Het institutionele comité voor de verzorging en het gebruik van dieren van het Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l'Université de Montréal (CRCHUM) keurde alle experimentele protocollen goed en de dieren werden behandeld in overeenstemming met de gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren. Voor dit protocol werden 3-4 maanden oude grote witte mannelijke of vrouwelijke varkens met een gewicht van 50-60 kg gebruikt. De grootte van het dier kan variëren afhankelijk van de experimentele doelen van de onderzoekers.
1. Dierlijke voorbereiding en verdovingsinductie
- Premediceer het dier met behulp van een intramusculaire injectie van atropine (0,04 mg / kg), midazolam (0, 3 mg / kg) en ketamine (20 mg / kg). Dien isofluraan toe bij een eindgetijdenconcentratie van 1%-3% in 3 L/min O2, met behulp van een gezichtsmasker voor anesthesie-inductie en onderhoud.
- Bevestig adequate anesthesie door te testen op een ontspannen kaaktint en afwezigheid van pijn met behulp van teenknijpreactie. Zorg ervoor dat het dier in dorsale decubituspositie wordt geplaatst en in normothermie wordt gehouden met behulp van een verwarmende deken.
- Nadat de geschiktheid van de anesthesie is bevestigd, voert u een orotracheale intubatie uit met behulp van een endotracheale buis van 6,5-8 mm zoals beschreven in 10.
- Plaats de zuurstofsaturatiemonitor op het oor of de onderlip van het dier voor continue controle. Stel de ventilatie in op een positieve eind-expiratoire druk (PEEP) van 5 cm H 2 O, een piekinspiratoire druk (PIP) van 15 cm H 2 O, een fractie geïnspireerde zuurstof (FIO 2) van 0,5 en een ademhalingsfrequentie (RR) van 15 ademhalingen / min met een getijdenvolume (TV) van 6-8 ml / kg en een normale partiële druk van O 2 en CO 2. Pas de RR aan om een eindgetijde CO2-niveau van 35-45 mmHg te handhaven.
- Verkrijg een perifere intraveneuze toegang via de oorader met behulp van een katheter van 20 G. Start een onderhoudsinfusie van normale zoutoplossing (0,9% NaCl) en dien 2 g magnesiumsulfaat (MgSO4) toe als een intraveneuze bolus om aritmieën te voorkomen.
- Bereid de chirurgische plaatsen voor door de thorax en liezen adequaat te scheren en te schrobben. Desinfecteer liezen en nek met chloorhexidine en drapeer op de juiste manier terwijl u veneuze en arteriële toegang biedt.
- Plaats de cautery elektrodepad op de rug van het dier. Plaats het dier in Trendelenburg-positie om de centrale veneuze toegang te vergemakkelijken.
- Lokaliseer de juiste halsader met behulp van een echografie. Eenmaal gelokaliseerd, met behulp van een naald, gaat u de huid in een hoek van 45 ° binnen totdat bloed wordt gezien en de naald wordt gezien in de ader op de echografie.
- Plaats de geleidingsdraad in de naald en steek vervolgens een 7 Fr percutane centrale veneuze schede-inbrenger over de geleidedraad.
- Verwijder de geleidingsdraad terwijl u de schede-inbrenger op zijn plaats houdt en plaats vervolgens een Swans-Ganz-katheter om hartuitvoermetingen en rechterhartkatheterisatie te garanderen.
OPMERKING: De linker halsader kan worden gebruikt in plaats van de rechter. Als toegang niet mogelijk is, steek de schede dan direct in de interne halsader (links of rechts) na sternotomie van de middellijn. Zorg er in dat geval voor dat je de ader ontleedt.
- Gebruik dezelfde techniek om een centraal veneuze katheter (bijvoorbeeld dubbel lumen) in de linker halsader in te brengen.
- Breng nog een 7 Fr percutane centrale veneuze schede-inbrenger in de rechter femorale ader met behulp van de Seldinger-techniek zoals beschreven in stap 1.7. tot 1.10., voor de introductie van een geleidingskatheter in de rechter ventrikel (RV). Dit kan percutaan worden gedaan met echo-geleiding, of na midline sternotomie.
- Sta een periode van stabiliteit toe gedurende 10 minuten na intubatie en manipulatie en meet vervolgens de hemodynamische en cardiale functieparameters bij basislijn, waaronder pulmonale en systemische drukken, cardiale output, RV- en LV-druk-volumelussen en transthoracale echocardiografie.
2. Chirurgische toegang tot stand brengen
- Voer met behulp van een cautery-pen een middellijnincisie uit van het midden-cervicale gebied naar het xiphoid. Verdeel daarna het onderhuidse vet, laag voor laag, langs de middellijn met behulp van de elektrocauterie om het peri-borstbeen te bereiken.
- Snijd rond de sternale inkeping en gebruik een vinger om zachte weefsels onder het borstbeen in te trekken en te vegen. Open het borstbeen met een botzaag en zorg ervoor dat het borstbeen volledig is verdeeld, terwijl u voorzichtig bent met de ader onder het bovenste deel van het borstbeen. Cauteriseer het borstbeen en/of breng botwas aan om een adequate hemostase te garanderen.
- Gebruik de elektrocauterie, ontleed en verwijder de thymus door deze uit het hartzakje te tillen. Cauteriseer de vaten die de thymus van de aorta en de superieure vena cava (SVC) leveren om bloedingen te voorkomen.
- Snijd het hartzakje voorzichtig open met de cautery. Steek vingers onder het hartzakje tijdens het snijden om letsel aan het hart te voorkomen.
- Dien 300 eenheden/kg heparine IV toe om systemische antistolling te bereiken. Als de test beschikbaar is, zorg dan voor een geactiveerde stollingstijd (ACT) ˃ 300 s.
3. Stopzetting van levensondersteunende therapieën en verklaring van overlijden
- Dien een bolus van 3 mg / kg propofol IV toe en stop vervolgens met mechanische ventilatie en koppel de endotracheale buis los.
OPMERKING: Deze stap komt overeen met "Terugtrekking van levensondersteuning" om de Normothermische regionale perfusie te lanceren. Voor euthanasievoorwaarden, zie rubriek 8.
- Controleer de arteriële druk en perifere O2-verzadiging . Start functionele warme ischemietijd wanneer de systolische druk 50 mmHg <.
- Stel circulatiestilstand vast wanneer er sprake is van asystolie (of ventriculaire fibrillatie) en een afwezigheid van arteriële pulsatiliteit. Start een minimale observatiefase van 5 minuten nadat de circulatiestilstand is vastgesteld (stand-off periode) en verklaar vervolgens de dood van dieren.
4. Plaatsing van thoracoabdominale normotherme regionale perfusie
- Gebruik de cautery om de aortopulmonale ruimte zorgvuldig te ontleden. Trek het RV-uitstroomkanaal inferieur in, de longslagader naar links en de aorta naar rechts om directe laesies naar de laatste te voorkomen. Neem indien nodig hulp van een assistent tijdens deze stap.
- Ontleed en ligaat de supra-aortavaten om cerebrale perfusie te vermijden en uit te sluiten. U kunt ook een grote kruisklem over de vaten aanbrengen.
- Plaats twee katheters van 18 G in de halsslagaders bilateraal distaal naar de occlusie om de potentiële bloedtoevoer naar de hersenen te evalueren. Verzamel en meet bloed tijdens het experiment en injecteer opnieuw via het NRP-circuit.
- Ontleed met behulp van de metzenbaum en de haakse tang subtiel tussen de SVC en de innominate slagader, en tussen de IVC en het hartzakje. Omcirkel de SVC en IVC met een navelstrengtape of een eenvoudige 0-zijden hechtdraad en zet ze vast met een tourniquet.
- Plaats met behulp van een 3-0 hechting twee concentrische purse-string hechtingen op de distale oplopende aorta adventitia; Vermijd hechtingen van volledige dikte. Plaats een hechtdraad op het rechter atrium (RA). Beveilig alle hechtingen met een tourniquet.
- Stel het NRP-systeem in en stel het voor op basis van de behoeften van de onderzoekers en experimenten. Gebruik voor dit protocol een ECMO-circuit met een centrifugaalpomp, geprimed met 2 L kristalloïde oplossing met 500 mg Solumedrol, 200 ml 8,4% natriumbicarbonaat (NaOH), 300 eenheden / kg heparine en 2 g MgSO4.
OPMERKING: De hier gebruikte opstelling is vergelijkbaar met die van de perfusionisten van de instelling op de afdeling hartchirurgie.
- Gebruik een arteriële canule van 17 tot 21 F, cannuleer de aorta en span vervolgens de tourniquet aan die de hechtdraad van de portemonnee vasthoudt om de canule op zijn plaats te houden.
OPMERKING: U kunt ook een extracorporale membraanoxygenator (ECMO) canule inbrengen met behulp van de Seldinger-techniek om bloedverlies te minimaliseren. Een andere methode bestaat uit het gebruik van een standaard bypass arteriële canule. De aortacanule wordt vervolgens verbonden met de arteriële lijn van het NRP-circuit met behulp van een 3/8-3/8-connector; Zorg voor volledige ontluchting om luchtembolie te voorkomen.
- Maak een incisie van 5 mm in het midden van de portemonnee-snaar op de RA en verwijd deze vervolgens met behulp van een instrument met een kleine hoek, zoals een rechthoekige of klik. Bedek de incisie met een vinger om overmatig bloeden te voorkomen.
- Gebruik een dubbeltraps veneuze canule om de RA te cannuleren en span vervolgens de hechtingen van de portemonnee aan met behulp van een tourniquet om de canule op zijn plaats te houden.
- Sluit de canules aan op de veneuze lijn van het NRP-circuit met behulp van een 1/2-3/8-connector en zorg voor volledige ontluchting om een luchtsluis in het systeem te voorkomen.
- Zorg ervoor dat er minimaal 15 minuten zijn verstreken tussen de verklaring van overlijden en de start van NRP om de tijd te omvatten die nodig is voor de voorbereiding van de klinische praktijk, het draperen en het hebben van toegang tot het hart.
- Start NRP 15 min na het begin van de functionele warme ischemietijd. Handhaaf normothermie gedurende de hele procedure. Pas de debieten progressief aan om een perfusie-index van 2,5 l/min/m2 te bereiken. Start de mechanische ventilatie opnieuw op met een FIO2 van 50% en een tv van 6 ml/kg.
OPMERKING: Wijzig deze instellingen volgens het experimentele ontwerp.
- Infundeer continu 10 μg/kg/min dopamine en 4 eenheden/min vasopressine IV. Gebruik epinefrine en noradrenaline tijdens de eerste perfusie en titreer ze vervolgens indien nodig om te helpen bij de drukregulatie met behoud van de arteriële druk boven 50 mmHg.
5. Handhaving van de reperfusie en doelstellingen voor het spenen
- Reperfuse het hart gedurende 30 minuten voordat u probeert te spenen voor NRP. Als het spenen niet succesvol is, voer dan nog eens 15 minuten reperfusie uit ter ondersteuning van NRP voordat u opnieuw probeert te spenen voor een totale maximale reperfusietijd van 180 minuten.
- Ga verder met cardiale beoordeling na succesvol spenen. Als het spenen na deze tijd niet wordt bereikt, stopt u het experiment en meldt u het probleem.
OPMERKING: Dit moet worden aangepast aan de doelstellingen van elke onderzoeker.
- Evalueer de criteria voor het afspenen van NHP's en zorg ervoor dat aan alle criteria wordt voldaan, zoals beschreven in tabel 1.
6. Beoordeling van hartherstel
- Genereer druk-volume (PV) lusanalyses om de cardiale contractiliteit te meten. De geleidingskatheter maakt continue metingen van LV-PV-relaties mogelijk.
- Verkrijg steady-state opnames om volumeafhankelijke parameters, slagwerk en ontwikkelde druk te genereren, en sluit de IVC af met een navelstrengtape om volume-onafhankelijke parameters te genereren door occlusie, namelijk voorbelasting rekruteerbaar slagwerk.
- Meet de centrale veneuze druk, de druk van de longslagader, de cardiale output, de RV-druk en de pulmonale capillaire wigdruk met behulp van de Swans-Ganz-katheter die in het begin van het experiment werd geïntroduceerd.
- Analyseer de hartfunctie door middel van echocardiografie met behulp van een standaard transesofageale sonde en een transthoracale sonde die rechtstreeks op het hart wordt geplaatst.
- Voer metabole beoordelingen uit door arteriële en veneuze bloedmonsters te verzamelen voor analyses. Trek bloed rechtstreeks uit de coronaire sinus om de metabolische functie van het hart specifiek te beoordelen. Analyseer bloedgassen en lactaatniveaus.
- Verzamel bovendien myocardiale biopsieën van de RV en LV indien nodig. Verkrijg monsters van andere transplanteerbare organen van belang (bijv. Longen, lever, nieren), afhankelijk van de doelstellingen van de onderzoeker.
7. NRP-verwijdering en cardiale evaluatie
- Wanneer aan de criteria voor het spenen is voldaan, stopt u met NRP. Verwijder de canule uit de RA en draai de hechtdraad snel aan om bloedverlies te minimaliseren. Zet de hechting vast met knopen en volg dezelfde procedure om de aortacanule te verwijderen.
- Evalueer de hartfunctie elke 30 minuten gedurende 2 uur nadat de NRP is gestopt, zoals beschreven in stap 6.1. tot en met 6.4.
8. Beëindiging van het experiment
- Plaats na 2 uur een cardioplegiekatheter van 16 G of 18 G in de oplopende aorta. Sluit de canule aan op het NRP-circuit.
- Decomprimeer daarna de rechter hartholten door het IVC in te snijden en de linkerholte door het linkeratrium in te snijden met behulp van de cauterie.
- Klem de opgaande aorta na het inbrengen van de canule en dien 1,5 l Del Nido cardioplegie-oplossing bij 4 °C toe aan het hart. Zorg ervoor dat de perfusiedruk 50 mmHg is.
- Stop de mechanische ventilatie en plaats ijsslush (0,9% NaCl) in de thoracale holte na het begin van cardioplegie voor koeling. Ga verder met cardectomie op een traditionele manier zodra de cardioplegie-infusie is voltooid.
- Gebruik het verzamelde hart om uitgebreide myocardiale biopsieën te verkrijgen voor beoordeling en evaluatie. Voer andere biopsieën uit van andere organen (bijv. Longen, lever, nieren), afhankelijk van het experimentele ontwerp en de doelstelling van de onderzoekers
OPMERKING: Figuur 1 geeft een samenvatting van de getoonde protocolstappen en tabel 1 geeft een definitie van de parameters en criteria die in dit onderzoek zijn gebruikt.

Figuur 1: Schematische samenvatting van het experimentele protocol. Afkortingen: NRP = Normothermic Regional Perfusion. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Definitie/Criteria |
| Functionele warme ischemie periode | Periode die begint wanneer de systolische druk 50 mmHg < en eindigt wanneer NRP wordt geïnitieerd. In dit protocol is deze periode 15 min |
| Circulatiestilstand | Het wordt vastgesteld wanneer het hart in asystolie of in ventriculaire fibrillatie is |
| Stand-off periode | Periode die begint met de circulatiestilstand en eindigt met de aangifte van overlijden. In dit protocol is deze periode 5 min |
| Succesvol NRP spenen | Minimaal gebruik van inotropen en vasopressoren |
| BI > 2,2 L/min/m2 |
| KAART > 55 mmHg |
| RAP < 15 mmHg |
| PCWP < 15 mmHg |
| Normale LV en RV-functie |
Tabel 1: Representatieve definitie van de in dit protocol gebruikte parameters en criteria. Afkortingen: CI = Cardiac Index; MAP = gemiddelde arteriële druk; NRP = Normothermische regionale perfusie; PCWP = pulmonale capillaire wigdruk; RAP = Juiste Boezemdruk.