Method Article

Onderzoek naar drivers van antireward in verslavingsgedrag met anatomisch specifieke eencellige genexpressiemethoden

DOI:

10.3791/64014

⸱

August 4th, 2022

 ,  ,  , 
1Daniel Baugh Institute for Functional Genomics and Computational Biology, Department of Pathology, Anatomy, and Cell Biology, Thomas Jefferson University, 2Sidney Kimmel Medical College, Thomas Jefferson University, 3Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, Stanford University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De combinatie van laser capture microdissectie en microfluïdische RT-qPCR biedt anatomische en biotechnische specificiteit bij het meten van het transcriptoom in enkele neuronen en glia. Het toepassen van creatieve methoden met de biologische benadering van een systeem voor psychiatrische ziekten kan leiden tot doorbraken in begrip en behandeling, zoals de neuro-inflammatie antireward hypothese bij verslaving.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Toenemende percentages van verslavingsgedrag hebben zowel onderzoekers als clinici in de geestelijke gezondheidszorg gemotiveerd om antireward en herstel te begrijpen. Deze verschuiving weg van beloning en begin vereist nieuwe perspectieven, paradigma's en hypothesen, samen met een uitbreiding van de methoden die worden toegepast om verslaving te onderzoeken. Hier geven we een voorbeeld: een systeembiologische benadering om antireward te onderzoeken die laser capture microdissection (LCM) en high-throughput microfluïdische reverse transcriptie kwantitatieve polymeraseketenreacties (RT-qPCR) combineert. Genexpressie netwerkdynamiek werd gemeten en een belangrijke aanjager van neuroviscerale ontregeling in alcohol- en opioïde ontwenning, neuro-inflammatie, werd geïdentificeerd. Deze combinatie van technologieën biedt anatomische en fenotypische specificiteit bij eencellige resolutie met een hoge doorvoergevoeligheid en specifieke genexpressiemetingen die zowel hypothesegenererende datasets als mechanistische mogelijkheden opleveren die kansen genereren voor nieuwe inzichten en behandelingen.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Verslaving blijft een groeiende uitdaging in de ontwikkelde wereld 1,2. Ondanks grote wetenschappelijke en klinische vooruitgang, blijft het aantal verslavingen toenemen, terwijl de werkzaamheid van gevestigde behandelingen stabiel blijft op zijn best 3,4,5. Vooruitgang in de biotechnologie en wetenschappelijke benaderingen hebben echter geleid tot nieuwe methoden en hypothesen om de pathofysiologie van stofafhankelijkheid verder te onderzoeken 6,7,8

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd uitgevoerd in overeenstemming met de aanbevelingen van animal care and use committee (IACUC) van thomas jefferson university. Het protocol werd goedgekeurd door Thomas Jefferson University IACUC.

1. Diermodel

  1. Huis mannetje Sprague Dawley (>120 g, Harlan, Indianapolis, IN, VS) rat drieling individueel met vrije toegang tot ethanol-chow (2 ratten) of control-chow mengsel (1 rat).
    OPMERKING: Dit representatieve experiment gebruikte het Lieber-DeCarli-protocol om de neurobiologie van alcoholontwenning te bestuderen25,26. Rat drieling bestaa....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Validatie van single-cell collectie wordt visueel uitgevoerd tijdens LCM-procedures. Celkernen worden beoordeeld op het QC-station. Het celtype kan worden bepaald door de emissie van gelabelde fluorofoor voor dat celtype en de algemene morfologie ervan. Als niet-gewenste cellen op de dop zijn geselecteerd, kan hun genetisch materiaal worden vernietigd met een UV-laser op het QC-station. Verdere validatie door moleculaire analyse is ook noodzakelijk. In dit representatieve voorbeeld16 werden twee s.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alcoholgebruiksstoornis blijft een uitdagende ziekte om te behandelen. Onze groep heeft deze aandoening benaderd door antirewardprocessen te onderzoeken met een systeem neurowetenschappelijk perspectief. We maten genexpressieveranderingen in enkele NTS-neuronen en microglia in een alcoholontwenningstijdreeks16. De NTS werd gekozen vanwege zijn prominente rol in de autonome ontregeling die optreedt bij alcoholontwenningssyndroom. We combineren LCM met eencellige microfluïdische RT-qPCR waardoor rob.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het hier gepresenteerde werk werd gefinancierd door NIH HLB U01 HL133360 toegekend aan JS en RV, NIDA R21 DA036372 toegekend aan JS en EVB, T32 AA-007463 toegekend aan Jan Hoek ter ondersteuning van SJO's, en National Institute of Alcoholism and Alcohol Abuse: R01 AA018873.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
20X DNA Binding DyeFluidigm100-7609NA
2x GE Assay Loading ReagentFluidigm85000802-RNA
96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression (referred to as qPCR chip in text)FluidigmBMK-M-96.96NA
Anti-Cd11β AntibodyGenway BiotechCCEC48Microglia Stain
Anti-NeuN Antibody, clone A60EMD MilliporeMAB377Neuronal Stain
Anti-tyrosine hydroxylase antibodyabcamab112Stain for TH+ neurons
ArcturusXT Laser Capture Microdissection SystemArcturusNANA
Biomark HDFluidigmNART-qPCR platform
Bovine Serum AntigenSigma-AldrichB4287
CapSure Macro LCM CapsThermoFisher Scientific LCM0211NA
CellDirect One-Step qRT-PCR KitThermoFisher Scientific11753500Lysis buffer solution components
CellsDirect Resuspension & Lysis Buffer KitThermoFisher Scientific11739010Invitrogen
DAPIThermoFisher Scientific62248Nucleus Stain
DNA Suspension BufferTEKnovaT0221
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) ReadyProbe Secondary Antibody, Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) ReadyProbe Secondary Antibody, Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificR37118Seconadry Antibody
Exonuclease INew Englnad BioLabs, Inc.M0293SNA
ExtracSure Sample Extraction DeviceThermoFisher ScientificLCM0208NA
FisherbrandTM Superfrost Plus Microscope SlidesThermoFisher Scientific22-037-246Plain glass slides
GeneAmp Thin-Walled Reaction TubeThermoFisher ScientificN8010611
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Superclona Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 555ThermoFisher ScientificA28180Seconadry Antibody
IFC ControllerFluidigmNANA
RNaseOutThermoFisher Scientific10777019
SsoFast EvaGreen Supermix with Low RoxBio-RadPN 172-5211NA
SuperScript VILO cDNA Synthesis KitThermoFisher Scientific11754250Contains VILO and SuperScript
T4 Gene 32 ProteinNew Englnad BioLabs, Inc.M0300SNA
TaqMan PreAmp Master MixThermoFisher Scientific4391128NA
TE BufferTEKnovaT0225NA
TempPlate Semi-Skirted 96-Well PCR Plate, 0.2 mLUSA Scientific1402-9700NA

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Substance Use and Mental Health Indicators in the United States: Results from the 2019 National Survey on Drug Use and Health. , Available from: https://www.samhsa.gov/data/ (2020).
  2. Prevalence of Serious Mental Illness (SMI). NIH. 49, Available from: https://www.nimh.nih.gov/health/statistics/mental-illness.shtml (2020).
  3. Mattick, R. P., Kimber, J., Breen, C., Davoli, M. Buprenorphine maintenance versus placebo or methadone maintenance for opioid dependence.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Cell Gene ExpressionAntireward MechanismsAddiction BehaviorLaser Capture MicrodissectionMicrofluidic RT qPCRGene Expression NetworksNeuroinflammationNeuronal SubtypesHousekeeping Gene NormalizationGene Correlation Network

Related Articles