neusgaten op basis van niveaus van humaan RNase P uiterst variabel, wat suggereert dat het niet voldoende betrouwbaar was voor massatesten.

Een alternatief voor nasofaryngeale en voorste neusuitstrijkjes is het verzamelen van speeksel. Respiratoire virussen zoals SARS-CoV, H1N1 en MERS werden historisch gezien allemaal gedetecteerd in speeksel 10,11,12,13. Dit werd vervolgens bewezen voor SARS-CoV-2 14,15,16,17. Directe vergelijking tussen speeksel en nasofaryngeale monsters toonde aan dat speeksel hogere virale titers oplevert dan nasofaryngeale uitstrijkjes in gematchte monsters, en dat speeksel minder variabel is bij herhaalde monsterafname¹⁴. Er is ook gemeld dat speeksel gevoeliger is in bepaalde varianten, zoals Omicron, in vergelijking met Delta¹⁶. Toegevoegde voordelen van speekselafname zijn het relatieve gemak van zelfafname buiten de locatie zonder veelgevraagde voorraden, de mogelijkheid om het monster indien nodig herhaaldelijk opnieuw te testen, de eliminatie van personeelsvereisten ter plaatse voor het verzamelen van monsters en het vermijden van wachtrijen voor deelnemers die de kans op virale overdracht zouden kunnen vergroten. De in het laboratorium geassembleerde speekselkit is ontwikkeld als een samenwerking tussen ontwikkelaars van laboratoriumtests, experts op het gebied van verpakkingen, merkexperts van universiteiten, veiligheidsfunctionarissen en externe productiepartners die de doos en het etiketteringssysteem hebben geproduceerd.

Hoewel speekselmonsters voldoende genetisch uitgangsmateriaal bieden en RT-qPCR gevoelige, betrouwbare resultaten oplevert, maakten de kosten van reagentia (primer/sondes en mastermix) het grootschalig testen van individuele monsters tot een kostbare onderneming op individuele basis, per monster. Aangezien de primer/sondes en de mastermix de duurste componenten van het proces zijn, was het doel om oplossingen te zoeken die het gebruik ervan zouden oprekken en daardoor de kosten per monster zouden verlagen. Voor SARS-CoV-2-testen is voorgesteld om de omvang van de steekproefpool systematisch te optimaliseren op basis van incidentie in de gemeenschap en testgevoeligheid¹⁸. Wanneer zwembaden van welke omvang dan ook de aanwezigheid van SARS-CoV-2 aangeven, moeten alle deelnemers aan de pool echter opnieuw worden getest, wat resulteert in tijdverlies en meer kans op verspreiding. Om deze beperkingen aan te pakken, werd een tweedimensionale poolingmethode gebruikt, zoals het proces voorgesteld door Zilinskas en anderen¹⁹ om een eerste doorgang uit te voeren onder de beperkingen van surveillancetests. In dit proces worden 96 individuele monsters op een plaat met 96 putjes geplaatst, bestaande uit 12 kolommen en acht rijen. Elk monster wordt opgenomen in een pool van acht en een pool van 12 op twee verschillende reactieplaten. Dit resulteert erin dat elk monster uniek wordt vertegenwoordigd met de twee pools. Deconvolutie van de pools op basis van de coördinaten identificeert potentieel positieve monsters. Monsters in zwembaden waar SARS-CoV-2 niet is gedetecteerd, gaan niet over van surveillancetests naar screening. Ondertussen worden monsters van personen die positief testen in het surveillanceproces opnieuw geëxtraheerd via een door CLIA goedgekeurd screeningproces. Als ze positief worden bevestigd, krijgen individuen hun resultaat, worden ze doorverwezen naar het kantoor van de universiteitsarts, wordt contactopsporing gestart en wordt de gezondheidsafdeling op de hoogte gebracht. In totaal wordt het monster van een persoon getest in drie afzonderlijke reacties voordat het positief wordt verklaard, twee keer in surveillancepools en één keer als een enkel bevestigend scherm, waardoor de kans op een vals-positief wordt verkleind. Bij het poolen van monsters worden ~80% minder reagentia gebruikt dan bij het afzonderlijk uitvoeren van monsters, wat resulteert in een kostprijs van ~ $ 12 per monster.

Naast de speekselkit, de poolingstrategie en het ontwikkelingsproces van de test, ontwikkelde het team ook een logistiek plan voor de distributie van kits, het verzamelen van monsters en het rapporteren van resultaten. Deelnemers aan het programma halen hun kit op, registreren de unieke alfanumerieke code op hun buis, produceren hun monster en deponeren het in een van de vele drop-off bakken waar ze dagelijks worden opgehaald en naar het lab worden vervoerd. Het lab verwerkt de monsters, de technisch supervisor beoordeelt en uploadt de resultaten, en deelnemers worden op de hoogte gebracht om het resultatenportaal te controleren. Dit proces heeft een doorlooptijd van 24-48 uur vanaf het moment dat een monster wordt gedeponeerd. De samenwerking vanuit alle geledingen van de instelling was essentieel voor een succesvolle grootschalige implementatie van dit hybride surveillance- en screeningproces. De volgende procedures en beschrijvingen van het benodigde testprogramma en de benodigde infrastructuur zijn bedoeld als blauwdrukken voor het opschalen van testen voor toekomstige bewakings- en/of screeningdoeleinden.

Protocol

Studies die zijn uitgevoerd om de methoden voor het Early Detection Program te optimaliseren, zijn goedgekeurd door de Michigan State University Institutional Review Board. Alle figuren zijn gereproduceerd met gekunstelde monsters en zijn representatief voor de waargenomen menselijke resultaten. Geen enkele gegevens, informatie of resultaten die in het manuscript worden getoond, zijn afkomstig van een deelnemer aan het Michigan State University Early Detection Program.

1. Productie van kits

NOTITIE: Draag tijdens de montage van de kit te allen tijde maskers, handschoenen, oogbescherming en laboratoriumjassen om besmetting van de kitcomponenten te voorkomen.

1. Voorbereiding van kitcomponenten
   1. Teken met een permanente stift een lijn die 1 ml aangeeft op de conische buis van 25 ml. Teken met een permanente marker een lijn die 1 ml aangeeft op de transferpipet.
   2. Voeg vier keramische kralen toe aan de 5 ml monsterbuis. Pipetteer 1 ml RNA-stabilisatieoplossing in de monsterbuis en sluit de buis. Bevestig een haltersticker bestaande uit een unieke identificatiecode aan de monsterbuis met de barcode van de datamatrix aan de bovenkant en de identificatie herhaald in alfanumerieke code aan de zijkant.
      LET OP: De keramische kralen zijn RNase/DNase-vrij en hoeven niet verder gesteriliseerd te worden.
2. Plaats een conische buis van 25 ml, een monsterbuis van 5 ml, een transferpipet en een kleine zak met biologisch gevaarlijk product in de kitdoos (aanvullende afbeelding 1).
   OPMERKING: Conische buizen hoeven niet DNase/RNase-vrij te zijn. De integriteit van het monster wordt behouden door de RNA-stabilisatieoplossing.

2. Uitrustingsgebruik voor zelf-steekproefinzameling

1. Vraag de deelnemers volgens de instructies van de kit om 30 minuten voordat ze een monster verstrekken niet te eten of te drinken. Vraag de deelnemers om in de conische buis van 25 ml te spugen totdat er 1 ml speeksel is opgevangen (gemarkeerde lijn).
2. Breng met behulp van de pipet 1 ml speeksel (tot aan de gemarkeerde lijn) over in de monsterbuis van 5 ml met RNA-stabilisatieoplossing en keramische kralen. Sluit de monsterbuis en schud deze gedurende 15 s.
3. Vraag de deelnemers om de alfanumerieke code die aan het monster is toegewezen, te registreren op de daarvoor bestemde website. Als u klaar bent, vraagt u hen om de monsterbuis in een kleine zak met biologisch gevaarlijk materiaal te doen en in een opvangbak te deponeren.

3. Monsterinname en voorbereiding voor RNA-isolatie

OPMERKING: Alle stappen vinden plaats in een bioveiligheidskast of centrifuge-emmer met een biocontainment-deksel.

1. Desinfecteer en inspecteer monsters visueel voor kwaliteitscontrole terwijl ze zich nog in de zak met biologisch gevaarlijk water bevinden.
2. Weiger het monster als (Figuur 1): het monster een niet-natuurlijke kleur heeft (d.w.z. groen, blauw) of voedseldeeltjes of bloed bevat; monster lekt of mist kralen; monster heeft een onjuist verwacht volume (<1,5 ml of >3 ml); Aan het monster is geen streepjescode of alfanumerieke code gekoppeld.
   1. Als het monster wordt geweigerd, scant u het monster en neemt u het op in een afkeuringsbestand met een opmerking waarom het monster is geweigerd. Als het monster wordt geweigerd omdat het geen ID's heeft, registreert u het monster als Geen streepjescode in het afwijzingsbestand.
3. Als het monster niet wordt uitgeworpen, knipt u de zak met biologisch gevaarlijk water open met een schaar en verwijdert u het monsterbuisje. Draai de buis gedurende 15 s en plaats vervolgens de monsterbuis in een buisadapter voor een swing-bucket-centrifuge.
4. Zodra de buisadapters vol zijn, bevestigt u het deksel van de biocontainment over de centrifuge-emmer en brengt u deze over naar de centrifuge. Centrifugeer de monsters op 4.100 x g gedurende 2 minuten en breng de monsters terug naar de bioveiligheidskast.
   OPMERKING: Centrifugatie wordt gebruikt om vuil te pelleteren en meer stroperig materiaal in speeksel naar de bodem van de buis te dwingen. Dit elimineert de noodzaak van proteïnase K in het proces. Een volledige run bestaat uit 768 monsters (acht platen met 96 putjes vol monster na RNA-isolatie).
5. Zonder het gepelleteerde materiaal te verstoren, brengt u de monsterbuisjes over naar een buizenrek met 96 sleuven dat vooraf is gelabeld met de run-ID met het reknummer (1-8), de datum en de overeenkomstige groep waarmee de monsters worden samengevoegd/beoordeeld (een identificatie om de groep aan te duiden, dwz groep A is de eerste run van de dag).
6. Wanneer buisrekken met 96 sleuven vol zijn of er geen monsters meer over zijn, scant u met behulp van een draagbare barcodescanner de buizen in een plaatkaartbestand (aanvullend bestand 1 voor volledige zwembaden; Aanvullend bestand 2 voor halve zwembaden). Als een barcode niet werkt, gebruik dan de alfanumerieke code op de buis om het monster te registreren.
   OPMERKING: Een masker is vereist om te voorkomen dat aangrenzende streepjescodes worden gescand. Een masker kan worden gemaakt door een gat in ondoorzichtig papier te snijden en het vervolgens te lamineren. Barcodes die in het plaatkaartbestand zijn gescand, verschijnen in dezelfde richting als in het rek met 96 sleuven.
7. Spuit de monsterbuisjes in het rek in met 70% ethanol en dep ze droog met keukenpapier.
   OPMERKING: Het afvegen van de tubes in plaats van deppen kan de barcodes beschadigen.
8. Label een plaat met 96 diepe putten met een putcapaciteit van 2 ml met de Run ID. Breng 200 μl speekselmonster over van elke monsterbuis naar de overeenkomstige put van de plaat met 96 diepe putjes. Als monsters te stroperig zijn om over te brengen, vortex en centrifugeer opnieuw. Weiger het monster als het probleem zich blijft voordoen.
   OPMERKING: Speekselmonsters kunnen draderig zijn en tijdens de overdracht een slakkenspoor over de plaat achterlaten als de technicus niet oppast. Dit kan leiden tot aanvankelijke valse positieven en meer monsters die uiteindelijk opnieuw moeten worden uitgevoerd in de bevestigingsstap (zie sectie 6).
9. Wanneer alle monsters zijn overgebracht, bedek u de 96-deep-well plaat met een siliconenmat en bewaart u deze bij kamertemperatuur. Bewaar en bewaar de rekken met 96 sleuven met de resterende monsters voor bevestiging van mogelijk positieve monsters.
   OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd.

4. RNA-isolatie

1. Label een RNA-isolatiecartridge met 96 putjes met de Run ID en plaats deze op een leeg verzamelplaatje.
   NOTITIE: Platen met monsters kunnen op dit punt uit de bioveiligheidskast worden verwijderd.
2. Verwijder de siliconenmat van de 96-deep-well plaat. Breng 400 μL virale laadbuffer over in elk putje van de plaat met 96 diepe putjes.
3. Meng elk monster door twee tot vier keer voorzichtig op en neer te pipetteren en breng het hele monster over naar de overeenkomstige kolom in de RNA-isolatiecartridge met 96 putjes.
   OPMERKING: Als u grote hoeveelheden mengt, ontstaan er luchtbellen die kunnen leiden tot verontreiniging van aangrenzende putten als het lukraak wordt uitgevoerd. Opzettelijk mengen kan dit risico verlagen en de integriteit van de downstream-verwerking beschermen.
4. Centrifugeer de RNA-isolatiepatroon bovenop de verzamelplaat op 4.100 x g gedurende 10 minuten om monsters op de patroon te laden. Breng de RNA-isolatiecartridge over naar een schone verzamelplaat.
5. Voeg 500 μL wasbuffer toe aan elk putje van de RNA-isolatiecartridge en centrifugeer op 4.100 x g gedurende 5 min. Breng de RNA-isolatiecartridge over op een schone verzamelplaat.
6. Voeg 500 μL wasbuffer toe aan elk putje van de RNA-isolatiecartridge en centrifugeer op 4.100 x g gedurende 5 min. Breng de RNA-isolatiecartridge over op een schone verzamelplaat.
7. Voeg 500 μL 100% ethanol toe aan elk putje van de RNA-isolatiecartridge en centrifugeer op 4.100 x g gedurende 5 min. Breng de RNA-isolatiecartridge over op een schone verzamelplaat.
   OPMERKING: Als het monster op dit punt nog niet volledig door de kolom is gegaan, is het monster te stroperig of verstoppen kleine stukjes vuil in het monster de kolom. Het monster moet volledig uit de cartridge worden verwijderd om het downstream poolingproces niet te vervuilen en het monsternummer moet worden toegevoegd aan het afkeurbestand.
8. Centrifugeer de RNA-isolatiepatroon op de verzamelplaat op 4.100 x g gedurende 5 minuten om de kolommen te drogen. Breng de RNA-isolatiecartridge over op een schone elutieplaat met het label Run-ID en de woordrij en plaats beide vervolgens op een schone verzamelplaat.
9. Voeg 25 μL DNase/RNase-vrij water van moleculaire kwaliteit toe aan elk putje van de RNA-isolatiecartridge. Centrifugeer bij 4.100 x g gedurende 10 minuten om het RNA te elueren. Als het monster niet volledig elueert, centrifugeer het monster dan opnieuw gedurende 5 minuten.
10. Leg de elutieplaten op voorgekoelde koude platen en dek af. Ga onmiddellijk verder met het poolen van monsters en RT-qPCR.

5. Pooling van monsters en RT-qPCR

OPMERKING: Het proces is opgezet in een systeem met twee platen (zoals te zien is in afbeelding 2). Het elutie-RNA-plaatnummer komt overeen met het geproduceerde kolomplaatnummer en de rijplaatletter (A = 1, B = 2, C = 3, enz.). Voor deconvolutiedoeleinden komt de rijletter van de kolomplaat overeen met de rijletter van de RNA-elutieplaat en komt het kolomnummer van de rijplaat overeen met het kolomnummer van de RNA-elutieplaat. Een monster in RNA-plaat #6 op positie C4 is bijvoorbeeld te vinden in de rijreactieplaat positie F4 en in de kolom reactieplaat positie C6.

1. Label een nieuwe elutieplaat met de Run ID en de woordrij en plaats deze op een voorgekoelde koude plaat. Breng 10 μL RNA over van elk putje op de rij-elutieplaat naar de corresponderende rij op de kolomelutieplaat, waardoor een kopie wordt gemaakt van de originele elutieplaat (Figuur 2).
   OPMERKING: Elutieplaten die zijn gemarkeerd met een kolom worden samengevoegd in de kolomrichting en elutieplaten die zijn gemarkeerd met een rij worden samengevoegd in de rijrichting.
2. Voor de gegroepeerde plaat in de kolom brengt u het volledige volume van elk putje over de plaat over naar het kolomnummer dat overeenkomt met het nummer van het ID-plaatje van de uitvoering. Voor de gegroepeerde plaat in de rij brengt u het volledige volume van elk putje omhoog of omlaag over de plaat over naar het rijnummer dat overeenkomt met het nummer van het ID-plaatje van de uitvoering (1 = A, 2 = B, enz.; Figuur 2).
3. Breng 13 μL van elk samengevoegd monster over in de overeenkomstige kolom of rij van een reactieplaat met 96 putjes (Figuur 2).
4. Gebruik voor dit protocol drie sondes tegen de nucleocapside (N), ORF1ab en spike (S) genen om SARS-CoV-2 te detecteren, en een vierde primer-sonde gericht op MS2-faag als interne controle. Spike in de gepoolde samples een MS2 faag positieve controle in de mastermix. In monsters die afzonderlijk worden uitgevoerd, prikt u MS2-faag in het monster op de RNA-isolatiecartridge en gebruikt u deze als extractiecontrole.
   OPMERKING: Mastermix, primersondes, fluorescerende kleurstoffen en quenchers variëren op basis van de test. De juiste verhoudingen en fluorescerende kanalen moeten door elk laboratorium worden bepaald.
5. Bereid de positieve controle voor door 2 μl positieve controleoplossing en 11 μl DNase/RNasevrij water van moleculaire kwaliteit toe te voegen aan de positieve controleput op de reactieplaat (figuur 2).
6. Bereid de controle zonder sjabloon voor door 13 μl DNase/RNasevrij water van moleculaire kwaliteit toe te voegen aan het putje voor de negatieve controle op de reactieplaat.
7. Maak een mastermix volgens de instructies van de fabrikant en piek in de positieve controle van MS2-faag. Doseer 7 μl mastermix in elk putje van de reactieplaten met 96 putjes die monsters of bedieningselementen bevatten. Beperk de blootstelling aan fluorescerend licht.
8. Bedek de reactieplaten met optische film en vortex gedurende 2 minuten om de monsters goed te mengen. Centrifugeer de reactieplaten op 650 x g gedurende 5 min.
9. Breng de platen over in het RT-PCR-systeem en voer ze uit met cyclusparameters die geschikt zijn voor het mastermengsel. Voor het hier gebruikte mastermengsel werden de volgende cycli uitgevoerd: 25 °C gedurende 2 min, 53 °C gedurende 10 min, 95 °C gedurende 2 min, 40 cycli van 95 °C gedurende 3 s en 60 °C gedurende 30 s.
10. Zodra de monsters zijn uitgevoerd, voert u een deconvolutie van de pools uit om potentieel positieve monsters handmatig te identificeren (Afbeelding 3) en via een R Script Shiny-app.
    1. Exporteer resultaten van kolom- en rijreactieplaten als werkbladbestanden. Open de Shiny app van het zwembad deconvolution R (broncode beschikbaar op: https://github.com/kochman1/JoVE-MSU-COVID-EDP).
    2. Sleep de plaat-, indelings-, kolom- en rijbestanden naar de app en voer de app uit. Sla de lijst op die vanuit de app is gemaakt.
       OPMERKING: De lijst die uit de app wordt geproduceerd, bevat alle streepjescodes die in de plaatkaart zijn ingevoerd en of ze waarschijnlijk positief of negatief zijn op basis van het script voor pooldeconvolutie. Deze monsters die zijn gemarkeerd als potentiële positieven, worden afzonderlijk opnieuw verwerkt.

6. Validatie van positieve monsters

1. Label twee microcentrifugebuisjes van 1,5 ml en een RNA-extractiekolom voor elk monster dat moet worden getest. Gebruik één microcentrifugebuis voor het mengen van monster, MS2-faag en virale laadbuffer, en de tweede microcentrifugebuis voor de RNA-elutiestap.
2. Voeg 5 μL MS2 Phage RNA toe aan de microcentrifugebuis van 1,5 ml. Breng 200 μl van het potentieel positieve monster over naar de buis en voeg 400 μl virale laadbuffer toe aan de buis, meng door te pipetteren.
3. Breng de volledige inhoud over naar de vooraf gelabelde RNA-extractiekolom in een schone verzamelbuis. Centrifugeer op 10.000 x g gedurende 2 min. Aanzuigstroom door vanuit de opvangbuis.
4. Voeg 500 μL wasbuffer toe aan de RNA-extractiekolom en centrifugeer op 10.000 x g gedurende 2 min. Aanzuigstroom door vanuit de opvangbuis.
5. Voeg 500 μL wasbuffer toe aan de RNA-extractiekolom en centrifugeer op 10.000 x g gedurende 2 min. Aanzuigstroom door vanuit de opvangbuis.
6. Voeg 500 μL 100% ethanol toe aan de RNA-extractiekolom en centrifugeer gedurende 1 minuut op 10.000 x g . Breng de RNA-extractiekolom over in een schone verzamelbuis en centrifugeer op 10.000 x g gedurende 1 minuut om de kolom te drogen.
7. Breng de RNA-extractiekolom over naar een vooraf geëtiketteerde microcentrifugebuis van 1.5 ml voor elutie. Voeg 25 μL DNase/RNase-vrij water van moleculaire kwaliteit toe aan de RNA-extractiekolom. Centrifugeer gedurende 2 minuten bij 10.000 x g om het RNA op te vangen en de buis over te brengen op nat ijs.
8. Maak de mastermix volgens de instructies van de fabrikant. Doseer 7 μL mastermix in elk putje van een reactieplaat met 96 putjes die het monster zal bevatten. Breng 13 μL van elk geïsoleerd RNA over in de reactieplaat.
   OPMERKING: De mastermix is dezelfde die wordt gebruikt in het gepoolde sampleprotocol, maar bevat niet de MS2-faag-RNA-spike.
9. Bereid de positieve controle voor door 2 μl positieve controleoplossing en 11 μl DNase/RNasevrij water van moleculaire kwaliteit toe te voegen aan de positieve controleput op de reactieplaat. Bereid de controle zonder sjabloon voor door 13 μl DNase/RNasevrij water van moleculaire kwaliteit toe te voegen aan het putje voor de negatieve controle op de reactieplaat.
10. Bedek de reactieplaten met optische film en vortex gedurende 2 minuten om de monsters goed te mengen. Centrifugeer de reactieplaten op 650 x g gedurende 5 min. Breng de platen over in het RT-PCR-systeem en voer ze uit met cyclusparameters die geschikt zijn voor het mastermengsel.
    1. Gebruik voor de hier vermelde mastermix 25 °C gedurende 2 min, 53 °C gedurende 10 min, 95 °C gedurende 2 min, 40 cycli van 95 °C gedurende 3 s en 60 °C gedurende 30 s.

Results

De overgrote meerderheid van de monsters die tot nu toe door het laboratorium zijn ontvangen, is geaccepteerd en heeft de eerste stap voor visuele kwaliteitscontrole doorstaan. De noodzaak om een monster af te keuren is beperkt tot redenen die een negatieve invloed kunnen hebben op de verwerking van het monster en/of de algehele resultaten van het monster. Met name een onjuist volume in de buis, consistentie of kleur die niet natuurlijk is voor speeksel, een afwezigheid van keramische kr...

Discussion

Tijdens de monsterverwerking zijn er stappen die zorgvuldige aandacht vereisen. De eerste kwaliteitscontrolestap, waarbij wordt gekeken naar het monstervolume, de consistentie, de kleur en de aanwezigheid van toegevoegde kralen, is van cruciaal belang voor het algehele succes van het proces. Buisjes met monsters die niet de juiste hoeveelheid speeksel bevatten, kunnen een vals-negatief opleveren, omdat te weinig speeksel zou resulteren in onvoldoende genetisch materiaal; omgekeerd zou te...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 Step MM, no ROX	Thermo Fisher	A28523
1.2 mlDeep well Plates	Fisher	AB0564
100 mL reagent reservoirs	Corning	4872
2.8 mm Ceramic Beads	OMNI	19-646
25 ml conical w/screw cap	VWR	76338-496
50mL V bottom reservoirs	Costar	4870
5430-High-Speed Centrifuge	Eppendorf	22620601
5ml Eppendorf Tube	Fisher	14282300
8 strip tubes for QuantStudio	life technologies	4316567
Beta Mercaptoethanol	Fisher	AC125472500
Ethanol 200 Proof, Molecular Biology Grade	Fisher	BP28184
Microamp Endura Optical 96-well fast clear reaction plate with barcode	life technologies	4483485
Microamp Fast Optical 96 well plate	Fisher	4346906
Mini Microcentrifuge	Corning Medical	6770
optical caps for strip tubes	life technologies	AB-1820
Optical Film	Thermo Fisher	4311971
PCR plate sealing film Non-optical	Fisher	AB-0558
PCR Plate semi-skirted	Fisher	14230244
QuantStudio 3 Real-Time PCR System, 96-well, 0.1 mL	Thermo Fisher	A28136
Quick RNA Viral Kit confirmation	Zymo	R1035
Reagent Reservoir, 100ml	DOT	229298
RNA Shield	Zymo	R1200-1L
Small Biohazard Bags	Fisher	180000
Taqpath RTPCR COVID19 kit	Thermo Fisher	A47814
Thermo Scientific Sorvall ST4R Plus Centrifuge	Thermo Fisher	75009525
Transfer Pipet	Fisher	22170404
Viral 96 Kit	Zymo	R1041
Vortex Mixer	Fisher	2215414