Hier presenteren we een protocol voor de isolatie van BMM's van SD-ratten, de secundaire therapietrouwmethode genoemd.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Isolatie van monocyten-macrofaaglijncellen uit rattenbotten door secundaire therapietrouwmethode
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Met een afname van de botmineraaldichtheid hebben botten meer kans om te breken, waardoor de kwaliteit van leven van een patiënt negatief wordt beïnvloed. De groei en ontwikkeling van botten worden voornamelijk gereguleerd door osteoblasten en osteoclasten. Het is algemeen aanvaard dat osteoclasten zijn afgeleid van beenmergmonocyten-macrofaagcellen (BMM's). BMM's en andere hematopoëtische stamcellen bevinden zich in de beenmergholte. Daarom is het isoleren van enkele stabiele BMM's van verschillende en heterogene celpopulaties een enorme uitdaging. Hier presenteren we een protocol voor de isolatie van BMM's van SD-ratten, de secundaire therapietrouwmethode genoemd. Adherente cellen gekweekt gedurende 24-48 uur in primaire cultuur werden verzameld. Flowcytometrische analyse toonde aan dat ongeveer 37,94% van de cellen CD11b/c+ (monocyte-macrofaag oppervlakteantigeen) waren. Tartraatresistente zuurfosfatase (TRAP) kleuring en western blot analyse toonden aan dat BMM's in vitro konden differentiëren in osteoclasten. De bovenstaande bevindingen suggereerden dat de secundaire adherentiecellen kunnen worden beschouwd als een geschikt cellulair model voor onderzoek naar osteoclastendifferentiatie.
Inleiding
Er is gemeld dat monocyten-macrofaag afstammingscellen in het beenmerg kunnen differentiëren in bloedmonocyten en weefselmacrofagen 1,2. De bovenstaande cellen, die kunnen differentiëren in osteoclasten om botgroei en -ontwikkeling in evenwicht te brengen, worden vaak gebruikt als een celmodel om osteoclasten in vivo te induceren 3,4. Beenmerg is een speciaal weefsel dat verschillende soorten cellen bevat, waaronder maar niet alleen beperkt tot mesenchymale stamcellen in het beenmerg, beenmergmonocyten-macrofaagcellen (BMM's), hematopoëtische stamcellen, endotheelcellen en immuuncellen. In feite suggereerden verschillende eerdere studies dat aanhankelijke cellen die uit de beenmergholte van het lange bot werden gehaast, konden differentiëren in osteoblasten, osteoclasten, chondrocyten of adipocyten 5,6,7,8. Hoewel verschillende isolatie- en kweekmethoden zijn gebruikt om verschillende homogene celpopulaties te produceren, zijn er nog steeds grote uitdagingen bij het isoleren en kweken van BMM's uit een verscheidenheid aan verschillende celtypen.
Er zijn verschillende methoden ontwikkeld om mononucleaire macrofagen (BMSC's) in het beenmerg te extraheren. De meeste van deze methoden zijn echter complex 9,10,11. Dichtheidsgradiëntcentrifugatie vereist bijvoorbeeld een gespecialiseerde kit en de bewerking is tijdrovend en omslachtig. Deze methode is geschikt voor de isolatie van BMM's uit bloedmonsters met een hoog volume, maar niet uit beenmergmonsters 9,12,13. Bovendien is het extraheren van weefselmonsters met behulp van collagenasevertering een complexe en tijdrovende procedure; deze methode wordt niet aanbevolen voor de isolatie van BMM's uit beenmergmonsters14,15. Bovendien, hoewel stroomscheiding kan resulteren in sterk gezuiverde monocyten/ macrofaagpopulaties, vereist het zeer grote steekproefgroottes en hoge instrument- en apparatuurvereisten10,16. Bovendien is de microbead-verrijkingsmethode extreem duur en niet haalbaar in een algemeen laboratorium17.
Daarom werd in de huidige studie een handige, snelle en goedkope methode voorgesteld voor de isolatie van mononucleaire macrofagen uit het beenmerg. Beenmergcellen die voor verschillende tijdspunten werden gehecht, werden gebruikt om BMM's te isoleren met behulp van een secundaire hechtingsmethode. BMM's geëxtraheerd met de bovenstaande methode kunnen de vorming van osteoclasten in vitro induceren, waardoor een eenvoudig en handig celmodel wordt geboden voor de toekomstige studie van osteoporose in vitro.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle experimenten in deze studie werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen voor dierproeven van het Zhejiang Chinese Medical University Laboratory Animal Research Center (goedkeuringsnummer: IACUC-20181029-11).
1. Celextractie
- Zet de Sprague-Dawley ratten (SD ratten, 1-10 dagen oud, mannetje of vrouwtje) in de euthanasiekooien gevuld met CO2 met een gebalanceerde snelheid van 30%-70% containervolume/minuut. Nadat de ratten het bewustzijn verliezen (20-60 min), euthanaseert u de rat door cervicale dislocatie om een pijnloze dood te garanderen.
- Dompel de ratten gedurende 10 minuten onder in 75% alcohol voor desinfectie.
- Verwijder voorzichtig alle ledematen van de rat met een schaar en tang, aspirateer met PBS met behulp van een pipet en spoel het bloed dat zich aan de ledematen hecht.
- Voeg 5 ml penicilline/streptomycine-oplossing toe aan 500 ml DMEM en meng goed. Neem een steriele centrifugebuis van 50 ml, voeg 5 ml FBS en 45 ml DMEM-medium toe en meng grondig om een 10% FBS DMEM te verkrijgen die 1% penicilline / streptomycine-oplossing bevat. Voeg 2 ml van het bovenstaande kweekmedium toe aan een buis van 5 ml.
- Breng de beenderen van de ledematen over in de buis van 5 ml. Gebruik een schaar om de beenderen in de buis in kleine stukjes (1-3 mm) te knippen en meng het homogenaat om de beenmergcellen opnieuw in het kweekmedium te laten zweven. Blijf 5 minuten staan totdat de weefselfragmenten zich op de bodem van de buis hebben genesteld.
- Voeg 10 ml 10% FBS DMEM toe aan een kweekschaal van 100 mm en breng het supernatant vervolgens over in de kweekschaal. Vermijd bij het aanzuigen van het supernatant het overbrengen van het weefselresten in de kweekschaal.
- Incubeer bij 37 °C en 5% CO2 gedurende ongeveer 24 uur. Na deze incubatietijd zal de meerderheid van de mesenchymale stamcellen zich hechten aan de kweekschaalwand en langzaam groeien, terwijl de meeste BMM's nog steeds in het kweekmedium worden opgehangen.
- Breng de celsuspensie over in de kweekschaal van 100 mm in een nieuwe kolfvan 25 cm 2 en blijf de cellen kweken bij 37 °C en 5% CO2 gedurende nog eens 24 uur. BMM's hechten zich aan de kolfwand bij 24-48 uur cultuur. Verwijder het oude medium voorzichtig en vervang het door een vers medium nadat BMM's zich aan de kolfwand hebben gehecht.
- Subcultuur wanneer de cellen in de kolf 80% -90% samenvloeiing bereikten.
OPMERKING: Alle cellen werden gekweekt bij 37 °C en 5% CO2. Tijdens de kweek werd de celmorfologie geleidelijk verenigd. Cellen waren groot, onregelmatig gevormd, radiaal groeiend en bevestigd aan de kolf in een vorm van schijf, waar meerdere kernen konden worden waargenomen.
2. FACS-kleuring van de cel
- Trypsine verteren met behulp van 1-2 ml commercieel trypsine bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 5 minuten en tellen secundaire aanhangcellen om een uiteindelijke celtelling van 100.000 /monster te garanderen (telcellen met Neubauer-hemocytometer).
- Verdeel de cellen in drie groepen (500 μL PBS bevat 100.000 cellen): (1) de lege controlegroep met niet-gekleurde cellen; 2) de isotypegroep; en (3) de experimentele groep (CD11b/c-kleuring).
- Incubeer primaire antilichamen (geen antilichaam voor de blanco controlegroep; anti-CD11 isotypecontrole voor de isotypecontrolegroep, 0,6 μL antilichaam/monster, 1 μg/monster; anti-CD11b/c voor de experimentele groep, 1 μL antilichaam/monster, 1 μg/monster) op ijs gedurende 30 minuten.
- Centrifugeer bij 300-350 x g gedurende 5 minuten, gooi het supernatant weg en resuspenseer de cellen met 500 μL PBS. Herhaal de bovenstaande procedure eenmaal om ervoor te zorgen dat de ongebonden primaire antilichamen worden weggespoeld.
- Incubeer het overeenkomstige secundaire antilichaam (geen antilichaam voor de blanco controlegroep; geiten-anti-konijn IgG voor de isotypecontrole en de experimentele groepen, 0,25 μL antilichaam /monster, 1:2.000) op ijs in het donker gedurende 30 minuten.
- Centrifugeer bij 300-350 x g gedurende 5 minuten, gooi het supernatant weg en resuspenseer de cellen met 500 μL PBS. Herhaal de bovenstaande procedure eenmaal om ervoor te zorgen dat de ongebonden tweede antilichamen worden weggespoeld.
- Detecteer de CD11b/c positieve cellen door middel van flowcytometrie (10.000 cellen/monster) en analyseer de gegevens met software (bijv. FlowJo 7.5).
OPMERKING: Om het uiteindelijke percentage CD11b/c+ cellen te verkrijgen, werd de volgende formule gebruikt: Percentage CD11b / c + cellen in de experimentele groep - het percentage CD11 + cellen in de isotype controlegroep.
3. Wright-Giemsa kleuring
- Zaai de aanhangende secundaire cellen die drie keer zijn gepasseerd op 35 mm 2-celklimplaten (1 × 106 cellen / put) en kweek bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 24 uur.
- Gooi het kweekmedium weg en was driemaal met PBS.
- Voeg Wright-Giemsa kleurstofoplossing (0,5 ml-0,8 ml) gedurende 1 min toe aan het klimblad van de cel.
- Meng de kleurstof met gedestilleerd water (0,5 ml-0,8 ml) met een wattenstaafje en laat 10 minuten staan.
- Was de kleurstofoplossing met gedestilleerd water en droog vervolgens gedurende 1-3 minuten. Observeer onder een microscoop.
4. VAL vlekken
- Zaai de aanhangende secundaire cellen die drie keer zijn gepasseerd op 35 mm 2-celklimplaten (1 × 106 cellen / put) en kweek bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 24 uur.
- Vervang het oude medium door het 10% FBS DMEM of osteoclastische inductiemedium aangevuld met 50 ng/ml receptoractivator van nucleaire factor-κB ligand (RANKL) en 30 ng/ml macrofaagkoloniestimulerende factor (M-CSF), en kweek bij 37 °C en 5% CO2 gedurende nog eens 7 dagen.
- Kleur de cellen met de TRAP-kleuringskit volgens het protocol van de fabrikant en observeer onder een microscoop.
OPMERKING: TRAP-positieve cellen werden gedefinieerd als osteoclasten, die paars waren onder een lichtmicroscoop. Het aantal TRAP-positieve cellen werd gemeten met behulp van ImageJ-software.
5. Westerse vlek
- Zaai de aanhangende secundaire cellen die drie keer zijn gepasseerd op 35 mm 2-celklimplaten (1 × 106 cellen / put) en kweek gedurende 24 uur.
- Vervang het oude medium door vers 10% FBS DMEM of osteoclastisch inductiemedium (50 ng/ml RANKL en 30 ng/ml M-CSF) en kweek gedurende nog eens 7 dagen bij 37 °C en 5% CO2.
- Extraheer totale cellulaire eiwitten met RIPA-buffer, gescheiden door 10% SDS-PAGE, en breng over naar polyvinylideenfluoridemembranen18,19.
- Blok met 5% skimmilk poeder (25 ml) gedurende 2 uur en was drie keer, gedurende 10 minuten elke keer, met TBS-Tween 20 (TBST).
- Incubeer primaire antilichamen bij 4 °C 's nachts (anti-β-actine, anti-TRAP en anti-cathepsine K; alle primaire antilichamen werden verdund 1:1.000, 10 ml verdund antilichaam / band) en was driemaal met TBST.
- Incubeer het secundaire antilichaam (geitenantikonijn IgG, 1:2.000 verdunning, 10 ml verdund antilichaam / band) bij kamertemperatuur gedurende 2 uur en was driemaal met TBST. Visualiseer de eiwitbanden met behulp van een ontwikkelende oplossing.
OPMERKING: De expressieniveaus van de bovenstaande eiwitten werden genormaliseerd tot β-actine.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De secundaire aanhangende celpopulatie was stabiel en uniform. Met de continue celproliferatie werd de meerderheid van de cellen groter, met een onregelmatige vorm en groeide uit tot een radiale hechtingsschijf (figuur 2C,D). Flowcytometrie toonde aan dat het percentage cellen dat CD11b/c tot expressie bracht, een moleculaire marker op het oppervlak van monocyt-macrofaagafstammingscellen, ongeveer 37,94% was (figuur 2A
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Osteoclasten zijn een van de belangrijkste celtypen die betrokken zijn bij het optreden en de ontwikkeling van botziekten, evenals een van de primaire objecten van onderzoek naar botziekten20. Monocyten/macrofagen kunnen differentiëren in osteoclasten. Omdat mononucleaire macrofagen (RAW264.7-cellen) te duur zijn om te kopen en gemakkelijk worden geactiveerd tijdens het kweken, is het moeilijk om in vitro differentiatie-experimenten uit te voeren met behulp van deze cellijn. Hoewel er ver...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat ze geen tegenstrijdige belangen hebben.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de Natural Science Foundation van de provincie Zhejiang (subsidienr. LY19H060001) en het Zhejiang Traditional Chinese Medicine Science and Technology Plan Project (nr. 2022ZB093).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 35 mm2 cell climbing slices | NEST Biotechnology | 80102 | |
| Anti-cathepsin K | Abcam | ab19027 | 1:1.000 |
| Anti-CD11 isotype control | Abcam | ab172730 | 1 μg/test, 1.675 mg/ml |
| Anti-CD11b/c | Absin | abs124232 | 1μg/test, 1 mg/mL |
| Anti-TRAP | Abcam | ab191406 | 1:1.000 |
| Anti-β-actin | Beyotime | AF5003 | 1:1.000 |
| Cell climbing slices | NEST Biotechnology | 80102 | |
| Cell culture dish | corning | 430167 | |
| Cell culture flask | corning | 430168 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Gibco | C11995500BT | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10099141C | |
| Goat anti-rabbit IgG | Abcam | ab150077 | voor IF, 1:2.000 |
| goat anti-rabbit IgG | Abcam | ab6721 | voor WB, 1:2.000 |
| M-CSF | Pepro tech | 400-28 | |
| PBS | Biosharp | BL302A | |
| RANKL | Pepro tech | 400-30 | |
| SD rat | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd | 1-10 dagen oud | |
| SDS-PAGE gel preparation kit | Solarbio | P1200 | |
| TRAP/ALP Staining Kit | Wako | 294-67001 | |
| Trypsin-EDTA solution | Biosharp | BL512A | |
| Wright-Giemsa solution | Keygen Biotech | KGA225-1 |
Referenties
- Jakubzick, C. V., Randolph, G. J., Henson, P. M. Monocyte differentiation and antigen-presenting functions. Nature Reviews. Immunology. 17 (6), 349-362 (2017).
- Locati, M., Curtale, G., Mantovani, A. Diversity, mechanisms, and significance of macrophage plasticity. Annual Review of Pathology. 15 (1), 123-147 (2020).
- Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
- Ono, T., Nakashima, T. Recent advances in osteoclast biology. Histochemistry and Cell Biology. 149 (4), 325-341 (2018).
- Zhou, X., et al. Wnt/ß-catenin-mediated p53 suppression is indispensable for osteogenesis of mesenchymal progenitor cells. Cell Death & Disease. 12 (6), 521-534 (2021).
- Yu, Q., Zhao, B., He, Q., Zhang, Y., Peng, X. B. microRNA-206 is required for osteoarthritis development through its effect on apoptosis and autophagy of articular chondrocytes via modulating the phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B-mTOR pathway by targeting insulin-like growth factor-1. Journal of Cellular Biochemistry. 120 (4), 5287-5303 (2019).
- Li, Z., MacDougald, O. A. Preclinical models for investigating how bone marrow adipocytes influence bone and hematopoietic cellularity. Best Practice & Research. Clinical Endocrinology & Metabolism. 35 (4), 101547-101560 (2021).
- Horowitz, M. C., et al. marrow adipocytes. Adipocyte. 6 (3), 193-204 (2017).
- Maridas, D. E., Rendina-Ruedy, E., Le, P. T., Rosen, C. J. Isolation, culture, and differentiation of bone marrow stromal cells and osteoclast progenitors frommice. Journal of Visualized Experiments. (131), e56750(2018).
- Schyns, J., et al. Non-classical tissue monocytes and two functionally distinct populations of interstitial macrophages populate the mouse lung. Nature Communications. 10 (1), 3964-3980 (2019).
- Atif, S. M., Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V. Isolation and identification of interstitial macrophages from the lungs using different digestion enzymes and staining strategies. Methods in Molecular Biology. 1784, 69-76 (2018).
- Scheven, B. A., Milne, J. S., Robins, S. P. A sequential culture approach to study osteoclast differentiation from nonadherent porcine bone marrow cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 34 (7), 568-577 (1998).
- Bradley, E. W., Oursler, M. J. Osteoclast culture and resorption assays. Methods in Molecular Biology. , 19-35 (2008).
- Yu, Y. R., et al. Flow cytometric analysis of myeloid cells in human blood, bronchoalveolar lavage, and lung tissues. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 54 (1), 13-24 (2016).
- Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V. A consistent method to identify and isolate mononuclear phagocytes from human lung and lymph nodes. Methods in Molecular Biology. 1799, 381-395 (2018).
- Jacquin, C., Gran, D. E., Lee, S. K., Lorenzo, J. A., Aguila, H. L. Identification of multiple osteoclast precursor populations in murine bone marrow. Journal of Bone and Mineral Research. 21 (1), 67-77 (2006).
- Gibbings, S. L., et al. Three unique interstitial macrophages in the murine lung at steady state. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 66-76 (2017).
- Higashi, S. L., et al. Ultra-high-speed western blot using immunoreaction enhancing technology. Journal of Visualized Experiments. (163), e61657(2020).
- Gallagher, S., Chakavarti, D. Immunoblot analysis. Journal of Visualized Experiments. 20 (16), 759(2008).
- Yin, Z., et al. Glycyrrhizic acid suppresses osteoclast differentiation and postmenopausal osteoporosis by modulating the NF-κB, ERK, and JNK signaling pathways. European Journal of Pharmocology. 859, 172550(2019).
- Liu, F., et al. LRRc17 controls BMSC senescence via mitophagy and inhibits the therapeutic effect of BMSCs on ovariectomy-induced bone loss. Redox Biology. , (2021).
- Jin, X., et al. Thioacetamide promotes osteoclast transformation of bone marrow macrophages by influencing PI3K/AKT pathways. Journal of Orthopedic Surgery and Research. 17 (1), 53-63 (2022).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
