Methodenartikel

Onderzoek naar drivers van antireward in verslavingsgedrag met anatomisch specifieke eencellige genexpressiemethoden

DOI:

10.3791/64014

⸱

4 augustus 2022

 ,  ,  , 
1Daniel Baugh Institute for Functional Genomics and Computational Biology, Department of Pathology, Anatomy, and Cell Biology, Thomas Jefferson University, 2Sidney Kimmel Medical College, Thomas Jefferson University, 3Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, Stanford University School of Medicine

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De combinatie van laser capture microdissectie en microfluïdische RT-qPCR biedt anatomische en biotechnische specificiteit bij het meten van het transcriptoom in enkele neuronen en glia. Het toepassen van creatieve methoden met de biologische benadering van een systeem voor psychiatrische ziekten kan leiden tot doorbraken in begrip en behandeling, zoals de neuro-inflammatie antireward hypothese bij verslaving.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Toenemende percentages van verslavingsgedrag hebben zowel onderzoekers als clinici in de geestelijke gezondheidszorg gemotiveerd om antireward en herstel te begrijpen. Deze verschuiving weg van beloning en begin vereist nieuwe perspectieven, paradigma's en hypothesen, samen met een uitbreiding van de methoden die worden toegepast om verslaving te onderzoeken. Hier geven we een voorbeeld: een systeembiologische benadering om antireward te onderzoeken die laser capture microdissection (LCM) en high-throughput microfluïdische reverse transcriptie kwantitatieve polymeraseketenreacties (RT-qPCR) combineert. Genexpressie netwerkdynamiek werd gemeten en een belangrijke aanjager van neuroviscerale ontregeling in alcohol- en opioïde ontwenning, neuro-inflammatie, werd geïdentificeerd. Deze combinatie van technologieën biedt anatomische en fenotypische specificiteit bij eencellige resolutie met een hoge doorvoergevoeligheid en specifieke genexpressiemetingen die zowel hypothesegenererende datasets als mechanistische mogelijkheden opleveren die kansen genereren voor nieuwe inzichten en behandelingen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Verslaving blijft een groeiende uitdaging in de ontwikkelde wereld 1,2. Ondanks grote wetenschappelijke en klinische vooruitgang, blijft het aantal verslavingen toenemen, terwijl de werkzaamheid van gevestigde behandelingen stabiel blijft op zijn best 3,4,5. Vooruitgang in de biotechnologie en wetenschappelijke benaderingen hebben echter geleid tot nieuwe methoden en hypothesen om de pathofysiologie van stofafhankelijkheid verder te onderzoeken 6,7,8. Recente ontwikkelingen suggereren inderdaad dat nieuwe concepten en behandelingsparadigma's kunnen leiden tot doorbraken met sociale, economische en politieke gevolgen 9,10,11,12.

We onderzochten antireward bij het afkicken van alcohol en opioïde afhankelijkheid 13,14,15,16. Methoden staan centraal in dit paradigma17,18. Laser capture microdissection (LCM) kan afzonderlijke cellen selecteren met een hoge anatomische specificiteit. Deze functionaliteit is een integraal onderdeel van de antirewardhypothese van neuro-inflammatie, aangezien zowel glia als neuronen kunnen worden verzameld en geanalyseerd van dezelfde neuronale subnucleus in hetzelfde dier 13,14,15,16,19. Een relevant deel van het transcriptoom van geselecteerde cellen kan vervolgens worden gemeten met high-throughput microfluïdische reverse transcriptie kwantitatieve polymeraseketenreacties (RT-qPCR) die hoogdimensionale datasets bieden voor computationele analyse die inzicht opleveren in functionele netwerken20,21.

Het meten van een subset van het transcriptoom in neuronen en glia in een specifieke hersenkern genereert een dataset die robuust is in zowel het aantal monsters als de gemeten genen en gevoelig en specifiek is. Deze hulpmiddelen zijn optimaal voor de neurowetenschappelijke benadering van psychiatrische aandoeningen door een systeem, omdat glia, voornamelijk astrocyten en microglia, het afgelopen decennium een centrale rol hebben aangetoond bij neurologische en psychiatrische aandoeningen22,23. Onze aanpak kan de expressieve respons van glia en neuronen gelijktijdig meten over tal van receptoren en liganden die betrokken zijn bij lokale paracriene signalering. Inderdaad, signalering kan worden afgeleid uit deze datasets met behulp van verschillende kwantitatieve methoden zoals fuzzy logic24. Verder kan de identificatie van cellulaire subfenotypes in neuronen of glia en hun functie inzicht geven in hoe hersencellen in specifieke kernen zich organiseren, reageren op en ontregelen op het niveau van één cel. De dynamiek van dit functionele systeem kan ook worden gemodelleerd met tijdreeksexperimenten16. Ten slotte kunnen diermodellen anatomisch of farmacologisch worden verstoord om de benadering van dit systeem een mechanistische voorwaarde te geven.

Representatief experiment:
Hieronder geven we een voorbeeld van de toepassing van deze methoden. Deze studie onderzocht de neuronale en microglia genexpressie van ratten in de solitaire kern (NTS) als reactie op alcoholafhankelijkheid en daaropvolgende terugtrekking16. Rattencohorten bestonden uit 1) Controle, 2) Ethanol-afhankelijk (EtOH), 3) 8 uur onttrekking (Wd), 4) 32 h Wd en 5) 176 h Wd (figuur 1A). Na snelle onthoofding werden hersenstamen gescheiden van de voorhersenen en gecryopiceerd, en plakjes werden gekleurd voor tyrosinehydroxylase-positieve (TH +) neuronen en microglia (figuur 1B). LCM werd gebruikt om zowel TH+ als TH- neuronen en microglia te verzamelen. Alle cellen waren afkomstig van de NTS en geanalyseerd als monsters van 10-celpools. Vier 96 x 96 microfluïdische RT-qPCR dynamische arrays werden uitgevoerd op het RT-qPCR-platform meten 65 genen (figuur 1B-C). Gegevens werden genormaliseerd met behulp van een -ΔΔCt-methode en geanalyseerd met behulp van R, en selectie van één cel werd gevalideerd met moleculaire markers (figuur 1D-E). Technische validatie werd verder geverifieerd door technische replica's geanalyseerd binnen een enkele batch en over batches (figuur 2 en figuur 3). TH+ en TH- neuronen georganiseerd in verschillende subfenotypes met vergelijkbare inflammatoire genclusters, maar verschillend γ-aminoboterzuur (GABA) receptor (R) clusters (Figuur 4 en Figuur 5). Subfenotypen met verhoogde expressie van inflammatoire genclusters waren oververtegenwoordigd bij 32 h Wd, terwijl GABA-receptor (GABAR) expressie laag bleef in langdurige alcoholontwenning (176 h Wd). Dit werk draagt bij aan de antirewardhypothese van alcohol- en opioïdeafhankelijkheid die vermoedt dat interceptieve feedback van de ingewanden bij ontwenning bijdraagt aan de ontregeling van visceraal-emotionele neuronale kernen (d.w.z. NTS en amygdala), wat resulteert in ernstigere autonome en emotionele gevolgen, die bijdragen aan middelenafhankelijkheid (figuur 6).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd uitgevoerd in overeenstemming met de aanbevelingen van animal care and use committee (IACUC) van thomas jefferson university. Het protocol werd goedgekeurd door Thomas Jefferson University IACUC.

1. Diermodel

  1. Huis mannetje Sprague Dawley (>120 g, Harlan, Indianapolis, IN, VS) rat drieling individueel met vrije toegang tot ethanol-chow (2 ratten) of control-chow mengsel (1 rat).
    OPMERKING: Dit representatieve experiment gebruikte het Lieber-DeCarli-protocol om de neurobiologie van alcoholontwenning te bestuderen25,26. Rat drieling bestaat uit een cohort van drie ratten om hetzelfde aantal calorieën te krijgen, maar belandt in verschillende armen van de studie bij opoffering. De drie armen voor deze studie zijn: 1) Controle, 2) Ethanol-afhankelijk (EtOH) en 3) Terugtrekking (Wd) (Figuur 1A). Er zijn vijf totale aandoeningen in deze studie omdat er drie alcoholontwenningstijdpunten zijn (figuur 1A).
    1. Meet om de andere dag het ethanol-chow-mengsel dat door de Wd-rat wordt geconsumeerd en vervang de geconsumeerde hoeveelheid door dezelfde hoeveelheid ethanolmengsel als de EtOH-rattenvoeder. Voeg de equivalente calorische hoeveelheid controlemengsel toe aan de feeder van de control rat.
      OPMERKING: Het gemiddelde dagelijkse ethanolverbruik is ongeveer 12-16 g / kg na 3 weken26.
    2. Na stabiele langdurige ethanolconsumptie en -afhankelijkheid (>5 weken), induceer acute alcoholontwenning bij Wd rat door zijn of haar voedselcontainer te legen en te vullen met een controlemengsel. Voer dit op zo'n manier uit dat alle drie de ratten worden geofferd op hetzelfde circadiane tijdstip21.
    3. Offer op het vooraf gekozen tijdstip alle drie de ratten in het triplet op hetzelfde tijdstip (Control, EtOH en Wd).

2. Monster oogsten

  1. Oogst hersenen op hetzelfde circadiane tijdstip voor elke rat triplet op het juiste Wd-tijdstip (8 h, 32 h, 176 h).
    1. Bereid een methanol- en droogijsbad voor voor snelle koeling van vers weefsel om de RNA-integriteit te behouden. Aan de kant gezet.
    2. Zet de rat in isofluraan tank (5% in zuurstof) voor ~ 30 s of totdat bewustzijnsverlies optreedt, zoals aangegeven door de verminderde ademhalingsfrequentie en afwezigheid van motorische activiteit. Zet de rattenkop in een goed geslepen guillotine om snel te onthoofden.
    3. Open de schedel van het dier om de hersenen te ontleden met behulp van een tang. Verwijder het cerebellum uit de frisse hersenen met een handscheermes door grof te snijden en gooi het weg. Door transversale incisie snijdt u de hersenstam van de voorhersenen.
      OPMERKING: Een handscheermes kan verder worden gebruikt om de voorhersenen of hersenstam in linker- en rechterhersenhelften te hemi-sekten volgens het experimentele ontwerp. Bijvoorbeeld om bevindingen van één hemisfeer met verschillende methoden te valideren, links-rechts divergentie te onderzoeken of het aantal monsters te verhogen.
    4. Voeg een optimale snijtemperatuur (O.C.T.) medium toe tot ongeveer 3-4 cm diepte in de weefselinbeddingsvorm, zodat het weefselmonster volledig kan worden ondergedompeld. Plaats het weefsel, de voorhersenen en/of de hersenstam, in de weefselinbeddingsvorm en voeg meer O.C.T. toe om het weefselmonster volledig te bedekken.
    5. Voeg de plastic weefselinbeddingsvorm met het weefselmonster (rattenvoorhersenen) toe aan het koelbad van droogijs en methanol om het weefselmonster onmiddellijk in te vriezen. Laat het weefselmonster in de insluitvorm in het koelbad blijven totdat de weefselverzameling is voltooid, maar niet langer dan 15 minuten.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat methanol niet in de weefselcontainer terechtkomt.
    6. Bewaar weefselmonsters snel bij -80 °C.
      OPMERKING: Microfluïdische RT-qPCR meet genexpressie door mRNA-transcripten te versterken en te meten. Deze transcripties zijn relatief onstabiel, dus er worden veel stappen in dit proces genomen om het monster zo koud mogelijk te houden om mRNA-afbraak te voorkomen.

3. Cryosectie

OPMERKING: Een neuronale kern van een rat is ongeveer 10 μm. 10 μm is dus de optimale plakdikte voor dit diermodel. De plakdikte wordt aangepast volgens het diermodel voor het onderzoek.

  1. Haal uit de vriezer van -80 °C de weefselinsluitende schimmel die bevroren hersenstam bevat en ontdooi het monster bij -20 °C in cryostaat gedurende 5-10 minuten. Voer deze vries-dooi tot -20 °C slechts één keer uit voor mRNA-conservering.
  2. Snijd met een handscheermes verticaal de hoeken van de plastic insluitvorm. Verwijder de hersenstam ingebed in O.C.T. uit de plastic weefselinsluitende mal. Gebruik op de klauwplaat van de cryostaat ingesteld op -20 °C vloeistof op kamertemperatuur O.C.T. als lijm om de hersenstam in de rostrale tot caudale richting te monteren voor coronale cryosectie.
  3. Snijd 10 μm coronale cryosecties in de rostrale tot caudale richting van de hersenstam van de rat totdat secties met het gebied van belang (NTS) zijn bereikt. De hoogte en breedte van deze cryosecties zijn ~200 mm op basis van de afmetingen van de kunststof inbouwmal.
  4. Verzamel de 10 μm cryosecties van hersenstamweefsel die de NTS bevatten, of een ander interessant gebied op basis van de studie, door ontdooiing te monteren op gewone glazen dia's op kamertemperatuur. Plaats deze dia's met secties snel in een koelende metalen pan die bovenop droogijs ligt. Plaats zo snel mogelijk glazen glaasjes met cryosecties in een vriezer van -80 °C voor opslag.
    OPMERKING: Een enkele glazen dia kan meerdere cryosecties van 10 μm passen, omdat de breedte en hoogte ~ 200 mm is. Dezelfde dia kan dus cryosecties bevatten die gekleurd zijn voor verschillende celtypen.
    1. Wanneer er meerdere secties op de dia staan, zorg er dan voor dat ze gescheiden zijn door 100 mm lege ruimte. Om een rand tussen de cryosecties te maken, gebruikt u een hydrofobe pen. Dit maakt verschillende antilichaamoplossingen voor kleuring mogelijk voor verschillende celtypen op dezelfde glasplaat. Houd 20 mm ruimte aan voor de cryosectie vanaf de rand van de glasplaat.

4. Immunofluorescentiekleuring van afzonderlijke cellen

  1. Gebruik een snel kleuring immunofluorescentieprotocol op cryosecties in de hersenen om de gewenste hersenceltypen (neuronen, microglia, astrocyten, enz.) te labelen voor verzameling met behulp van LCM.
    OPMERKING: Het immunohistochemische kleuringsprotocol dat voor deze experimenten wordt gebruikt, is ontworpen om snel te zijn om overmatige mRNA-afbraak tijdens dit proces te voorkomen.
    1. Haal uit de vriezer van -80 °C glazen dia's met 10 μm cryosecties van de hersenstam van ratten die NTS bevatten. Dompel glijden gedurende 30 s in 75% ethanolbad om gecryopiceerd weefsel te fixeren. Verwijder overtollige vloeistof.
    2. Breng op het vaste cryosectioned hersenstamweefsel 2% Bovine Serum Albumin (BSA) aan in fosfaatbufferzoutoplossing (PBS) gedurende 30 s voor het blokkeren van ongerichte binding van antilichamen. Daarna wassen met PBS.
    3. Breng voldoende primaire antilichaamoplossing aan om het cryosectieweefsel (nu vast en geblokkeerd) te bedekken. Incubeer het weefselgedeelte in primaire antilichaamoplossing gedurende 2 minuten. Was de tissue eenmaal met 2% BSA-oplossing. De primaire antilichaamoplossing bevat 96% van de BSA-PBS-oplossing voor blokkering, 3% primair antilichaam en 1% RNase-remmer. Primair antilichaam werd verdund in een verhouding van 1:25.
      OPMERKING: In dit representatieve experiment bestaan primaire antilichamen uit anti-NeuN-antilichaam en anti-Cd11β-antilichaam. Neuronen werden verder onderverdeeld in TH + en TH- subgroepen, dus primaire antilichaamoplossingen voor neuronale kleuring bevatten 93% van de BSA PBS-oplossing, 3% anti-NeuN-antilichaam, 3% anti-tyrosinehydroxylase-antilichaam en 1% RNase Out.
    4. Breng voldoende secundaire antilichaamoplossing (1:200) aan om het hersenstamweefsel te bedekken. Laat de secundaire antilichaamoplossing het weefsel baden. Was na 3 minuten de tissue eenmaal met 2% BSA-oplossing.
      OPMERKING: De oplossing die het secundaire antilichaam bevat, bestond uit 196,5 μL 2% BSA, 1 μL geitenantimuis 555 nm fluorescerende tag voor celtype, 1 μL ezel anti-konijn Alexa 488 nm voor TH-kleuring, 2,5 μL RNase-remmer en 1,3 μL DAPI (1:10000).

5. Standaardseries voor dehydratie van ethanol- en xyleenweefsel

  1. Plaats glazen glaasjes waarop het gebrandschilderde cryosectieweefsel gedurende 30 s in een 75% ethanolbad rust, gevolgd door plaatsing in 95% ethanolbad gedurende 30 s, een 100% ethanolbad gedurende 30 s en ten slotte een 100% ethanol beide gedurende 30 s (in een tweede container).
  2. Giet na het voltooien van de ethanol dehydratieserie twee verse 100% xyleenbaden. Plaats vervolgens de glasglaasjes gedurende 1 minuut in het eerste xyleenbad. Verwijder snel en plaats de glaasjes gedurende 4 minuten in het andere verse xyleenbad.
  3. Neem glazen dia's met gebrandschilderde en gedehydrateerde weefsel cryosecties uit xyleen en plaats in een donkere maar geventileerde container gedurende 5 minuten om aan de lucht te drogen. Plaats na het drogen aan de lucht de glasglijders gedurende 5 minuten in een exsiccator voor de laatste droging.

6. Selecteer afzonderlijke cellen met behulp van laser capture microdissection (LCM)

  1. Plaats een glasplaat met gebrandschilderde, vaste en gedehydrateerde weefsel cryosecties in de LCM microscoopmonsterhouder. Gebruik anatomische oriëntatiepunten om de interesseregio te lokaliseren van waaruit celverzameling zal plaatsvinden (NTS in dit representatieve voorbeeld).
  2. Schakel microscoopfluorescentie in en vind gekleurde celtypen van belang. Zorg ervoor dat de kern van de gewenste cel zich in het interessegebied bevindt en geïsoleerd is van de kernen van andere cellen met een afstand >3 mm. Identificeer en markeer één cel (als het experiment echt eencellig is) of meerdere cellen (als het experiment vereist dat gepoolde eencellige monsters [d.w.z. eencellige schaal] zoals aangetoond in dit representatieve experiment) worden verzameld met behulp van de LCM-software.
    OPMERKING: Monsters bestaande uit 10-celpools werden gebruikt in dit representatieve experiment. Dit wordt gedaan om de genexpressievariabiliteit tussen monsters te verminderen en het aantal geanalyseerde enkele cellen te verhogen, hoewel dit nog steeds een experiment op eencellige schaal blijft. Echte eencellige experimenten kunnen met deze methode worden voltooid20,27. Bovendien kunnen ook grotere weefselsecties worden geselecteerd21.
  3. Nadat de gewenste cellen zijn geselecteerd, gebruikt u de LCM-robotarm en plaatst u de LCM-dop op het interessegebied op de gemarkeerde weefselcrysectie.
  4. Kalibreer de intensiteit en targeting van de infraroodlaser (IR) met behulp van testopnamen.
    OPMERKING: Dit wordt voor elk monster gedaan. Kalibratie moet worden uitgevoerd op een deel van de dop dat zich niet direct boven het weefsel bevindt om niet per ongeluk niet-experimenteel weefsel te selecteren.
    1. Om de intensiteit te kalibreren, past u de duur, sterkte en grootte van de IR-laseropname aan, zodat een opname alleen de doplijm voldoende smelt om een enkele cellulaire kern te selecteren en ook sterk genoeg is om de dop te smelten naar de cryosectie op de dia. Deze waarden zijn voor elke cap anders.
    2. Kalibreer targeting door het laserkruisharen precies daar te lokaliseren waar de laser de dop heeft gesmolten.
  5. Verzamel de cellen die zijn geïdentificeerd door de LCM-infraroodlaser af te vuren om de dop op het cryosectieve weefsel over die cellen te smelten. Zorg ervoor dat alleen geselecteerde cellen uit het weefselsegment zijn getild door de robotarm te gebruiken om de dop naar het kwaliteitscontrolegebied (QC) van de LCM-microscoop te lokaliseren. Om overtollige cellen op de dop te verwijderen, gebruikt u ultraviolette (UV) laser om het genetisch materiaal van de extra cellen te wissen.
  6. Neem anatomische specificiteit op met de LCM-softwarecamera. Maak een foto van het gecrycregeerde weefsel waaruit de cel (en) is verwijderd.
  7. Gebruik een anatomische atlas (een atlas van de voorhersenen van de rat in dit voorbeeld) om de afstand van dit plakje weefsel tot bregma te bepalen en noteer deze informatie als de Z-afstand28. Bepaal de locatie in het X- en/of Y-vlak van de foto om de geselecteerde cel volledig te lokaliseren.
  8. Verwijder met gehandschoende handen de LCM-dop uit het QC-gebied. Bevestig vervolgens het monsterextractieapparaat aan de LCM-dop. Gebruik een pipet om 5,5 μL lysisbuffer op de geselecteerde cel(en) aan te brengen. Dit wordt nu de steekproef genoemd.
    OPMERKING: Lysisbufferoplossing bestaat uit 5 μL resuspensiebuffer samen met 0,5 μL lysisversterker.
  9. Plaats een microcentrifugebuis van 0,5 ml op het monsterextractieapparaat dat aan de LCM-dop is bevestigd. Plaats deze opstelling op een kookplaat van 75 °C met het monster en de lysisbuffer dichter bij de plaat. Laat het monster 15 min opwarmen.
  10. Gebruik een centrifuge met lage snelheid van 0,01-0,02 x g om het monster en de lysisbuffer naar beneden te laten draaien in de bodem van de microcentrifugebuis van 0,5 ml. Bewaar het monster bij -80 °C tot microfluïdische qPCR.

7. Voer qPCR-chip uit op een microfluïdische RT-qPCR op het platform

  1. Om genexpressie voor eencellige monsters te meten, voert u mRNA-pre-amplificatie uit zoals hieronder beschreven.
    OPMERKING: Het protocol omvat geen mRNA-extractie omdat de monsters afzonderlijke cellen zijn die een zeer lage hoeveelheid RNA (10 pg) bevatten, die verloren gaan tijdens de mRNA-isolatiestap. De afzonderlijke cellen worden gelyseerd en direct overgezet voor reverse transcriptie om het monsterverlies te minimaliseren.
    1. Maak een primerpool door de mRNA qPCR-genprimers (vooruit en achteruit) toe te voegen voor elk gen dat wordt getest in een microcentrifugebuis van 1,5 ml. Zorg ervoor dat de uiteindelijke concentratie van elke primer 500 nM is. Primers in dit voorbeeldexperiment zijn opgenomen in aanvullende tabel 116.
    2. Pipetteer 1 μL van 5x cDNA-reactiemix in elke put van een 96-well PCR-plaat.
    3. Laat eencellige monsters kort ontdooien (2-3 min) door ze uit de vriezer van -80 °C te halen en op kamertemperatuur te laten staan. Gebruik een centrifuge met lage snelheid van 0,01-0,02 x g om de monsters gedurende 20-30 s te laten draaien. Pipetteer 5,5 μL van elk eencellig monster naar een andere put in de 96-well PCR-plaat.
      OPMERKING: Het monsternummer en het type dat in elke put moet worden geplaatst, wordt bepaald voordat met deze stap wordt begonnen.
    4. De 96-well PCR-plaat heeft nu de cDNA-reactiemix en een eencellig monster toegevoegd aan elke put. Plaats deze plaat gedurende 1,5 minuut bij 65 °C in een thermocycler om het cDNA-reactiemengsel te activeren. Draai de inhoud af met behulp van snelle centrifugatie bij 1.300 x g gedurende 1 minuut bij 4 °C en plaats de PCR-plaat op nat ijs.
    5. Pipetteer in elke put in de PCR-plaat 0,12 μL T4 Gen 32 Protein, 0,73 μL DNA-suspensiebuffer en 0,15 μL 10x cDNA-synthesemastermix. Laat de PCR-plaat het volgende protocol in de thermocycler doorlopen: 25 °C gedurende 5 minuten, 50 °C gedurende 30 minuten, 55 °C gedurende 25 minuten, 60 °C gedurende 5 minuten, 70 °C gedurende 10 minuten en een laatste hold op 4 °C.
      OPMERKING: T4 Gen 32-eiwit (een enkelstrengs DNA (ssDNA) bindend eiwit) is vereist voor bacteriofaag T4-replicatie en -reparatie. Het T4 Gen 32-eiwit werd gebruikt in de reverse transcriptiestap van het protocol om de opbrengst en efficiëntie van reverse transcriptie te verbeteren en de PCR-productopbrengst te verhogen.
    6. Pipet in elke put in de PCR-plaat 7,5 μL Taq polymerase master mix. Hierna pipet in elke put 1,5 μL van de primerpool die in stap 7.1.1 is gemaakt. Laat de PCR-plaat de volgende lineaire voorversterkingsstap in de thermocycler doorlopen: 95 °C gedurende 10 minuten; 22 cycli van: 96 °C gedurende 5 s en 60 °C gedurende 4 minuten.
    7. Pipet in elke put in de PCR-plaat 1,2 μL exonuclease I, 4,2 μL DNA-suspensiebuffer en 0,6 μL 10x exonuclease I-reactiebuffer. Laat de PCR-plaat het volgende protocol in de thermocycler doorlopen: 37 °C gedurende 30 minuten, 80 °C gedurende 15 minuten.
      OPMERKING: Exonuclease katalyseert de verwijdering van nucleotiden uit lineair enkelstrengs DNA in de richting van 3' tot 5'. We gebruiken exonuclease voor het opschonen van monsters voor het verwijderen van niet-geïncorporeerde primers en eventuele enkelstrengs cDNA die aanwezig kunnen zijn na pre-amplificatie.
    8. Pipetteer in elke put in de PCR-plaat 54 μL TE-buffer. Gebruik een snelle centrifuge bij 1.300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C om de inhoud van de PCR-plaat te verlagen.
    9. Als u van plan bent om door te gaan met de volgende fase van het protocol, koelt u de PCR-plaat op 4 °C. Als er meer dan 12 uur is tussen de voltooiing van de pre-amplificatiefase en het begin van de microfluïdische qPCR, dek de qPCR-plaat af en plaats deze in een vriezer van -20 °C.
  2. Maak de monsterplaat (nieuwe 96-well PCR-plaat) voor qPCR-chip zoals hieronder beschreven.
    1. Als de pcr-plaat voorversterking uit stap 7.1 in een vriezer van -20 °C is geplaatst, verwijdert u deze en laat u deze gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur ontdooien.
    2. In een nieuwe 96-well PCR-plaat, pipet in elke put 4,55 μL PCR supermix low rox en 0,45 μL 20x DNA-bindende kleurstof. Pipet vervolgens 3 μL voorversterkt monster van de PCR-plaat gemaakt in stap 7.1. Gebruik high-speed centrifugatie bij 1.300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C om de PCR-plaat naar beneden te draaien en de PCR-monsterplaat op ijs te plaatsen.
  3. Maak een testplaat (een nieuwe 96-well PCR-plaat) voor qPCR-chip zoals hieronder beschreven.
    1. In een nieuwe 96-well PCR-plaat, pipet in elke put 1,25 μL DNA-suspensiebuffer en 3,75 μL 2x assay loading reagens. Pipetteer vervolgens de overeenkomstige qPCR-primer op 2,5 μL van 10 μM primer. Gebruik een hogesnelheidscentrifuge bij 1.300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C om de PCR-plaat af te draaien en de PCR-testplaat op ijs te plaatsen.
  4. Bereid de qPCR-chip voor op het laden in het microfluïdische RT-qPCR-platform zoals hieronder beschreven.
    OPMERKING: De qPCR-chip is een real-time qPCR-platform dat werkt volgens microfluïdische principes. De qPCR-chip is in wezen een matrix van 96 monsterkanalen en 96 RNA qPCR-primerkanalen (d.w.z. assays) die elkaar kruisen in 9.216 (96 x 96) kamers. Een monster en een specifieke test worden gecombineerd in elke kamer van de array waarin een real-time qPCR-reactie optreedt. De uitlezing wordt gegenereerd als drempelwaarden (Ct) waarden en versterkingsplots voor de gebruikte primers.
    1. Injecteer regellijnvloeistof in de qPCR-chip voor priming. Plaats de qPCR-chip in het microfluïdische mengapparaat. Selecteer het prime (136x) script en voer dit programma uit.
    2. Wanneer het programma na ~ 45 minuten is voltooid, verwijdert u de geprimeerde qPCR-chip. Pipetteer in de geprimeerde qPCR-chip 6 μL van de reactie van de PCR-monsterplaat naar de overeenkomstige monsterput in de qPCR-chip.
    3. Pipetteer in de geprimeerde qPCR-chip 6 μL van de reactie van de PCR-testplaat naar de overeenkomstige testput in de qPCR-chip.
      OPMERKING: Luchtbellen kunnen zich vormen aan de onderkant van het monster en testputten in de qPCR-chip, die kunnen voorkomen dat de oplossingen de microfluïdische leidingen binnendringen. Een scherpe naald kan worden gebruikt om deze luchtbellen te laten knallen of verwijderen voordat de qPCR-chip in het microfluïdische mengapparaat wordt geplaatst.
    4. Plaats de qPCR-chip in het microfluïdische mengapparaat. Selecteer het load mix (136x) script en voer dit programma uit.
  5. Laad de qPCR-chip in het microfluïdische RT-qPCR-platform.
    1. Schakel het microfluïdische RT-qPCR-platform in en warm de lamp op (~ 20 min). Verwijder de qPCR-chip uit het microfluïdische mengapparaat. Verwijder de beschermende sticker van de onderkant van de qPCR-chip.
    2. Open het microfluïdische RT-qPCR-platform en laad de qPCR-chip in het microfluïdische RT-qPCR-platform. Voer het snelle 96 x 96 PCR-protocol (30 cycli) uit op het microfluïdische RT-qPCR-platform.
    3. Start de software voor gegevensverzameling - klik op Start een nieuwe run.
    4. Controleer de chip barcode en chip type-klik op Volgende. Klik op het Chip Run-bestand en blader door de bestandslocatie voor de opslag van gegevensverzameling.
    5. Klik op Toepassingstype en selecteer Genexpressie; selecteer ROX voor passieve referentie, selecteer Single Probe en selecteer EvaGreen voor probetype.
    6. Klik om het thermische fietsprogramma te selecteren en selecteer Biomark HD: GE Fast 96x96 PCR+Melt v2.pcl-bestand.

8. Data-analyse

  1. Upload gegevens van de qPCR-chiprun naar de analysesoftware voor QC zoals hieronder beschreven.
    1. Download de data-analysesoftware. Deze is te vinden op de volgende website: https://www.fluidigm.com/products-services/software#. Start de software om het microfluïdische RT-qPCR-experiment te analyseren.
    2. Open chiprun in de software. Open vervolgens het bestand ChipRun.bml dat door het experiment is gemaakt. Er verschijnt een venster met de experimentele details, waaronder de passieve referentie, sonde en het thermische PCR-programma.
      OPMERKING: Kwaliteitscontrole (QC) en gegevensanalyse kunnen worden uitgevoerd op de computer die is aangesloten op het microfluïdische RT-qPCR-platform of door het .bml-bestand via een flashstation of op een andere manier naar een andere computer over te brengen.
  2. Definieer de voorbeeldinstellingen zoals hieronder beschreven.
    OPMERKING: Deze stap maakt een gelabelde sjabloon van monsters en assays (qPCR-primers) voor de procedures voor kwaliteitscontrole (QC) en gegevensanalyse.
    1. Selecteer Chip Explorer > Sample Plate Setup en maak een nieuwe sample plate. Selecteer het juiste containertype en containerformaat (SBS96 voor een plaat met 96 putten die in dit representatieve experiment wordt gebruikt).
    2. Plak de voorbeeldlabels in de softwarespreadsheet volgens het experimentele ontwerp en selecteer Kaart in het menu Taak. Selecteer SBS96-Left.dsp. De voorbeeldinstellingen zijn nu in kaart gebracht. Selecteer Detailweergave > Analyseren om deze wijzigingen in het bestand bij te werken.
      OPMERKING: Wijzigingen in deze software worden pas opgeslagen nadat op de knop Analyseren is geklikt.
  3. Definieer de besturingsvoorbeelden in de software. Selecteer de cellen voor de besturingsvoorbeelden door met de linkermuisknop te klikken en vast te houden terwijl u door de cellen sleept voor selectie. Afzonderlijke cellen kunnen worden geselecteerd door de Ctrl-toets ingedrukt te houden en op afzonderlijke cellen te klikken. Voer voor de RNA-standaardmonsters (verdunningsreeks) de monsternaam en de gebruikte RNA-concentratie in. Klik op Analyseren om op te slaan.
  4. Definieer de detectoropstelling vergelijkbaar met stap 8.2 hierboven, maar met RT-qPCR-testnamen, d.w.z. de namen van de geteste genen. Selecteer Detector Plate Setup en maak een nieuwe testplaat. Selecteer het juiste containertype en -formaat (SBS96 voor een plaat met 96 putten). Plak de testnamen volgens het experimentele ontwerp en klik op Analyseren om op te slaan.
  5. Begin het QC-proces (User Quality Control) zoals hieronder beschreven.
    OPMERKING: Dit representatieve experiment gebruikte een cyclustijd (Ct) drempelmethode. Dat wil zeggen, monsters die geen drempelsignaal hebben bereikt dat door de software (Auto Global) of handmatig (User Global) is gedefinieerd, worden beschouwd als mislukte reacties en niet opgenomen in de dataset.
    1. Selecteer Analyseweergave > taakframe. Wijzig in het deelvenster met analyse-instellingen de instellingen in Automatisch algemeen (berekent automatisch een drempel die wordt toegepast op de hele chip) of Algemeen gebruiker. Stel de basislijncorrectie in op lineaire afgeleide. Als Algemeen gebruikers wordt gebruikt, moet de foutdrempel handmatig worden bepaald, net als in het representatieve experiment.
    2. Dit representatieve experiment gebruikte een QC-regel als volgt: als een individuele test of steekproef een faalpercentage van 70% of meer had, dan was die hele rij of kolom in de dataset mislukt.
    3. Bekijk handmatig elke reactie in de 96 x 96 chip. Visualiseer de versterkingscurven en smeltcurven om te bepalen of elke reactie het verwachte qPCR-patroon volgde. Als de versterkings- of smeltcurve niet overeenkomt met wat wordt verwacht, faalt die reactie dan.
  6. Exporteer de gegevens na QC door Bestand > exporteren te selecteren en sla de gegevensset op als een .csv bestand.
  7. Snoei de gegevensset omdat het geëxporteerde .csv bestand zowel een Pass-Fail-matrix als een matrix met onbewerkte Ct-waarden heeft. Gebruik de pass-fail-matrix om mislukte cellen in de gegevensset te vervangen door NA.
  8. Download de meest recente versie van open-source R-software en download vervolgens de R-Studio-toepassing. Upload de genormaliseerde dataset naar R. Analyseer gegevens zoals geschikt voor het onderzoek.
  9. Normaliseer de dataset met behulp van de methode -ΔΔCt zoals hieronder beschreven.
    OPMERKING: Mediane centrering of huishoudgennormalisatie kan in een steekproefrij worden gebruikt om een -ΔCt-waarde te genereren. In het representatieve experiment werd mediane centrering gebruikt en gevalideerd door huishoudgennormalisatie. Dit kan in .csv formaat of door te uploaden naar een data-analyse software.
    1. Bereken voor mediane centrering de mediane Ct-waarde die wordt berekend op basis van alle Ct-waarden voor een individueel monster (pool met 10 cellen). Trek vervolgens alle afzonderlijke Ct-waarden af van deze mediaanwaarde. Dit levert een -ΔCt-waarde op.
    2. Bereken voor de normalisatie van het huishoudgen de gemiddelde expressie van de huishoudgenen (Actb, Gapdh en Ldha in het representatieve experiment) voor elk monster en gebruik deze waarde als degene waarvan de individuele Ct-waarden moeten worden afgetrokken.
    3. Als u een -ΔΔCt-waarde wilt genereren, neemt u de mediaan van elke testkolom, die nu det-waarde - ΔC bevat. Trek de testmediaan af van elke -ΔCt-waarde om een -ΔΔCt-waarde te produceren.
  10. Bereken z-scores voor elke -ΔΔCt-waarde met behulp van de schaalfunctie in R. Gebruik de R-heatmapfunctie of een afzonderlijke software om een heatmap te genereren.
  11. Gebruik de Pearson-correlatiefunctie om Pearson-correlaties tussen elk gen te berekenen. Gebruik de smeltfunctie in R om de gegevensset te ordenen voor andere functionaliteit. Exporteer deze gegevens en upload ze naar een gencorrelatienetwerksoftware.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Validatie van single-cell collectie wordt visueel uitgevoerd tijdens LCM-procedures. Celkernen worden beoordeeld op het QC-station. Het celtype kan worden bepaald door de emissie van gelabelde fluorofoor voor dat celtype en de algemene morfologie ervan. Als niet-gewenste cellen op de dop zijn geselecteerd, kan hun genetisch materiaal worden vernietigd met een UV-laser op het QC-station. Verdere validatie door moleculaire analyse is ook noodzakelijk. In dit representatieve voorbeeld16 werden twee s...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alcoholgebruiksstoornis blijft een uitdagende ziekte om te behandelen. Onze groep heeft deze aandoening benaderd door antirewardprocessen te onderzoeken met een systeem neurowetenschappelijk perspectief. We maten genexpressieveranderingen in enkele NTS-neuronen en microglia in een alcoholontwenningstijdreeks16. De NTS werd gekozen vanwege zijn prominente rol in de autonome ontregeling die optreedt bij alcoholontwenningssyndroom. We combineren LCM met eencellige microfluïdische RT-qPCR waardoor rob...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het hier gepresenteerde werk werd gefinancierd door NIH HLB U01 HL133360 toegekend aan JS en RV, NIDA R21 DA036372 toegekend aan JS en EVB, T32 AA-007463 toegekend aan Jan Hoek ter ondersteuning van SJO's, en National Institute of Alcoholism and Alcohol Abuse: R01 AA018873.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
20X DNA Binding DyeFluidigm100-7609NA
2x GE Assay Loading ReagentFluidigm85000802-RNA
96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression (referred to as qPCR chip in text)FluidigmBMK-M-96.96NA
Anti-Cd11β AntibodyGenway BiotechCCEC48Microglia Stain
Anti-NeuN Antibody, clone A60EMD MilliporeMAB377Neuronal Stain
Anti-tyrosine hydroxylase antibodyabcamab112Stain voor TH+ neuronen
ArcturusXT Laser Capture Microdissection SystemArcturusNANA
Biomark HDFluidigmNART-qPCR platform
Bovine Serum AntigenSigma-AldrichB4287
CapSure Macro LCM CapsThermoFisher Scientific LCM0211NA
CellDirect One-Step qRT-PCR KitThermoFisher Scientific11753500Lysis buffer oplossing componenten
CellsDirect Resuspension & Lysis Buffer KitThermoFisher Scientific11739010Invitrogen
DAPIThermoFisher Scientific62248Kernkleuring
DNA Suspension BufferTEKnovaT0221
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) ReadyProbe Secondary Antibody, Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) ReadyProbe Secondary Antibody, Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificR37118Secundair Antilichaam
Exonuclease INew England BioLabs, Inc.M0293SNA
ExtracSure Sample Extraction DeviceThermoFisher ScientificLCM0208NA
FisherbrandTM Superfrost Plus MicroscoopglazenThermoFisher Scientific22-037-246Vlak glasplaten
GeneAmp Thin-Walled Reaction TubeThermoFisher ScientificN8010611
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Superclona Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 555ThermoFisher ScientificA28180Secundair Antilichaam
IFC ControllerFluidigmNANA
RNaseOutThermoFisher Scientific10777019
SsoFast EvaGreen Supermix with Low RoxBio-RadPN 172-5211NA
SuperScript VILO cDNA Synthesis KitThermoFisher Scientific11754250Bevat VILO en SuperScript
T4 Gene 32 ProteinNew England BioLabs, Inc.M0300SNA
TaqMan PreAmp Master MixThermoFisher Scientific4391128NA
TE BufferTEKnovaT0225NA
TempPlate Semi-Skirted 96-Well PCR Plate, 0.2 mLUSA Scientific1402-9700NA

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Substance Use and Mental Health Indicators in the United States: Results from the 2019 National Survey on Drug Use and Health. , Available from: https://www.samhsa.gov/data/ (2020).
  2. Prevalence of Serious Mental Illness (SMI). NIH. 49, Available from: https://www.nimh.nih.gov/health/statistics/mental-illness.shtml (2020).
  3. Mattick, R. P., Kimber, J., Breen, C., Davoli, M. Buprenorphine maintenance versus placebo or methadone maintenance for opioid dependence. Cochrane Database of Systematic Reviews. Mattick, R. P. , John Wiley & Sons, Ltd. (2008).
  4. Mattick, R. P., Breen, C., Kimber, J., Davoli, M. Methadone maintenance therapy versus no opioid replacement therapy for opioid dependence. The Cochrane Database of Systematic Reviews. 2009 (3), (2009).
  5. Miller, P. M., Book, S. W., Stewart, S. H. Medical treatment of alcohol dependence: A systematic review. International Journal of Psychiatry in Medicine. 42 (3), 227-266 (2012).
  6. Holmes, E. A., et al. The Lancet Psychiatry Commission on psychological treatments research in tomorrow's science. The Lancet. Psychiatry. 5 (3), 237-286 (2018).
  7. Ford, C. L., Young, L. J. Translational opportunities for circuit-based social neuroscience: advancing 21st century psychiatry. Current Opinion in Neurobiology. 68, 1-8 (2021).
  8. Holmes, E. A., Craske, M. G., Graybiel, A. M. Psychological treatments: A call for mental-health science. Nature. 511 (7509), 287-289 (2014).
  9. Miranda, A., Taca, A. Neuromodulation with percutaneous electrical nerve field stimulation is associated with reduction in signs and symptoms of opioid withdrawal: a multisite, retrospective assessment. The American Journal of Drug and Alcohol Abuse. 44 (1), 56-63 (2018).
  10. Metz, V. E., et al. Effects of ibudilast on the subjective, reinforcing, and analgesic effects of oxycodone in recently detoxified adults with opioid dependence. Neuropsychopharmacology. 42 (9), 1825-1832 (2017).
  11. Heinzerling, K. G., et al. placebo-controlled trial of targeting neuroinflammation with ibudilast to treat methamphetamine use disorder. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 15 (2), 238-248 (2020).
  12. Bogenschutz, M. P., et al. Psilocybin-assisted treatment for alcohol dependence: A proof-of-concept study. Journal of Psychopharmacology. 29 (3), 289-299 (2015).
  13. O'Sullivan, S. J., Schwaber, J. S. Similarities in alcohol and opioid withdrawal syndromes suggest common negative reinforcement mechanisms involving the interoceptive antireward pathway. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 125, 355-364 (2021).
  14. O'Sullivan, S. J. Single-cell systems neuroscience: A growing frontier in mental illness. Biocell. 46 (1), 7-11 (2022).
  15. O'Sullivan, S. J., et al. Single-cell glia and neuron gene expression in the central amygdala in opioid withdrawal suggests inflammation with correlated gut dysbiosis. Frontiers in Neuroscience. 13, 665(2019).
  16. O'Sullivan, S. J., McIntosh-Clarke, D., Park, J., Vadigepalli, R., Schwaber, J. S. Single cell scale neuronal and glial gene expression and putative cell phenotypes and networks in the nucleus tractus solitarius in an alcohol withdrawal time series. Frontiers in Systems Neuroscience. 15, 739790(2021).
  17. O'Sullivan, S. J., Reyes, B. A. S., Vadigepalli, R., Van Bockstaele, E. J., Schwaber, J. S. Combining laser capture microdissection and microfluidic qpcr to analyze transcriptional profiles of single cells: A systems biology approach to opioid dependence. Journal of Visualized Experiments. (157), e60612(2020).
  18. Achanta, S., Vadigepalli, R. Single cell high-throughput qRT-PCR protocol. Protocols.io. , (2020).
  19. O'Sullivan, S. J. The interoceptive antireward pathway and gut dysbiosis in addiction. Journal of Psychiatry, Depression & Anxiety. 7 (40), 1-5 (2021).
  20. Park, J., et al. Single-cell transcriptional analysis reveals novel neuronal phenotypes and interaction networks involved in the central circadian clock. Frontiers in Neuroscience. 10, 481(2016).
  21. Staehle, M. M., et al. Diurnal patterns of gene expression in the dorsal vagal complex and the central nucleus of the amygdala - Non-rhythm-generating brain regions. Frontiers in Neuroscience. 14, 375(2020).
  22. Réus, G. Z., et al. The role of inflammation and microglial activation in the pathophysiology of psychiatric disorders. Neuroscience. 300, 141-154 (2015).
  23. Zhang, X., et al. Role of astrocytes in major neuropsychiatric disorders. Neurochemical Research. 46 (10), 2715-2730 (2021).
  24. Park, J., Ogunnaike, B., Schwaber, J., Vadigepalli, R. Identifying functional gene regulatory network phenotypes underlying single cell transcriptional variability. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 117 (1), 87-98 (2015).
  25. Lieber, C. S., DeCarli, L. M. An experimental model of alcohol feeding and liver injury in the baboon. Journal of Medical Primatology. 3 (3), 153-163 (1974).
  26. Lieber, C. S., Decarli, L. M. Animal models of chronic ethanol toxicity. Methods in Enzymology. 233, 585-594 (1994).
  27. Park, J., et al. Inputs drive cell phenotype variability. Genome Research. 24 (6), 930-941 (2014).
  28. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates: Hard Cover Edition. , Academic Press. Elsevier Inc. (1982).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Antibeloningsmechanismenlaser capturmicrodissectiemicroflu dische RT qPCRgenexpressienetwerkenneuroinflammatieneuronale subtypennormalisatie van huishoudgenengencorrelatienetwerk

Gerelateerde artikelen