Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

In vitro Reconstitutie van het Actin Cytoskelet Inside Giant Unilamellar Vesicles

4.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/64026

⸱

25 augustus 2022

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Yale University, 2Systems Biology Institute, Yale University, 3Department of Physics, Yale University

In dit artikel

Samenvatting

In dit manuscript demonstreren we de experimentele technieken om het F-actinecytoskelet in te kapselen in gigantische unilamellaire lipideblaasjes (ook wel liposomen genoemd), en de methode om een cortex-biomimicking F-actinelaag te vormen aan de binnenste folder van het liposoommembraan.

Samenvatting

Het actinecytoskelet, de belangrijkste mechanische machinerie in de cel, bemiddelt tal van essentiële fysieke cellulaire activiteiten, waaronder celvervorming, deling, migratie en adhesie. Het bestuderen van de dynamiek en structuur van het actinenetwerk in vivo wordt echter bemoeilijkt door de biochemische en genetische regulatie in levende cellen. Om een minimaal model te bouwen zonder intracellulaire biochemische regulatie, wordt actine ingekapseld in gigantische unilamellaire blaasjes (GUVs, ook wel liposomen genoemd). De biomimetische liposomen zijn celgroot en vergemakkelijken een kwantitatief inzicht in de mechanische en dynamische eigenschappen van het cytoskeletnetwerk, waardoor een levensvatbare route wordt geopend voor bottom-up synthetische biologie. Om liposomen voor inkapseling te genereren, wordt de omgekeerde emulsiemethode (ook wel de emulsieoverdrachtsmethode genoemd) gebruikt, wat een van de meest succesvolle technieken is voor het inkapselen van complexe oplossingen in liposomen om verschillende celnabootsingssystemen voor te bereiden. Met deze methode wordt een mengsel van interessante eiwitten toegevoegd aan de binnenbuffer, die later wordt geëmulgeerd in een fosfolipide-bevattende minerale olieoplossing om monolaagse lipidedruppeltjes te vormen. De gewenste liposomen worden gegenereerd uit monolaagse lipidedruppels die een lipide / olie-water-interface kruisen. Deze methode maakt de inkapseling van geconcentreerde actinepolymeren in de liposomen met gewenste lipidecomponenten mogelijk, waardoor de weg wordt vrijgemaakt voor in vitro reconstitutie van een biomimicking cytoskeletnetwerk.

Inleiding

Het actinecytoskelet speelt een fundamentele rol bij het construeren van de intracellulaire architectuur van de cel door contractiliteit op moleculair niveau en krachtgeneratie 1,2,3 te coördineren. Als gevolg hiervan bemiddelt het tal van essentiële cellulaire activiteiten, waaronder celvervorming 4,5, deling6, migratie 7,8 en adhesie9. De in vitro reconstitutie van actinenetwerken heeft de afgelopen jaren enorme aandacht gekregen 10,11,12,13,14,15,16,17. Het doel van reconstitutie is om een minimaal model van de cel te bouwen zonder de complexe biochemische regulatie die bestaat in levende cellen. Dit biedt een controleerbare omgeving om specifieke intracellulaire activiteiten te onderzoeken en vergemakkelijkt de identificatie en analyse van verschillende componenten van het actinecytoskelet 18,19. Verder biedt de inkapseling van in vitro actinenetwerken in fosfolipide gigantische unilamellaire blaasjes (GUVs, liposomen) een beperkte maar vervormbare ruimte met een semi-permeabele grens. Het bootst de fysiologische en mechanische micro-omgeving van de actinemachinerie na in de cel 9,20,21,22.

Onder verschillende methoden om liposomen te bereiden, is de lipidefilmhydratatiemethode (ook bekend als de zwellingsmethode) een van de vroegste technieken23. De droge lipidefilm hydrateert met de toevoeging van buffers en vormt vliezige bubbels die uiteindelijk blaasjes worden24. Om grotere blaasjes met een hogere opbrengst te produceren, past een verbeterde methode die voortgaat op de filmhydratatiemethode, bekend als de elektroformatiemethode25, een AC elektrisch veld toe om het hydratatieproces efficiënt te bevorderen26. De belangrijkste beperkingen van deze op hydratatie gebaseerde methoden voor actine-inkapseling zijn dat het een lage inkapselingsefficiëntie van sterk geconcentreerde eiwitten heeft en alleen compatibel is met specifieke lipidesamenstellingen24. De omgekeerde emulsietechniek heeft in vergelijking minder beperkingen voor lipidecomponenten en eiwitconcentraties 20,27,28,29. Bij deze methode wordt een mengsel van eiwitten voor inkapseling toegevoegd aan de binnenste waterige buffer, die later wordt geëmulgeerd in een lipidebevattende minerale olieoplossing, waarbij lipide-monolaagdruppeltjes worden gevormd. De monolaagse lipidedruppels kruisen vervolgens door een andere lipide / olie-water-interface door centrifugatie om bilayer lipide blaasjes (liposomen) te vormen. Deze techniek is een van de meest succesvolle strategieën gebleken voor actine-inkapseling24,30. Afzonderlijk zijn er enkele microfluïdische apparaatmethoden, waaronder gepulseerde jetting31,32, transiënte membraanuitwerping33 en de cDICE-methode34. De overeenkomsten tussen de omgekeerde emulsiemethode en de microfluïdische methode zijn het lipideoplosmiddel (olie) dat wordt gebruikt en de introductie van lipide / olie-water-interface voor de vorming van de buitenste folder van liposomen. Daarentegen vereist het genereren van liposomen door de microfluïdische methode een opstelling van microfluïdische apparaten en gaat gepaard met olie die tussen de twee blaadjes van de bilayer is opgesloten, wat een extra stap vereist voor olieverwijdering35.

In dit manuscript gebruikten we de omgekeerde emulsietechniek om liposomen te bereiden die een gepolymeriseerd F-actinenetwerk inkapselen zoals eerder gebruikt22. Het eiwitmengsel voor inkapseling werd eerst in een buffer met niet-polymeriserende omstandigheden geplaatst om actine in zijn bolvormige (G) vorm te behouden. Het hele proces werd uitgevoerd bij 4 °C om vroege actinepolymerisatie te voorkomen, die later werd geactiveerd door het monster te laten opwarmen tot kamertemperatuur. Eenmaal op kamertemperatuur polymeriseert de actine in zijn filamenteuze (F) vorm. Een verscheidenheid aan actinebindende eiwitten kan worden toegevoegd aan de binnenste waterige bufferoplossing om eiwitfunctionaliteiten en -eigenschappen te bestuderen, waardoor verdere inzichten worden verkregen in de interactie met het actinenetwerk en het membraanoppervlak. Deze methode kan ook worden toegepast op de inkapseling van verschillende eiwitten van belang36 en grote objecten (microdeeltjes, zelfrijdende microswimmers, enz.) dicht bij de grootte van de uiteindelijke liposomen28,37.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Bereiding van buffers en eiwitoplossingen

  1. Bereid de waterige Inwendige Niet-Polymerisatiebuffer (INP) in een totaal volume van 5 ml door 0,1 mM CaCl2, 10 mM HEPES (pH 7,5), 1 mM DTT, 0,5 mM Dabco, 320 mM sucrose en 0,2 mM ATP te mengen.
  2. Bereid de Protein Mix (PM) door eiwitten toe te voegen aan de INP-buffer bij 4 °C met de volgende concentraties: 11,2 μM niet-fluorescerend G-actine, 2,8 μM fluorescerend gelabeld actine en 0,24 μM Arp2/3 (Tabel met materialen). Om een F-actinelaag te vormen, voegt u 100 nM gelsolin, 4 μM cofiline en 2,2 μM VCA-His toe aan de PM. Vervang PM als controle-experiment door 100 μg/ml fluorescerende kleurstof (materiaaltabel).
  3. Bereid de waterige binnenpolymerisatiebuffer (IP) (waterig) in een totaal volume van 5 ml door 100 mM KCl, 4 mM MgCl2, 10 mM HEPES (pH 7,5), 1 mM DTT, 0,5 mM Dabco, 10 mM ATP en 80 mM sucrose te mengen.
  4. Bereid de eindbuffer (FB) voor door inp-buffer (met PM) en IP-buffer te mengen in een volumeverhouding van 1:1 om de binnenste waterige oplossing te verkrijgen in een totaal volume van 30 μL dat in het liposoom wordt ingekapseld.
  5. Bereid de waterige buitenbuffer (OB) in een totaal volume van 150 μL door 10 mM HEPES (pH 7,5), 50 mM KCl, 2mM MgCl2, 0,2 mM CaCl2, 2mM ATP, 1 mM DTT, 0,5 mM Dabco, 212 mM glucose en 0,1 mg/ml β-caseïne te mengen.
    OPMERKING: De osmolariteit van de OB kan worden aangepast met glucose om ervoor te zorgen dat de osmotische druk van de OB iets groter is dan die van de FB (20-60 mOsm). De dichtheid van de FB moet iets hoger zijn dan de OB.

2. Bereiding van liposomen op basis van de omgekeerde emulsietechnieken

  1. Bereid het lipide-oliemengsel
    1. Voeg 100 μL 25 mg/ml L-α-fosfatidylcholine (niet-fluorescerend Ei PC, ook wel EPC genoemd, inclusief 1% DHPE) toe aan een glazen injectieflacon. Verdamp chloroform met argongas en laat een droge vaste lipidenfilm (2,5 mg) achter op de bodem van de injectieflacon.
      1. Om een F-actinelaag te vormen, voegt u 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-{[n(5-amino-1-carboxypentyl) iminodiacetic acid] succinyl} nikkelzout (DOGS-NTA-Ni) toe aan een 10:1 verhouding van EPC tot DOGS-NTA-Ni en meng voor de verdamping van chloroform.
    2. Voeg 2 ml minerale olie toe en soniceer het lipide-oliemengsel bij kamertemperatuur in een bad gedurende 1 uur om de lipiden opnieuw op te schorten.
      OPMERKING: Het lipide-oliemengsel na ultrasoonapparaat kan gedurende 1 week bij 4 °C worden bewaard. Re-sonicatie wordt voorgesteld voor gebruik.
  2. Bereid een laatste buffer in olie (FB / olie) emulsie voor het bereiden van monolaag lipidedruppels die het eiwit van belang bevatten.
    1. Voeg aan 100 μL lipide-oliemengsel in een plastic buis 10 μL FB toe. Zorg ervoor dat FB zich in één druppel bevindt.
    2. Teken met behulp van een glazen spuit het lipide-olie-FB-mengsel en zuig meerdere keren voorzichtig op en neer om het te emulgeren; trek eerst een kleine hoeveelheid lipide-oliemengsel en vervolgens de FB-druppel door de punt van de spuit aan de rand van de druppel te plaatsen om deze in kleine druppeltjes te breken. Herhaal de op en neer gaande aspiratie totdat een witachtige en troebele emulsie wordt gevormd.
  3. Doe 30 μL OB in een aparte plastic buis. Plaats 30 μL van het lipide-oliemengsel bovenop OB en laat het ~ 10 minuten zitten om een lipide monolaag op het grensvlak te ontwikkelen.
    OPMERKING: Als de lipiden geladen zijn of het eiwit wordt opgenomen, moet de duur van deze stap worden verlengd38.
  4. Bereid de liposomen voor
    1. Voeg voorzichtig 50 μL van de FB/olie-emulsie (stap 2.2) toe aan de bovenste oliefase van de buis vanaf stap 2.3.
    2. Centrifugeer de plastic buis bij 100 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C. Varieer de tijd en centrifugatiesnelheid om te optimaliseren voor liposoomvorming.
      OPMERKING: Na centrifugatie moet de bovenste oliefase duidelijk zijn en moet de onderste OB (met liposomen) enigszins troebel zijn.
    3. Verwijder de oliefase voorzichtig met een pipet. Aspirateer extra volume indien nodig. Zorg ervoor dat u de pipetpunt niet aan de zijkant van de buis plaatst om te voorkomen dat er een meniscus van olie bovenop de liposoomfase ontstaat.
    4. Steek met een nieuwe pipet de pipetpunt langzaam in de resterende onderste fase en zuig het waterige volume aan om liposomen te verzamelen.
      OPMERKING: Het is beter om volume te verliezen dan om de olie op te nemen. De toevoeging van olie zal ervoor zorgen dat liposomen scheuren en de interne componenten worden vrijgegeven in de externe buffer. Snijd de punt van een pipet om afschuiving te verminderen.

3. Microscopie observatie

  1. Giet 100 μL OB in de put van een incubatiekamer (4-wells plaat met 12 mm ronde coverslips). Deponeer de verzamelde liposomen (stap 2.4.4) voorzichtig in OB en plaats vervolgens een andere coverslip bovenop de kamer.
    OPMERKING: De OB bevat de β-caseïne om het glasoppervlak te passiveren en het plakken tussen de liposomen te minimaliseren20.
  2. Observeer liposomen met een confocale microscoop met behulp van een 63x olie-immersie objectief. Gebruik laserlijnen van 488 nm, 647 nm en 561 nm om respectievelijk fluorescerend gelabeld lipide, ingekapselde fluorescerende kleurstof en ingekapselde fluorescerend gelabelde actine te observeren. Leg de interessante frames vast en sla de afbeeldingen op in TIFF-indeling.
  3. Verwerk en analyseer afbeeldingen in ImageJ/Fiji39. Voor nieuwe gebruikers van ImageJ/Fiji is een online tutorial beschikbaar (zie Materiaaltabel).
    1. Open het TIFF-bestand met behulp van ImageJ / Fiji-software.
    2. Ga naar Afbeelding > > helderheid / contrast aanpassen. Pas de helderheid en het contrast van de afbeelding aan de gewenste schaal aan door de instellingen Minimum en Maximum en de schuifregelaars Helderheid en Contrast aan te passen.
    3. Klik op het gereedschap Rechthoekselectie in de werkbalk en selecteer het interessante gebied (ROI). Ga naar Afbeelding > bijsnijden om de ROI bij te snijden.
    4. Ga naar Analyseren > Schaal instellen. Voer in het pop-upvenster 1.0 in het veld Pixelverhouding in en stel μm in als lengte-eenheid. Voer in het veld Afstand in pixels de afbeeldingsbreedte in pixels in. Voer in het veld Bekende afstand de werkelijke afbeeldingsbreedte in micron in.
    5. Als u de grootte van het liposoom wilt meten, tekent u met het gereedschap Ovaal selecteren in de werkbalk een cirkel langs de rand van het liposoom. Ga naar Analyseren > Meten om het oppervlak van de cirkel te meten, van waaruit de diameter van het liposoom kan worden berekend.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De bereiding van liposomen op basis van de omgekeerde emulsietechniek wordt grafisch en schematisch geïllustreerd in figuur 1.

Eerst werden lege (kale) liposomen (~ 5-50 μm in diameter) bereid die waren samengesteld uit fosfolipide (EPC) en fluorescerend lipide (DHPE). Een heldere, verrode fluorescerende kleurstof werd ingekapseld in kale liposomen als een controle-experiment. Of een lipide monolaag zich met succes heeft gevormd in het perifere deel van de druppel...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Verschillende belangrijke stappen bepalen het succes van een hoge opbrengst van liposomen tijdens het bereidingsproces. Om de lipidefilm in de olie volledig op te lossen, moet het monster worden gesoniseerd totdat de lipidefilm op de bodem van de glazen injectieflacon volledig verdwijnt. Na de ultrasoonapparaat moet het lipide-oliemengsel 's nachts bij kamertemperatuur onder donkere omstandigheden worden bewaard om de lipidemoleculen verder te laten dispergeren29. Het mengsel kan maximaal een week...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

We erkennen de financiering van ARO MURI W911NF-14-1-0403 aan M.P.M., de National Institutes of Health (NIH) R01 1R01GM126256 aan M.P.M., de National Institutes of Health (NIH) U54 CA209992, NIH RO1 GM126256, NIH U54 CA209992, University of Michigan / Genentech, SUBK00016255 en Human Frontiers Science Program (HFSP) subsidienummer RGY0073/2018 aan M.P.M. Alle meningen, bevindingen, conclusies of aanbevelingen die in dit materiaal worden uitgedrukt, zijn die van de auteurs en weerspiegelen niet noodzakelijkerwijs de standpunten van de ARO, NIH of HFSP. S.C. erkent vruchtbare gesprekken met V. Yadav, C. Muresan en S. Amiri.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-{[n(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid]succinyl} nickel salt (DOGS-NTA-Ni) Avanti Polar Lipids Inc.231615773Nickel Lipid
1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octaneSigmaD27802-25GDABCO
Actineiwit (>99% puur): konijn skeletspierCytoskeleton, IncAKL99-Dniet-fluorescente G-actine
Actineiwit (rodamine): konijn skeletspierCytoskeleton, IncAR05fluorescent gelabeld actine
Adenosine 5'-trifosfaat dinatriumzoutwatervrijSigmaA2383-10GATP
Alexa Fluor 647 kleurstofThermoFisherfluorescente kleurstof
Andor iQ3Andor Technologiesbesturings- en acquisitiesoftware voor confocale microscoop
Arp2/3-eiwitcomplex: varkenshersenenCytoskeleton, IncRP01P-AArp 2/3
CalciumchloridedihydraatSigma10035048CaCl2
Chamlide-kamers (4-putjes voor 12 mm ronde dekglas)Quorum Technologiesincubatiekamer
Cofilineiwit: humaan recombinantCytoskeleton, IncCF01-Ccofilin
Confocale microscoop (63x olie-immersie objectief)Andor TechnologiesLEICA DMi8
D-(+)-GLUCOSE BIOXTRASigmaG7528glucose
DithiothreitolDOT Scientific DSD11000-10DTT
Gelsolin-eiwit: Homo Sapiens RecombinantCytoskeleton, IncHPG6gelsolin
Hamilton 1750 Gastight-spuit, 500 µL, verlijmde naald, 22 G, 2" conische puntCole-ParmerUX-07940-53glas-spuit
HEPESAmericanBio7365-45-9
ImageJ/Fijihttps://imagej.net/tutorials/
L-alpha-FosfatidylcholineAvanti Polar Lipids Inc.97281442EPC
MagnesiumchlorideSigma7786303MgCl2
Mineralolie, BioReagent, voor moleculaire biologie, lichte olieSigma8042475minerale olie
N-WASP-fragment WWA (aa400–501, VCA-His)VCA-His wordt gezuiverd volgens laboratoriumprotocol. Het protocol kan worden verstrekt op redelijk verzoek
Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Fosfoethanolamine (Oregon Green 488 DHPE)Thermo FisherO12650DHPE
KaliumchlorideSigma7447407KCl
SucroseSigma57-50-1sucrose
β-Caseïne van rundersmelkSigmaC6905-250MG

Referenties

  1. Murrell, M., Oakes, P. W., Lenz, M., Gardel, M. L. Forcing cells into shape: the mechanics of actomyosin contractility. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (8), 486-498 (2015).
  2. Stricker, J., Falzone, T., Gardel, M. L. Mechanics of the F-actin cytoskeleton. Journal of Biomechanics. 43 (1), 9-14 (2010).
  3. Linsmeier, I., et al. Disordered actomyosin networks are sufficient to produce cooperative and telescopic contractility. Nature Communications. 7 (1), 1-9 (2016).
  4. Yousafzai, M., Yadav, V., Amiri, S., Errami, Y., Murrell, M. Active regulation of pressure and volume defines an energetic constraint on the size of cell aggregates. Physical Review Letters. 128 (4), 048103(2022).
  5. Simon, C., et al. Actin dynamics drive cell-like membrane deformation. Nature Physics. 15 (6), 602-609 (2019).
  6. Munro, E., Nance, J., Priess, J. R. Cortical flows powered by asymmetrical contraction transport PAR proteins to establish and maintain anterior-posterior polarity in the early C. elegans embryo. Developmental Cell. 7 (3), 413-424 (2004).
  7. Bray, D., White, J. Cortical flow in animal cells. Science. 239 (4842), 883-888 (1988).
  8. Beaune, G., et al. Spontaneous migration of cellular aggregates from giant keratocytes to running spheroids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (51), 12926-12931 (2018).
  9. Murrell, M. P., et al. Liposome adhesion generates traction stress. Nature Physics. 10 (2), 163-169 (2014).
  10. Lee, G., et al. Myosin-driven actin-microtubule networks exhibit self-organized contractile dynamics. Science Advances. 7 (6), (2021).
  11. Anderson, S., Garamella, J., Adalbert, S., McGorty, R., Robertson-Anderson, R. Subtle changes in crosslinking drive diverse anomalous transport characteristics in actin-microtubule networks. Soft Matter. 17 (16), 4375-4385 (2021).
  12. Janson, M. E., et al. Crosslinkers and motors organize dynamic microtubules to form stable bipolar arrays in fission yeast. Cell. 128 (2), 357-368 (2007).
  13. McCall, P. M., MacKintosh, F. C., Kovar, D. R., Gardel, M. L. Cofilin drives rapid turnover and fluidization of entangled F-actin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (26), 12629-12637 (2019).
  14. Köhler, S., Schaller, V., Bausch, A. R. Structure formation in active networks. Nature Materials. 10 (6), 462-468 (2011).
  15. Koenderink, G. H., et al. An active biopolymer network controlled by molecular motors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (36), 15192-15197 (2009).
  16. Seara, D. S., et al. Entropy production rate is maximized in non-contractile actomyosin. Nature Communications. 9 (1), 1-10 (2018).
  17. Tabatabai, A. P., et al. Detailed balance broken by catch bond kinetics enables mechanical-adaptation in active materials. Advanced Functional Materials. 31 (10), 2006745(2021).
  18. Murrell, M. P., Gardel, M. L. F-actin buckling coordinates contractility and severing in a biomimetic actomyosin cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (51), 20820-20825 (2012).
  19. Murrell, M., Gardel, M. L. Actomyosin sliding is attenuated in contractile biomimetic cortices. Molecular Biology of the Cell. 25 (12), 1845-1853 (2014).
  20. Murrell, M., et al. Spreading dynamics of biomimetic actin cortices. Biophysical Journal. 100 (6), 1400-1409 (2011).
  21. Liu, A. P., et al. Membrane-induced bundling of actin filaments. Nature Physics. 4 (10), 789-793 (2008).
  22. Pontani, L. -L., et al. Reconstitution of an actin cortex inside a liposome. Biophysical Journal. 96 (1), 192-198 (2009).
  23. Reeves, J. P., Dowben, R. M. Formation and properties of thin-walled phospholipid vesicles. Journal of Cellular Physiology. 73 (1), 49-60 (1969).
  24. Litschel, T., Schwille, P. Protein reconstitution inside giant unilamellar vesicles. Annual Review of Biophysics. 50, 525-548 (2021).
  25. Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Discussions of the Chemical Society. 81, 303-311 (1986).
  26. Limozin, L., Sackmann, E. Polymorphism of cross-linked actin networks in giant vesicles. Physical Review Letters. 89 (16), 168103(2002).
  27. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
  28. Natsume, Y., et al. Preparation of giant vesicles encapsulating microspheres by centrifugation of a water-in-oil emulsion. Journal of Visualized Experiments. (119), e55282(2017).
  29. Chiba, M., Miyazaki, M., Ishiwata, I. s Quantitative analysis of the lamellarity of giant liposomes prepared by the inverted emulsion method. Biophysical Journal. 107 (2), 346-354 (2014).
  30. Fujii, S., et al. Liposome display for in vitro selection and evolution of membrane proteins. Nature Protocols. 9 (7), 1578-1591 (2014).
  31. Funakoshi, K., Suzuki, H., Takeuchi, S. Formation of giant lipid vesiclelike compartments from a planar lipid membrane by a pulsed jet flow. Journal of the American Chemical Society. 129 (42), 12608-12609 (2007).
  32. Okushima, S., Nisisako, T., Torii, T., Higuchi, T. Controlled production of monodisperse double emulsions by two-step droplet breakup in microfluidic devices. Langmuir. 20 (23), 9905-9908 (2004).
  33. Ota, S., Yoshizawa, S., Takeuchi, S. Microfluidic formation of monodisperse, cell-sized, and unilamellar vesicles. Angewandte Chemie International Edition. 48 (35), 6533-6537 (2009).
  34. Bashirzadeh, Y., Wubshet, N., Litschel, T., Schwille, P., Liu, A. P. Rapid encapsulation of reconstituted cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles. Journal of Visualized Experiments. (177), (2021).
  35. Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E., Dekker, C. Octanol-assisted liposome assembly on chip. Nature Communications. 7 (1), 1-9 (2016).
  36. Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. Encapsulation of the cytoskeleton: towards mimicking the mechanics of a cell. Soft Matter. 15 (42), 8425-8436 (2019).
  37. Vutukuri, H. R., et al. Active particles induce large shape deformations in giant lipid vesicles. Nature. 586 (7827), 52-56 (2020).
  38. Lemière, J., Carvalho, K., Sykes, C. Methods in Cell Biology. 128, Elsevier. 271-285 (2015).
  39. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  40. Liman, J., et al. The role of the Arp2/3 complex in shaping the dynamics and structures of branched actomyosin networks. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 117 (20), 10825-10831 (2020).
  41. Sun, Y., Leong, N. T., Wong, T., Drubin, D. G. A Pan1/End3/Sla1 complex links Arp2/3-mediated actin assembly to sites of clathrin-mediated endocytosis. Molecular Biology of the Cell. 26 (21), 3841-3856 (2015).
  42. Bretschneider, T., et al. Dynamic actin patterns and Arp2/3 assembly at the substrate-attached surface of motile cells. Current Biology. 14 (1), 1-10 (2004).
  43. Goley, E. D., et al. An actin-filament-binding interface on the Arp2/3 complex is critical for nucleation and branch stability. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 107 (18), 8159-8164 (2010).
  44. Svitkina, T. M., Borisy, G. G. Arp2/3 complex and actin depolymerizing factor/cofilin in dendritic organization and treadmilling of actin filament array in lamellipodia. The Journal of Cell Biology. 145 (5), 1009-1026 (1999).
  45. Kelleher, J. F., Atkinson, S. J., Pollard, T. D. Sequences, structural models, and cellular localization of the actin-related proteins Arp2 and Arp3 from Acanthamoeba. The Journal of Cell Biology. 131 (2), 385-397 (1995).
  46. Prehoda, K. E., Scott, J. A., Mullins, R. D., Lim, W. A. Integration of multiple signals through cooperative regulation of the N-WASP-Arp2/3 complex. Science. 290 (5492), 801-806 (2000).
  47. Delatour, V., et al. Arp2/3 controls the motile behavior of N-WASP-functionalized GUVs and modulates N-WASP surface distribution by mediating transient links with actin filaments. Biophysical Journal. 94 (12), 4890-4905 (2008).
  48. Izdebska, M., Zielińska, W., Hałas-Wiśniewska, M., Grzanka, A. Involvement of actin and actin-binding proteins in carcinogenesis. Cells. 9 (10), 2245(2020).
  49. Schäfer, E., Kliesch, T. -T., Janshoff, A. Mechanical properties of giant liposomes compressed between two parallel plates: impact of artificial actin shells. Langmuir. 29 (33), 10463-10474 (2013).
  50. Whittenton, J., et al. Evaluation of asymmetric liposomal nanoparticles for encapsulation of polynucleotides. Langmuir. 24 (16), 8533-8540 (2008).
  51. Levine, R. M., Pearce, T. R., Adil, M., Kokkoli, E. Preparation and characterization of liposome-encapsulated plasmid DNA for gene delivery. Langmuir. 29 (29), 9208-9215 (2013).
  52. Moga, A., Yandrapalli, N., Dimova, R., Robinson, T. Optimization of the inverted emulsion method for high-yield production of biomimetic giant unilamellar vesicles. ChemBioChem. 20 (20), 2674-2682 (2019).
  53. Vale, R. Reconstituting the Cytoskeleton. , Academic Press. (2014).
  54. Pardee, J. D., Spudich, J. A. Mechanism of K+-induced actin assembly. The Journal of Cell Biology. 93 (3), 648-654 (1982).
  55. Zimmerle, C. T., Frieden, C. Effect of pH on the mechanism of actin polymerization. Biochemistry. 27 (20), 7766-7772 (1988).
  56. Wegner, A. M., et al. N-wasp and the arp2/3 complex are critical regulators of actin in the development of dendritic spines and synapses. Journal of Biological Chemistry. 283 (23), 15912-15920 (2008).
  57. Blanchoin, L., et al. Direct observation of dendritic actin filament networks nucleated by Arp2/3 complex and WASP/Scar proteins. Nature. 404 (6781), 1007-1011 (2000).
  58. Römer, W., et al. Actin dynamics drive membrane reorganization and scission in clathrin-independent endocytosis. Cell. 140 (4), 540-553 (2010).
  59. Popova, A. V., Hincha, D. K. Effects of flavonol glycosides on liposome stability during freezing and drying. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1858 (12), 3050-3060 (2016).
  60. Harrigan, P., Madden, T., Cullis, P. Protection of liposomes during dehydration or freezing. Chemistry and Physics of Lipids. 52 (2), 139-149 (1990).
  61. Szoka, F., Papahadjopoulos, D. Comparative properties and methods of preparation of lipid vesicles (liposomes). Annual Review of Biophysics and Bioengineering. 9 (1), 467-508 (1980).
  62. Campillo, C., et al. Unexpected membrane dynamics unveiled by membrane nanotube extrusion. Biophysical Journal. 104 (6), 1248-1256 (2013).
  63. Deng, N. -N., Yelleswarapu, M., Huck, W. T. Monodisperse uni-and multicompartment liposomes. Journal of the American Chemical Society. 138 (24), 7584-7591 (2016).
  64. Ricketts, S. N., Ross, J. L., Robertson-Anderson, R. M. Co-entangled actin-microtubule composites exhibit tunable stiffness and power-law stress relaxation. Biophysical journal. 115 (6), 1055-1067 (2018).
  65. Sheung, J. Y., et al. Motor-driven restructuring of cytoskeleton composites leads to tunable time-varying elasticity. ACS Macro Letters. 10 (9), 1151-1158 (2021).
  66. Falzone, T. T., Blair, S., Robertson-Anderson, R. M. Entangled F-actin displays a unique crossover to microscale nonlinearity dominated by entanglement segment dynamics. Soft Matter. 11 (22), 4418-4423 (2015).
  67. Francis, M. L., et al. Non-monotonic dependence of stiffness on actin crosslinking in cytoskeleton composites. Soft Matter. 15 (44), 9056-9065 (2019).
  68. Yadav, V., et al. Filament nucleation tunes mechanical memory in active polymer networks. Advanced Functional Materials. 29 (49), 1905243(2019).
  69. Murrell, M., Thoresen, T., Gardel, M. Methods in Enzymology. 540, Elsevier. 265-282 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Omgekeerde emulsie-methodeliposoominkapselingreconstitutie van het cytoskeletconfocale microscopiedynamiek van actinenetwerkenARP2/3-complexfluorescentielabelingsynthetisch celmodel
In vitro Reconstitutie van het Actin Cytoskelet Inside Giant Unilamellar Vesicles
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.