Methodenartikel

Niet-destructieve evaluatie van regionale celdichtheid binnen tumoraggregaten na medicamenteuze behandeling

DOI:

10.3791/64030

⸱

21 juni 2022

 ,  ,  , 
1Rensselaer Polytechnic Institute, 2Albany Medical College

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het huidige protocol ontwikkelt een beeldgebaseerde techniek voor snelle, niet-destructieve en labelvrije regionale celdichtheids- en levensvatbaarheidsmeting binnen 3D-tumoraggregaten. Bevindingen onthulden een celdichtheidsgradiënt, met hogere celdichtheden in kerngebieden dan buitenste lagen in ontwikkelende aggregaten en overwegend perifere celdood in HER2 + aggregaten behandeld met Trastuzumab.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Meercellige tumorsferoïde (MCTSs) modellen hebben een toenemend nut aangetoond voor in vitro studie van kankerprogressie en medicijnontdekking. Deze relatief eenvoudige avasculaire constructies bootsen belangrijke aspecten van in vivo tumoren na, zoals 3D-structuur en pathofysiologische gradiënten. MCTSS-modellen kunnen inzicht geven in het gedrag van kankercellen tijdens de ontwikkeling van sferoïden en als reactie op geneesmiddelen; hun vereiste omvang beperkt echter drastisch de instrumenten die worden gebruikt voor niet-destructieve beoordeling. Optische coherentie Tomografie structurele beeldvorming en Imaris 3D-analysesoftware worden onderzocht voor snelle, niet-destructieve en labelvrije meting van regionale celdichtheid binnen MCTS'en. Deze aanpak wordt gebruikt om MCTS'en te beoordelen gedurende een rijpingsperiode van 4 dagen en gedurende een verlengde 5-daagse behandeling met Trastuzumab, een klinisch relevant anti-HER2-medicijn. In het kort werden AU565 HER2 + borstkanker MCTS'en gemaakt via vloeibare overlay met of zonder de toevoeging van Matrigel (een keldermembraanmatrix) om aggregaten van verschillende morfologieën te onderzoeken (respectievelijk dikkere, schijfachtige 2,5D-aggregaten of platte 2D-aggregaten). Celdichtheid binnen het buitenste gebied, overgangsgebied en binnenkern werd gekarakteriseerd in gerijpte MCTS'en, wat een celdichtheidsgradiënt onthult met hogere celdichtheden in kerngebieden in vergelijking met buitenste lagen. De matrixtoevoeging herverdeelde de celdichtheid en verbeterde deze gradiënt, waardoor de buitenste zonedichtheid afnam en de celverdichting in de kernen toenam. De celdichtheid werd gekwantificeerd na medicamenteuze behandeling (0 h, 24 h, 5 dagen) binnen progressief diepere zones van 100 μm om potentiële regionale verschillen in geneesmiddelrespons te beoordelen. Tegen het laatste tijdspunt leek bijna alle celdood beperkt te zijn tot de buitenste 200 μm van elk aggregaat, terwijl cellen dieper in het aggregaat grotendeels onaangetast leken, wat regionale verschillen in de geneesmiddelrespons illustreert, mogelijk als gevolg van beperkingen in medicijnpenetratie. Het huidige protocol biedt een unieke techniek om de regionale celdichtheid in dichte cellulaire weefsels niet-destructief te kwantificeren en longitudinaal te meten.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Onderzoekers hebben zich grotendeels gewend tot benchtop 3D-cultuur in vitro systemen om enkele van de belangrijkste kenmerken van tumorprogressie te bestuderen. Veel van dit onderzoek is geleid door de heropleving van meercellige tumorsferoïden (MCTS'en) en complexere organoïden 1,2. Hoewel deze modellen avasculair zijn, bieden ze een krachtig hulpmiddel voor het samenvatten van fysiologische en pathologische processen die in vivo plaatsvinden 3,4,5. Met name middelgrote modellen (diameter 300-500 μm) kunnen belangrijke tumorkenmerken nabootsen, zoals 3D-structuur, pathofysiologische gradiënten en gemetastaseerde signalering als gevolg van hypoxie in de kern. Het is goed gedocumenteerd dat deze modellen de karakteristieke concentrische lagen vertonen die worden gezien in gevasculariseerde in vivo tumoren, namelijk een buitenste laag proliferatieve cellen, een overgangslaag van senescente / rustende cellen en cellen met hypoxie in de kern 3,6,7,8,9 . Uniek inzicht kan worden verkregen uit deze modellen door celgedrag binnen deze lagen, tijdens de ontwikkeling en in reactie op het medicijn te karakteriseren. De vereiste MCTS-grootte, die nodig is om de gradiënten te ontwikkelen die ze zulke krachtige in vitro modellen maken, beperkt echter drastisch de hulpmiddelen die worden gebruikt voor niet-destructieve beoordeling. Inderdaad, een van de grootste uitdagingen met niet-destructieve analyse van MTCS'en is het kwantificeren van details op celschaal. Bright-field en fasecontrastmicroscopie worden routinematig gebruikt om de groei en ontwikkeling van 3D MCTSs niet-destructief te beoordelen. Deze modaliteiten zijn echter beperkt tot 2D-projecties en missen de capaciteit om de cruciale 3D-structuur van deze modellen te visualiseren 10,11,12,13. Informatie over cytotoxiciteit en celproliferatie wordt doorgaans verzameld via fluorescerende beeldvorming (d.w.z. light-sheet microscopie, confocale microscopie) of ex vivo immunohistologische kleuring 14,15,16. Hoewel deze benaderingen waardevolle informatie met hoge resolutie bieden over weefselstructuur, cellulaire dichtheid en cellulaire functie, vereisen ze vaak monstervoorbereiding zoals optische clearing, fixatie / kleuring of inbedding die longitudinale analyses voorkomt.

Optical Coherence Tomography (OCT) is een niet-destructieve structurele beeldvormingsmodaliteit die het potentieel heeft om enkele van de bovengenoemde uitdagingen te overwinnen. Het beschikt over cellulaire resolutie en een voldoende breed gezichtsveld (tot 10 mm x 10 mm) dat in staat is om volledige meercellige aggregaten 17,18,19 te visualiseren. Belangrijk is dat vanwege de zichtbare aard van het gebruikte licht, deze techniek volledig niet-destructief en labelvrij is17. Ook kunnen monsters in situ worden afgebeeld zonder monstervoorbereiding, zodat monsters rechtstreeks uit de incubator kunnen worden genomen, snel kunnen worden gescand met OCT (scanduur ~ 5-10 min) en vervolgens kunnen worden teruggebracht naar de incubator, waardoor longitudinale karakterisering mogelijk is. Veel studies die OCT willen gebruiken om het gedrag van tumorsferoïden te analyseren, zijn onlangs naar voren gekomen. In een van de meest opwindende demonstraties gebruikten Huang et al. OCT om niet-destructief necrotische kernen te detecteren in grote tumorsferoïde modellen, waarbij ze opmerkten dat levende en dode celgebieden waarneembare verschillen in optische verzwakking hebben, die kunnen worden gebruikt voor labelvrije levensvatbaarheidsmonitoring20. Evenzo voerden Hari et al. refractieve index (RI) metingen uit van menselijke darmkanker (HCT116) sferoïden afgebeeld met OCT om de aanwezigheid van hypoxie in de monsters te bestuderen21. Hun metingen waren niet voldoende voor directe gevolgtrekkingen, hoewel ze wel een lagere RI waarnamen op locaties die correleerden met de site, hoewel niet de grootte, van necrotische kernen, later geïdentificeerd via confocale microscopie. Abd El-Sadek et al. gebruikten OCT om de regionale levensvatbaarheid van borstkankertumormodellen te visualiseren en te kwantificeren22. Ze rapporteerden twee OCT-gebaseerde methoden voor het visualiseren van weefseldynamica en toonden een matige correlatie tussen verschillen in deze statistieken en microscopie-geïdentificeerde regio's van levende / dode cellen.

Ons gepubliceerde werk met oct bouwde voort op deze eerdere literatuur om een kwantitatieve, niet-destructieve benadering vast te stellen om de 3D-morfologie en celtelling binnen MCTSs borstkankermodellen te meten tijdens de ontwikkeling10,23. Met behulp van Imaris 3D rendering beeldanalysesoftware om het aantal objecten ter grootte van een cel (d.w.z. vlekken) te tellen dat in beeld werd gebracht binnen de OCT-volumescans, werden de celtellingen niet-destructief gemeten in MCTS'en die statistisch vergelijkbaar waren met die bepaald via hemocytometer bij geaggregeerde dissociatie. Vanwege de structurele aard van OCT kunnen celmembranen die nog steeds aanwezig zijn na celdood door necrose echter ten onrechte worden geteld als levende cellen. Bovendien werd deze karakterisering uitgebreid tot het niet-destructief volgen van de levensvatbaarheid van cellen binnen individuele aggregaten onderworpen aan een medicijnregime met veelbelovend succes10. Belangrijk is dat werd opgemerkt dat vergelijkbare levensvatbaarheid van cellen werd gerapporteerd vanuit onze OCT-Imaris-benadering met wat werd gebenchmarkt in deze monsters bij dissociatie. Deze niet-destructieve en labelvrije celbenadering maakt het mogelijk om cellen te tellen binnen 3D-constructies en dichte aggregaten in de lengterichting zonder de construct / aggregaatstructuur op te offeren.

Het huidige werk rapporteert een verbeterde aanpak om de regionale celdichtheid binnen dichte aggregaten direct te kwantificeren door gebruik te maken van het vermogen van OCT-Imaris om zowel de morfologie van 3D-aggregaten als het celgetal te meten. Deze methodologische vooruitgang biedt een gedetailleerder beeld van de ruimtelijke verdeling en proliferatie van cellen binnen de karakteristieke concentrische lagen van MCTSs-modellen. In plaats van simpelweg een totale gemiddelde geaggregeerde celdichtheid te berekenen, kunnen dergelijke lokale dichtheidsmetingen celdichtheidsgradiënten onthullen, zoals die geassocieerd met verdichting. Deze regionale beoordeling wordt ook toegepast op aggregaten die worden behandeld met een chemotherapeuticum om de regionale geneesmiddelrespons te beoordelen, zoals gemeten door veranderingen in de lokale celdichtheid. Deze combinatie van OCT- en geavanceerde beeldvormingsanalysemethoden biedt kwantificering van de levensvatbaarheid van regionale cellen, die kan worden gebruikt om de penetratie van geneesmiddelen te onderzoeken op basis van welke regio's een afname van de celdichtheid ervaren. Dit is het eerste rapport dat de regionale celdichtheid en levensvatbaarheid niet-destructief kwantificeert als reactie op het medicijn in dichte cellulaire weefsels en het longitudinaal meet. Een dergelijke karakterisering van driedimensionale celdichtheid en ruimtelijke verdeling door hele MCTS'en kan helpen de medicijnafgifte bij de behandeling van kanker te optimaliseren en het begrip van de progressie van het kankermodel te verbeteren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AU565 (HER2+) en MDA-MB-231 borstkankercellijnen werden gebruikt voor deze studie (zie Materiaaltabel).

1. Tumoraggregaten voorbereiden

  1. Bereid AU565 (HER2+) groeimedia voor borstkankercellen met behulp van Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 basaal medium (+) in L-glutamine aangevuld met 10% (v/v) foetaal runderserum en 1% penicilline/streptomycine (zie Materiaaltabel).
  2. Bereid MDA-MB-231 triple-negatieve groeimedia voor borstkankercellen met behulp van Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) aangevuld met 10% (v / v) foetaal runderserum (FBS), 100 U / ml penicilline / streptomycine en 2 mM L-glutamine (zie materiaaltabel).
  3. Bereid 70% -90% confluente celculturen van beide cellijnen (~ 3-4 dagen voorbereiding) in standaardomstandigheden (37 ° C, 5% CO2, 95% relatieve vochtigheid). Maak celmonolagen los van hun kweekkolven volgens de standaard trypsinisatiemethode.
    OPMERKING: Voorkom overmatige blootstelling van cellen aan het trypsine, waardoor hun levensvatbaarheid wordt beïnvloed.
    1. Voor AU565-cellen, aspirateer celmedia uit de kolf met behulp van een pipet (of, indien beschikbaar, met behulp van een vacuümpomp die via buizen is aangesloten op een geautoclaveerde glazen pipetpunt) en vervang door 2 ml Trypsin-EDTA. Laat de kolf 3 minuten op kamertemperatuur staan en ga dan nog eens 4 minuten naar de couveuse. Voeg daarna 6 ml groeimedia toe aan de kolf om het trypsine te neutraliseren.
    2. Voor MDA-MB-231-cellen ademt u celmedia uit de kolf op dezelfde wijze als in stap 1.3.1 en vervangt u deze door 1,5 ml Trypsine-EDTA. Voeg na 7 minuten incubatie 8,5 ml groeimedia toe aan de kolf om het trypsine te neutraliseren.
  4. Voeg 10 μL van de celsuspensie toe aan een hemocytometer om het aantal cellen in de suspensie te bepalen24. Resuspend cellen in media met de gewenste concentratie van 2,5 × 105 cellen / ml.
  5. Doseer 50 μL celsuspensie in elke put van een ronde bodem, niet-hechtende, 96-well plaat. Voor suspensies bereid zonder Matrigel (keldermembraanmatrix, zie Tabel van materialen), voeg 50 μL gewoon groeimedium toe aan elk putje.
    1. Voor suspensies bereid met de keldermembraanmatrix, verwijdert u de matrixflacon uit -20 °C opslag en plaatst u deze in de koelkast om een nacht te ontdooien. Bereid een container met groeimedia en laat 10 minuten in de koelkast afkoelen.
    2. Voeg met behulp van een bevroren pipetpunt de matrix toe aan gekoelde media, zodat de uiteindelijke concentratie van deze oplossing 5% is. Voeg 50 μL van dit medium toe aan elke put, zodat de uiteindelijke concentratie matrix in deze putten 2,5%3 is.
      OPMERKING: In eerder werk werd de geaggregeerde morfologie beoordeeld voor deze cellijnen 10,25, en ontdekte dat MDA-MB-231 aggregaten sferoïden vormen met de toevoeging van de membraanmatrix, terwijl MDA-MB-231 culturen zonder de matrix en AU565 +/- matrix allemaal schijfvormige aggregaten vormen. Gekwantificeerde sfericiteit van >0,8 op een schaal van 0 (vlak) - 1,0 (perfecte bol) werd gebruikt om voldoende bolvormige aggregaten te identificeren en dus verwachtte de vereiste oppervlakte-volumeverhouding te hebben voor in vivo-achtig gedrag26,27.
  6. Centrifugeer de platen bij 123 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur onmiddellijk na het zaaien om ervoor te zorgen dat een celpellet op de bodem van elke put wordt verzameld.
    LET OP: Deze stap moet zo snel mogelijk na het zaaien plaatsvinden. De auteurs merkten op dat te veel tijd tussen deze stappen de cellen in staat stelt zich over de bodems en zijkanten van elke put te nestelen, waardoor hun vermogen om zich te verzamelen en te aggregeren op de bodem van de put wordt belemmerd.
  7. Incubeer de platen gedurende 4 dagen, waarna de celaggregaten als gerijpt worden beschouwd.
    OPMERKING: AU565-aggregaten bereid met de keldermembraanmatrix vereisen een extra kweekperiode van 5 dagen voor het geneesmiddelresponsonderzoek (9 dagen totaal, mediaverandering op dag 4).

2. Toediening van Trastuzumab (TZM) aan AU565-celaggregaten

  1. Bereid 500 μg/ml TZM-oplossing (zie Materiaaltabel) in AU565 groeimedia. Voeg op dag 4 10 μL van deze oplossing toe aan elke put, zodat de uiteindelijke concentratie in elke put 50 μg / ml is.
  2. Cultuur aggregeert gedurende 5 extra dagen na de toevoeging van TZM en beoordeelt op belangrijke tijdstippen.
    OPMERKING: Voor de huidige studie werden tijdspunten van 0 h (onmiddellijk voorafgaand aan het drogeren), 24 h en 120 h post-drug gebruikt om het medicijn te analyseren.

3. Optische coherentie tomografie beeldvorming

OPMERKING: Monsters hierin werden afgebeeld met Optical Coherence Tomography (OCT) tijdens elke dag van rijping (1-4), en vervolgens opnieuw op dag 5 (24 uur na toevoeging van het geneesmiddel) en dag 9 (120 uur na toevoeging van het geneesmiddel) voor geselecteerde gedrogeerde aggregaten. Voor de huidige studie werd een commercieel Spectral-Domain Optical Coherence Tomography (SDOCT, zie Table of Materials) systeem voor OCT-beeldvorming gebruikt. Hoewel deze aanpak voor bijna elk LGO-systeem toegankelijk is en de gevolgde procedure over het algemeen vergelijkbaar zal zijn tussen verschillende systemen, zijn sommige van de gedetailleerde stappen die volgen specifiek voor de huidige apparatuur.

  1. Gebruik een OCT-systeem voor structurele beeldvorming. Stel de A-scansnelheid in op 5,5 kHz voor het verzamelen van afbeeldingen met een hoge resolutie. Stel de brekingsindex in op 1,33 voor monsters in een vloeibaar medium. Stel de voxelgrootte in op 1,10 x 1,10 x 2,58 μm3.
  2. Stel in het venster Afbeeldingsparameters aan de rechterkant van het scherm het gezichtsveld (FOV) in door X-, Y- en Z-waarden (in mm) in te voeren, zodat het voorbeeld binnen dit interessegebied valt.
    OPMERKING: FOV voor deze studies was meestal ingesteld op 1,5 x 1,5 x 0,5 mm3. Zorg ervoor dat het monster binnen dit gebied past door de 'Angle'-ingang tussen 0 en 90 graden af te wisselen en visuele bevestiging uit te voeren.
  3. Klik op 3D-acquisitiemodus en klik vervolgens op Opnemen om de 3D-volumescan van het monster te verzamelen.

4. Beeldanalyse

  1. Exporteer het OCT-bestand naar het softwareformaat (Imaris, zie Materiaaltabel).
    1. Open het OCT-bestand in de softwareontwikkelingskit. Klik op Exporteren, stel het bestandstype in op .jpg en exporteer de afbeeldingen naar een lege map.
    2. Open de beeldverwerkingssoftware (FIJI, zie Tabel met materialen) en importeer de afbeeldingsreeks uit de map waarin de geëxporteerde JPEG's zijn opgeslagen. Gebruik software om de afbeeldingsvolgorde samen te voegen en sla dit bestand vervolgens op als een TIFF-afbeelding.
  2. Maak een volumereconstructie volgens de onderstaande stappen.
    1. Open Imaris en navigeer naar het geconverteerde TIFF-bestand in de Arena. Ga naar > afbeeldingseigenschappen bewerken en voer de voxelgrootte (in μm) van de OCT-afbeelding in de overeenkomstige XYZ-vakken in. Klik vervolgens op OK.
      OPMERKING: Schakel in de voorbeeldobjectstructuur aan de linkerkant van het scherm het tabblad Volume uit om softwarevertraging te voorkomen.
    2. Klik op Nieuwe oppervlakken toevoegen boven de objectenstructuur. Klik in het menu onder de boomstructuur op Automatisch maken overslaan en handmatig bewerken. Schuif in het venster Weergaveaanpassing handmatig met de rode en zwarte pijlen om het contrast tussen het voorbeeld en de achtergrond te verbeteren en de voorbeeldvisualisatie te verbeteren.
    3. Pas de 'Slice-positie' aan op het segment aan één rand van het sample, d.w.z. waar het samplesignaal voor het eerst verschijnt. Gebruik de escape-toets om de muis van de navigatiemodus naar de selectiemodus te wijzigen en klik vervolgens op Tekenen. Traceer handmatig de omtrek van het gebied waarin het signaal wordt weergegeven.
    4. Vervroeg de segmentpositie door de volgende positie in het invoervak in te voeren. Deze volgende positie moet ≤100 plakjes verder in het monster zijn dan de vorige. Traceer handmatig het gebied waarin het signaal wordt weergegeven.
    5. Herhaal stap 4.2.4 door de dikte van het monster totdat de tegenoverliggende rand van het monster is bereikt. Klik vervolgens op Surface maken in het linkermenu om deze segmenten aan elkaar te naaien en de volumereconstructie te voltooien.
    6. Klik op Bewerken en klik vervolgens op Maskerselectie. Hiermee wordt een nieuw kanaal in het venster Weergaveaanpassing gemaakt dat alleen het geïsoleerde voorbeeld bevat. Morfologische kenmerken van het monster zijn nu te vinden in het tabblad Statistieken > gedetailleerd .
      OPMERKING: Deze benadering werd gevolgd om de sfericiteiten en volumes te bepalen die in deze huidige studie werden gerapporteerd.
  3. Verkrijg de totale celdichtheid van een monster volgens de onderstaande stappen.
    1. Selecteer boven de objectstructuur de optie Nieuwe vlekken toevoegen. Schakel in het menu Algoritme-instellingen alle selectievakjes uit. Klik op de blauwe pijl om naar het bronkanaalscherm te gaan.
      1. Selecteer in het vervolgkeuzemenu dat wordt weergegeven het gemaskeerde kanaal dat is gemaakt in stap 5.2.8, meestal kanaal 2 genoemd. Voer de gemiddelde celdiameter voor het monster in het vak XY-diameter in. Zorg ervoor dat Achtergrondaftrek is aangevinkt.
        OPMERKING: Voor dit werk met AU565- en MDA-MB-231-cellen is de diameter ingesteld op 10 μm. Deze selectie is gebaseerd op de celgrootte (uitgelegd in de sectie Discussie).
    2. Klik op de blauwe pijl om naar het scherm Vlekken classificeren te gaan. Klik in de grafiek onder aan het menu op de linkerrand van de gele drempel en sleep deze naar de linkerrand van de grafiek, zodat alle objecten zijn opgenomen in de geel gearceerde drempel. Klik vervolgens op de groene pijl om het maken van de plek te voltooien.
    3. Verkrijg het aantal geïdentificeerde objecten (d.w.z. het aantal voorbeeldcellen) door te klikken op Statistieken > Totale > Totaal aantal vlekken.
    4. Om de gemiddelde geaggregeerde celdichtheid te bepalen, deelt u het celgetal van het aggregaat (gemeten in stap 4.3.3) door het totale volume (bepaald in stap 4.2.6).
  4. Beoordeel de regionale dichtheid in concentrische lagen van bolvormige aggregaten (Figuur 1A).
    1. Beoordeel na morfologische en celdichtheidsanalyse de regionale dichtheid. Klik op het oppervlak dat is gemaakt in stap 4.2.5 en navigeer naar het tabblad Surfaces Style/Quality . Wijzig de selectie in middelpunt en wijzig de pixelbreedte in ≤20 voor de beste zichtbaarheid. Navigeer naar Statistieken > Gedetailleerde > positie en noteer de locatie van de middelste plek.
    2. Selecteer Nieuw referentiekader toevoegen in het menu boven de objectstructuur. Schakel de selectievakjes Zichtbaar en Fix naast XY in het menu in. Klik en sleep het midden van het referentiekaderpictogram zodanig dat het in lijn is met de middelste plek. Schakel de selectievakjes XY Zichtbaar en Fix uit en selecteer deze voor XZ.
      1. Klik nogmaals op het midden van het referentiekaderpictogram en sleep het zodanig dat het in lijn is met de middelste plek. Herhaal dit ten slotte voor het YZ-vlak, afwisselend tussen deze drie vaste vlakken totdat het referentiekader perfect uitlijnt met de middelste plek. Dubbelklik op het referentiekader in de objectstructuur en hernoem het centrum of vergelijkbaar.
    3. Klik op de spots die in stap 4.3 zijn gemaakt en navigeer naar Statistics > Detailed > Position Reference Frame. Klik op Positie X Referentiekader totdat het sorteert van de hoogste naar de laagste waarde. Noteer de hoogste waarde - dit geeft de verste rand van het monster aan, d.w.z. de straal van het monster.
      OPMERKING: Aangezien de hier gebruikte monsters cirkelvormig zijn in het XY-vlak, kunnen berekeningen worden uitgevoerd langs de X- of Y-as met vergelijkbare resultaten. Voor monsters die geen X-Y-symmetrie vertonen (asymmetrisch, ellipsoïde, onregelmatige geometrieën, enz.), Wordt aanbevolen om deze analyses langs meerdere assen uit te voeren.
    4. Navigeer naar Statistieken. Klik in de rechterbenedenhoek van het menu op Alle statistieken exporteren naar bestand en sla gegevens op in een spreadsheet.
    5. Voer handmatige berekeningen uit om concentrische lagen langs de X-as te identificeren.
      OPMERKING: De in dit onderzoek gebruikte monsters hadden een diameter van ongeveer 500 μm; er zijn dus twee buitenste concentrische zones van 200 μm dik en één binnenste centrale zone van 100 μm dik. Het wordt aanbevolen om zones van 200 μm dik te handhaven, omdat het diffusiegedrag naar verwachting over deze afstand 7,28,29,30 zal veranderen. In overeenstemming met deze redenering wordt het ook aanbevolen om meer concentrische zones te gebruiken voor grotere monsters en vice versa voor kleinere monsters.
    6. Stel een buitenste laaggebied van 200 μm in door 200 μm af te trekken van de buitenradius in stap 4.4.3. Het buitenste gebied omvat dus vlekken met X-posities tussenX-straal en Xbuitenste, binnenste rand (figuur 1A, oranje gebied).
    7. Stel een overgangsgebied in door 200 μm af te trekken van Xbuitenrand, binnenrand. Het overgangsgebied omvat vlekken met X-posities tussen Xbuiten, binnenrand en Xovergangsrand, binnenrand (figuur 1A, roze gebied).
    8. Stel een centraal kerngebied in dat de resterende vlekken tussen het monstercentrum en Xovergangs-binnenrand omvat (figuur 1A, blauw gebied).
    9. Open het opgeslagen spreadsheetbestand dat is gemaakt in stap 4.4.4. Navigeer naar het tabblad Afstand tot origin-referentiekader.
    10. Bereken het aantal vlekken in het kerngebied met behulp van de functie COUNTIF (Kolomx, "< Xovergangsrand, binnenrand"), waarbij Kolomx de kolom 'Afstand tot oorsprong referentiekader' is. De resulterende waarde is het celnummer in dit gebied. Deel deze waarde door het volume van het gebied om de celdichtheid te verkrijgen.
    11. Bereken op een vergelijkbare manier het aantal cellen in het overgangsgebied met behulp van 'COUNTIF (Kolomx, "< Xbuitenrand, binnenrand") - COUNTIF(Kolomx, "> Xovergang, binnenrand").
    12. Bereken het aantal cellen in het buitenste gebied met behulp van 'COUNTIF (Kolomx,'> Xtransitionele,binnenrand').
  5. Beoordeel de regionale celdichtheid in niet-bolvormige monsters via 'Regionale pluggen' (figuur 1B).
    OPMERKING: Voor niet-bolvormige monsters die geen concentrische lagen hebben, is de 'Regional Plug'-methode ontwikkeld om lokale celdichtheid op verschillende radiale diepten in het aggregaat te bemonsteren.
    1. Herhaal stap 4.4.1-4.4.3 om het centrale referentiekader in te stellen (figuur 1B, centrale gele cirkel) en de totale straal van het monster te verkrijgen.
    2. Voer handmatige berekeningen uit om de plaatsing van referentiekaders binnen de overgangs- en buitengebieden te identificeren, zodat de celdichtheid in het monster op deze locaties kan worden beoordeeld.
      1. Om de buitenste locatie te berekenen, trekt u 50 μm af van de straalwaarde van het monster uit stap 4.5.1 en gebruikt u deze waarde als X-positie.
        OPMERKING: Gebruik dezelfde Y- en Z-positiewaarden die zijn vastgelegd in stap 4.5.1 voor alle pluggen binnen een bepaald monster om de celdichtheid langs de X-as van het monster te meten (figuur 1B, meest linkse gele cirkel).
      2. Klik boven de objectstructuur op Nieuwe vlekken toevoegen en klik op Automatische creatie overslaan, handmatig bewerken. Houd met de aanwijzer in de 'select'-modus shift+click ingedrukt om een plek op het scherm te plaatsen. Voer in het linkermenu de hierboven berekende XYZ-positiewaarden in. Stel de XY- en Z-diameters in op ≤20 voor de beste zichtbaarheid.
      3. Herhaal stap 4.4.2 om een referentiekader toe te voegen op deze locatie. Wijzig de naam van dit referentiekader in de buitenste of vergelijkbare objectstructuur.
      4. Als u de overgangslocatie (middelpunt) wilt berekenen, zoekt u het gemiddelde van deX-positiewaarde en deX-buitenste positiewaarden. Gebruik deze waarde als de X-positie voor het overgangsreferentiekader. Gebruik, zoals hierboven, dezelfde Y- en Z-waarden die zijn vastgelegd in stap 4.5.1 voor alle pluggen binnen een bepaald monster om de celdichtheid langs de X-as van het monster te meten (figuur 1B, middelste gele cirkel).
      5. Herhaal stap 4.4.2 om het middelste referentiekader op deze locatie te plaatsen en het na het maken van een andere naam te geven aan 'transitioneel' of iets dergelijks.
    3. Klik op de spots die in stap 4.3 zijn gemaakt en navigeer naar Statistieken. Klik in de rechterbenedenhoek van het menu op Alle statistieken exporteren naar bestand en sla gegevens op in een spreadsheet.
    4. Open de spreadsheet. Navigeer naar het tabblad Afstand tot origin-referentiekader. De afstand van elk object tot de referentiekaders wordt weergegeven in kolom A en de groepering van referentiekaders voor elk object wordt weergegeven in kolom G. Gebruik de functie 'MOD' om elke afstand numeriek toe te wijzen aan het bijbehorende referentiekader, waarbij 0 het middelste frame is, 1 de overgang is en 2 de buitenste.
    5. Filter de waarden in deze kolom om te werken met de afstanden in elk referentiekader. Bereken voor elk van de referentiekaders het aantal objecten binnen 50 micrometer van het frame met behulp van de functie 'COUNTIF (Kolomx, '≤50'), waarbij kolomx de kolom 'Afstand tot oorsprong referentiekader' is voor elke groep. De resulterende waarde komt overeen met het aantal cellen in die regionale plug. Deel deze waarde door het volume van de 100-μm plug om celdichtheid te verkrijgen.
  6. Voer de methode Spatially-Refined Regional Plug uit (figuur 1C).
    OPMERKING: Deze benadering werd gebruikt om de levensvatbaarheid van regionale cellen te beoordelen als reactie op de toepassing van geneesmiddelen. Het opnemen van meer referentiekaders verbetert de resolutie van celdichtheden die kunnen worden berekend over de hele modeldikte.
    1. Herhaal stap 4.4.1-4.4.3 om het middelste referentiekader in te stellen (figuur 1C, centrale gele cirkel) en de straal van het monster te verkrijgen.
    2. Voer handmatige berekeningen uit om extra interessante locaties te bepalen. Voeg hiervoor 100 μm toe aan deX-centrumwaarde en gebruik vervolgens de Y- en Z-waarden van het middelpunt om de eerste locatie langs de middenas te definiëren. Voeg een referentiekader toe aan deze positie zoals in stap 4.4.2 (figuur 1C, gele cirkel naast de middelste cirkel).
      OPMERKING: Voeg in deze stap minder μm toe als u op zoek bent naar het bijhouden van de dichtheid met een hogere resolutie.
    3. Herhaal stap 4.6.2 en voeg 100 μm (of het gewenste aantal μm) toe aan elke sequentiële X-locatie om een as van gelijk verdeelde pluggen door de dikte van het monster te maken. Plaats het laatste referentiekader ≤50 μm uit de buitenradius van het monster (figuur 1C, gele cirkels).
    4. Herhaal stap 4.5.3-4.5.5 om celtellingen binnen elke plug met een diameter van 100 μm te verkrijgen. Deel deze waarden door het volume van elke overeenkomstige plug om lokale celdichtheid te verkrijgen.
    5. Herhaal alle stappen in deze sectie voor OCT-gegevens die zijn verzameld op elk tijdstip van de geneesmiddelenstudie. Het vergelijken van het celgetal op elke locatie tijdens het behandelingstijdverloop zou moeten onthullen waar de celdichtheid afneemt (d.w.z. regio's die celdood ervaren) en bijgevolg hoe diep het medicijn binnendringt (d.w.z. welke lagen een daling van de celdichtheid zien versus die welke een toename van de celdichtheidsniveaus handhaven of vertonen).

figure-protocol-1
Figuur 1: Schematische illustratie. (A) De concentrische laag (shells) benadering voor het beoordelen van regionale celdichtheid in sferische aggregaten. (B) De regionale plugmethode is ontwikkeld om de lokale celdichtheid in niet-bolvormige aggregaten te evalueren, waarbij kleine (100 μm diameter) bolvormige pluggen (weergegeven in geel) worden gebruikt als dichtheidsindicatoren bij elke zone / dikte. (C) De ruimtelijk verfijnde regionale plugmethode wordt gebruikt voor geneesmiddelenpenetratiestudies. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In een eerdere publicatie werd een methode vastgesteld voor de niet-destructieve meting van de wereldwijde celdichtheid binnen cellulaire aggregaten met behulp van OCT10. Hierin wordt deze techniek uitgebreid om de regionale celdichtheid van ontwikkelende celaggregaten te beoordelen. Figuur 1 toont een schema van deze uitbreiding, waarbij de celdichtheid kan worden geëvalueerd in concentrische lagen van een sferoïde of meer lokaal door in plaats daarvan te kijken naar...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Betekenis
Meercellige tumorsferoïden (MCTS'en) zijn krachtige 3D in vitro modellen voor het bestuderen van tumorprogressie en medicijnscreening 1,2,3. Het bevorderen van het nut van deze relatief eenvoudige geaggregeerde modellen is sterk afhankelijk van de karakterisering van hun belangrijkste kenmerken, zoals morfologie en celdichtheid, waarvan bekend is dat ze zowel de progressie van tumormodellen...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd ondersteund door NIH R01 BRG CA207725 (MB/DTC) en NIH R01 CA233188 (MB). We willen AMC Apotheek bedanken voor de Trastuzumab die voor deze experimenten is geleverd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
96 well platesGreiner Bio-One 650970CellStar Cell-Repellent Surface, https://shop.gbo.com/nl/usa/products/bioscience/cell-culture-products/cellstar-cell-repellent-surface/
0.25% trypsin, 2.21 mM EDTACorning25-053-CI
AU565 borstkankercellenATCC
Dulbecco's Modified Eagle's MediumCorning10-013-CV
Fetaal runderserumATCC30-2020
FIJI softwareopen-source(Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3jGedownload van https://imagej.net/software/fiji/
HemocytometerFisher Scientific0267151B
Imaris beeldanalysesoftwareBitplaneHuidige versie 9.8
L-glutamineLonza17-605E
MatrigelCorning354263
MDA-MB-231 borstkankercellenATCC
MicroscoopZeissZ1 AxioVision
Penicilline streptomycineCorning30-0002CI
Centrifuge voor platenEppendorf
RPMI medium 1640Gibco11875-085
Spectral Domain Optical Coherence TomographyThorLabsTEL220C1
T75 celkweekkolvenGreiner Bio-One 658175
TrastuzumabOvergebleven klinische monsters van Trastuzumab werden gebruikt in deze studie, vriendelijk verstrekt door de Albany Medical College Pharmacy. 

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sutherland, R., JA, M., Inch, W. Growth of multicell spheroids in tissue culture as a model of nodular carcinomas. Journal of the National Cancer Institute. 46 (1), 113-120 (1971).
  2. Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
  3. Nagelkerke, A., Bussink, J., Sweep, F. C. G. J., Span, P. N. Generation of multicellular tumor spheroids of breast cancer cells: How to go three-dimensional. Analytical Biochemistry. 437 (1), 17-19 (2013).
  4. Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. The use of 3-D cultures for high-throughput screening: The multicellular spheroid model. Journal of Biomolecular Screening. 9 (4), 273-285 (2004).
  5. Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
  6. Jiang, Y., Pjesivac-Grbovic, J., Cantrell, C., Freyer, J. P. A multiscale model for avascular tumor growth. Biophysical Journal. 89 (6), 3884-3894 (2005).
  7. Freyei, J. P., Sutherland, R. M. Regulation of growth saturation and development of necrosisin EMT6/R0 multicellular spheroids by the glucose and oxygen supply. Cancer Research. 46 (7), 3504-3512 (1986).
  8. Desoize, B., Jardillier, J. C. Multicellular resistance: a paradigm for clinical resistance. Critical Reviews in Oncology Hematology. 36 (2-3), 193-207 (2000).
  9. Mellor, H. R., Ferguson, D. J. P., Callaghan, R. A model of quiescent tumour microregions for evaluating multicellular resistance to chemotherapeutic drugs. British Journal of Cancer. 93 (3), 302-309 (2005).
  10. Roberge, C. L., et al. Non-destructive tumor aggregate morphology and viability quantification at cellular resolution, during development and in response to drug. Acta Biomaterialia. 117, 322-334 (2020).
  11. Piccinini, F., Tesei, A., Bevilacqua, A. Single-image based methods used for non-invasive volume estimation of cancer spheroids a practical assessing approach based on entry-level equipment. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 135, 51-60 (2016).
  12. Imamura, Y., et al. Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer. Oncology Reports. 33 (4), 1837-1843 (2015).
  13. Song, Y., et al. Patient-derived multicellular tumor spheroids towards optimized treatment for patients with hepatocellular carcinoma. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 37 (1), 1-13 (2018).
  14. LaBarbera, D. V., Reid, B. G., Yoo, B. H. The multicellular tumor spheroid model for high-throughput cancer drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 7 (9), 819-830 (2012).
  15. Hakanson, M., Textor, M., Charnley, M. Engineered 3D environments to elucidate the effect of environmental parameters on drug response in cancer. Integrative Biology. 3 (1), 31-38 (2011).
  16. Pickl, M., Ries, C. H. Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab. Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).
  17. Huang, D., et al. Optical coherence tomography HHS public access. Science. 254 (5035), 1178-1181 (1991).
  18. Zhong, H. Q., et al. Enhancement of permeability of glycerol with ultrasound in human normal and cancer breast tissues in vitro using optical coherence tomography. Laser Physics Letters. 7 (5), 388-395 (2010).
  19. Fujimoto, J., Swanson, E. The development, commercialization, and impact of optical coherence tomography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (9), (2016).
  20. Huang, Y., et al. Optical coherence tomography detects necrotic regions and volumetrically quantifies multicellular tumor spheroids. Cancer Research. 77 (21), 6011-6020 (2017).
  21. Hari, N., Patel, P., Ross, J., Hicks, K., Vanholsbeeck, F. Optical coherence tomography complements confocal microscopy for investigation of multicellular tumour spheroids. Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).
  22. El-Sadek, I. A., et al. Three-dimensional dynamics optical coherence tomography for tumor spheroid evaluation. Biomedical Optics Express. 12 (11), 6844(2021).
  23. Kingsley, D. M., et al. Laser-based 3D bioprinting for spatial and size control of tumor spheroids and embryoid bodies. Acta Biomateralia. 95, 357-370 (2019).
  24. Absher, M. Hemocytometer counting. Tissue Culture. , 395-397 (1973).
  25. Roberge, C. L., Rudkouskaya, A., Barroso, M., Corr, D. T. Longitudinal, label-free assessment of cell density and viability in multicellular tumor spheroids via optical coherence tomography. Summer Biomechanics, Bioengineering, and Biotransport Conference. , (2020).
  26. Bellotti, C., Duchi, S., Bevilacqua, A., Lucarelli, E., Piccinini, F. Long term morphological characterization of mesenchymal stromal cells 3D spheroids built with a rapid method based on entry-level equipment. Cytotechnology. 68 (6), 2479-2490 (2016).
  27. Noto, A., et al. Stearoyl-CoA desaturase-1 is a key factor for lung cancer-initiating cells. Cell Death & Disease. 4 (12), 947(2013).
  28. Riffle, S., Hegde, R. S. Modeling tumor cell adaptations to hypoxia in multicellular tumor spheroids. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 36, 102(2017).
  29. Wilson, W. R., Hay, M. P. Targeting hypoxia in cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 11, 393-410 (2011).
  30. Grimes, D. R., Kelly, C., Bloch, K., Partridge, M. A method for estimating the oxygen consumption rate in multicellular tumour spheroids. Journal of the Royal Society Interface. 11 (92), 20131124(2014).
  31. Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacology & Therapeutics. 163, 94-108 (2016).
  32. Pozzi, S., et al. Meet me halfway: Are in vitro 3D cancer models on the way to replace in vivo models for nanomedicine development. Advanced Drug Delivery Reviews. 175, 113760(2021).
  33. Nguyen, E. H., Daly, W. T., Belair, D. G., Le, N. N., Murphy, W. L. High throughput screening format identifies synthetic mimics of matrigel for tubulogenesis screening. , Available from: https://abstracts.biomaterials.org/data/papers/2015/abstracts/547.pdf (2015).
  34. Duchnowska, R., Szczylik, C. Central nervous system metastases in breast cancer patients administered trastuzumab. Cancer Treatment Reviews. 31 (4), 312-318 (2005).
  35. Zazo, S., et al. Generation, characterization, and maintenance of trastuzumab-resistant HER2+ breast cancer cell lines. American Journal of Cancer Research. 6 (11), 2661-2678 (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Tumorsfero de modellenoptische coherentietomografie3D structurele beeldvormingImaris 3D analysedrugpenetratieborstkankeraggregatenceldichtheidsgradi ntbehandeling met trastuzumab

Gerelateerde artikelen