Analyse van cardiale contractiele disfunctie en Ca2+ transiënten in knaagdiermyocyten

Summary

Er wordt een reeks protocollen gepresenteerd die de meting van de contractiele functie beschrijven via sarcomeerlengtedetectie samen met calcium (Ca²⁺) voorbijgaande meting in geïsoleerde rattenmyocyten. De toepassing van deze aanpak voor studies in diermodellen van hartfalen is ook inbegrepen.

Abstract

Contractiele disfunctie en Ca²⁺ transiënten worden vaak geanalyseerd op cellulair niveau als onderdeel van een uitgebreide beoordeling van cardiale letsels en / of remodellering. Een benadering voor het beoordelen van deze functionele veranderingen maakt gebruik van onbelaste verkorting en Ca^{2 +} voorbijgaande analyses in primaire volwassen cardiale myocyten. Voor deze aanpak worden volwassen myocyten geïsoleerd door collagenasevertering, Ca^{2 +} tolerant gemaakt en vervolgens gehecht aan laminine-gecoate coverslips, gevolgd door elektrische pacing in serumvrije media. Het algemene protocol maakt gebruik van volwassen cardiale myocyten bij ratten, maar kan gemakkelijk worden aangepast voor primaire myocyten van andere soorten. Functionele veranderingen in myocyten van gewonde harten kunnen worden vergeleken met sham myocyten en/of met in vitro therapeutische behandelingen. De methodologie omvat de essentiële elementen die nodig zijn voor myocytenpacing, samen met de celkamer en platformcomponenten. Het gedetailleerde protocol voor deze aanpak omvat de stappen voor het meten van onbelaste verkorting door sarcomeerlengtedetectie en cellulaire Ca^{2 +} transiënten gemeten met de ratiometrische indicator Fura-2 AM, evenals voor ruwe gegevensanalyse.

Introduction

De analyse van de hartpompfunctie vereist vaak een reeks benaderingen om voldoende inzicht te krijgen, vooral voor diermodellen van hartfalen (HF). Echocardiografie of hemodynamische metingen geven inzicht in in vivo cardiale disfunctie¹, terwijl in vitro benaderingen vaak worden gebruikt om te identificeren of disfunctie ontstaat door veranderingen in het myofilament en/of de Ca²⁺ transiënt die verantwoordelijk is voor het koppelen van excitatie, of het actiepotentiaal, met contractiele functie (bijv. Excitatie-contractie [E-C] koppeling). In vitro benaderingen bieden ook de mogelijkheid om de functionele respons op neurohormonen, vector-geïnduceerde genetische veranderingen en potentiële therapeutische middelen² te screenen voordat dure en / of moeizame in vivo behandelingsstrategieën worden nagestreefd.

Er zijn verschillende benaderingen beschikbaar om de in vitro contractiele functie te onderzoeken, waaronder krachtmetingen in intacte trabeculae³ of gepermeabiliseerde myocyten⁴, evenals onbelaste verkorting en Ca²⁺ transiënten in intacte myocyten in de aan- en afwezigheid van HF ^5,6. Elk van deze benaderingen richt zich op de cardiale myocytencontractiele functie, die direct verantwoordelijk is voor de hartpompfunctie ^2,7. De analyse van zowel contractie als E-C-koppeling samen wordt echter meestal uitgevoerd door verkorting van de spierlengte en Ca²⁺ transiënten in geïsoleerde, Ca²⁺ tolerante volwassen myocyten te meten. Het laboratorium maakt gebruik van een gedetailleerd gepubliceerd protocol om myocyten uit rattenharten te isoleren voor deze stap⁸.

Zowel de Ca²⁺ transiënten als myofilamenten dragen bij aan verkorting en herverlenging in intacte myocyten en kunnen bijdragen aan contractiele disfunctie ^2,7. Deze aanpak wordt dus aanbevolen wanneer in vitro functionele analyse een intacte myocyt vereist die de Ca²⁺ fietsmachines plus de myofilamenten bevat. Intacte geïsoleerde myocyten zijn bijvoorbeeld wenselijk voor het bestuderen van de contractiele functie na het wijzigen van de myofilament- of Ca²⁺ fietsfunctie via genoverdracht⁹. Daarnaast wordt een intacte myocytenbenadering voorgesteld voor het analyseren van de functionele impact van neurohormonen bij het bestuderen van de impact van downstream tweede boodschapper signaleringsroutes en /of respons op therapeutische middelen². Een alternatieve meting van belastingsafhankelijke kracht in enkele myocyten wordt meestal uitgevoerd na membraanpermeabilisatie (of skinning) bij lage temperaturen (≤15 °C) om de Ca²⁺ voorbijgaande bijdrage te verwijderen en zich te concentreren op myofilamentfunctie¹⁰. De meting van belastingsafhankelijke kracht plus Ca²⁺ transiënten in intacte myocyten is zeldzaam, grotendeels vanwege de complexe en technische uitdaging van de aanpak¹¹, vooral wanneer een hogere doorvoer nodig is, zoals voor het meten van reacties op neurohormone signalering of als een scherm voor therapeutische middelen. De analyse van cardiale trabeculae overwint deze technische uitdagingen, maar kan ook worden beïnvloed door niet-myocyten, fibrose en / of extracellulaire matrixremodellering². Elk van de hierboven beschreven benaderingen vereist een preparaat dat volwassen myocyten bevat, omdat neonatale myocyten en myocyten afgeleid van induceerbare pluripotente stamcellen (iPSC's) nog niet het volledige complement van volwassen myofilamenteiwitten tot expressie brengen en meestal het niveau van myofilamentorganisatie missen dat aanwezig is in de volwassen staafvormige myocyt². Tot op heden wijst bewijs in iPSC's erop dat de volledige overgang naar volwassen isovormen meer dan 134 dagen in cultuur¹² overschrijdt.

Gezien de focus van deze collectie op HF, omvatten de protocollen benaderingen en analyse om contractiele functie te onderscheiden in falende versus niet-falende intacte myocyten. Representatieve voorbeelden worden gegeven van rattenmyocyten die 18-20 weken na een supra-renale coarctatie zijn bestudeerd, eerder beschreven ^5,13. Vervolgens worden vergelijkingen gemaakt met myocyten van met sham behandelde ratten.

Het hier beschreven protocol en beeldvormingsplatform worden gebruikt om veranderingen in verkorting en Ca²⁺ transiënten in staafvormige hartmyocyten tijdens de ontwikkeling van HF te analyseren en te monitoren. Voor deze analyse worden 2 x 10⁴ Ca²⁺-tolerante, staafvormige myocyten verguld op 22 mm² laminine-gecoate glazen coverslips (CSs) en 's nachts gekweekt, zoals eerder beschreven⁸. De componenten die voor dit beeldvormingsplatform zijn geassembleerd, samen met de media en buffers die worden gebruikt voor optimale beeldvorming, zijn opgenomen in de materiaaltabel. Een gids voor data-analyse met behulp van een software en de representatieve resultaten worden hier ook gegeven. Het algemene protocol is onderverdeeld in afzonderlijke subsecties, waarbij de eerste drie secties zich richten op geïsoleerde rattenmyocyten en gegevensanalyse, gevolgd door cellulaire Ca^{2 +} voorbijgaande experimenten en gegevensanalyse in myocyten.

Protocol

Studies uitgevoerd op knaagdieren volgden het public health service policy on humane care and use of laboratory animals en werden goedgekeurd door de University of Michigan Institutional Animal Care and Use Committee. Voor deze studie werden myocyten geïsoleerd uit 3-34 maanden oude Sprague-Dawley en F344BN ratten met een gewicht van ≥ 200 g⁵. Zowel mannelijke als vrouwelijke tarieven werden gebruikt.

1. Myocytenpacing voor contractiele functiestudies

1. Maak verse op M199 gebaseerde media voor elke set geïsoleerde myocyten (Tabel met materialen). 1 dag voor het pacen, plaat 2 x 10⁴ Ca²⁺-tolerante, staafvormige myocyten op 22 mm² laminine-gecoate glazen coverslips (CSs), zoals eerder beschreven⁸.
2. Om de kamers te bereiden, weekt u elke kamer gedurende 1 uur in 10% bleekmiddel. Spoel vervolgens de kamers met stromend kraanwater gedurende 30-45 minuten, gevolgd door gedestilleerd water dat elke 5 minuten gedurende 30 minuten wordt vervangen, gevolgd door gedeïoniseerd water dat elke 5 minuten gedurende 30 minuten wordt vervangen en een laatste spoeling in gedeïoniseerd water.
3. Droog de kamers op een schoon oppervlak gedurende 20-30 minuten (aanvullende figuur 1A-C). Vervolgens behandelt UV de kamers in een bioveiligheidskast gedurende 5 minuten in elke richting (totaal = 20 min). Deze stap is niet nodig voor vooraf gesteriliseerde kamers.
   LET OP: Verlaat het gebied om uv-blootstelling te minimaliseren.
4. Verwijder het deksel uit de kamer, voeg 3 ml op M199 gebaseerde media (zie materiaaltabel) toe aan elke put (aanvullende figuur 1B), vervang de deksel en verwarm de kamer voor in een incubator van 37 °C met 5% CO₂ en 20% O₂.
5. Steriliseer een tang in een hete kraalsterilisator bij 250 °C gedurende 20-25 s. Breng de voorverwarmde stimulatiekamer over van de incubator naar een bioveiligheidskast.
6. Breng elke coverslip (CS) met cardiale myocyten over naar individuele putten in de stimulatiekamer met behulp van een steriele tang. Breng CSs vier tegelijk over, gevolgd door verwarming gedurende 10 minuten voorafgaand aan de overdracht van de resterende vier CS'en om de mediatemperatuur te handhaven.
7. Bevestig bananenaansluitingen aan de stimulatiekamer aan het ene uiteinde (aanvullende figuur 1C) en aan de stimulator aan het andere uiteinde (aanvullende figuur 1D).
8. Stel de stimulatorfrequentie in op 0,2 Hz en stel de spanning (~ 12 V) in om contractie te bereiken in ~ 10% -20% van alle staafvormige hartmyocyten in een put. Om het aantal samentrekkende myocyten te bepalen, plaatst u de kamer onder een omgekeerde microscoop met een vergroting van 4x tot 10x.
9. Plaats de stimulatiekamer in een couveuse bij 37 °C in 5% CO₂ (aanvullende figuur 1E). Vervang de media elke 12 uur met behulp van media die voorverwarmd zijn in een 37 °C, 5% CO_2-incubator gedurende 20-25 minuten. Ga door met elektrische stimulatie gedurende maximaal 3 dagen met de media elke 12 uur vervangen.

2. Contractiele functieanalyse van volwassen cardiale myocyten bij ratten

1. Verwarm een gelpack en media voor in een incubator van 37 °C gedurende 30 minuten voorafgaand aan het experiment.
2. Schakel de componenten van het contractiele functieplatform in die zijn vermeld in de tabel met materialen en worden weergegeven in aanvullende figuur 2, met speciale aandacht voor de belangrijkste componenten, waaronder een antitrillingstabel (aanvullende figuur 2A-1) met een omgekeerde microscoop met een dieprood (590 nm) filter (aanvullend figuur 2A-2,3) en CCD-camera (aanvullende figuur 2A-4) aangesloten op een CCD-controller (aanvullende figuur 2A-5 en Aanvullende figuur 2C-5) en geïntegreerd met een pc-computer (aanvullende figuur 2B-14).
3. Monteer slangen in de peristaltische pomp (aanvullende figuur 2A-8; Aanvullende figuur 2A-8), breng het voorverwarmde gelpakket over in de buishouder (aanvullende figuur 2A-9) en schakel het vacuüm (aanvullende figuur 2A-11) en de voeding naar de celstimulator in (aanvullende figuur 2B-13).
4. Plaats een buis van 50 ml met media in de geïsoleerde buishouder (aanvullende figuur 2A-9) en begin met perfusie bij ~ 0,5 ml / min door de peristaltische pompslang (aanvullende figuur 2E-8).
5. Voeg een kleine hoeveelheid voorverwarmd medium toe aan een kleine weegboot (~ 2 ml). Breng één CS met myocyten over van de stimulatiekamer naar de weegboot. Breng de stimulatiekamer terug naar 37 °C in de 5% CO_2-incubator .
6. Verwijder de CS van de weegboot en veeg de onderkant voorzichtig af. Breng de CS over in een vers ingevette CS-kamer (aanvullende figuur 2A, F-10; zwarte pijl) en voeg voorzichtig een druppel media (~ 200 μL) toe aan de CS.
7. Plaats een platina-elektrodebevestiging over de CS (aanvullende figuur 2F; grijze pijl) en leg een nieuwe CS over de bovenkant met behulp van een tang. Plaats een bovenste bevestiging (aanvullende figuur 2F; witte pijl) over de CS-sandwich en installeer vervolgens twee of vier # 0 pankopschroeven om de montage van de kamer te voltooien.
8. Zodra de media in de pompbuis aanwezig zijn, bevestigt u de slang aan de voorverwarmer en sluit u de voorverwarmer aan op de CS-kamer die in stap 2.7 is geassembleerd. Begin met de perfusie op 0,5 ml /min en plaats een doekje onder de kamer om er zeker van te zijn dat er geen lekken zijn.
9. Plaats de CS-kamer in de podiumadapter. De doordrenkte media worden verzameld aan het andere uiteinde van de kamer met buizen die zijn aangesloten op een vacuümsysteem. Schakel het verwarmingssysteem in (aanvullende figuur 2A, D-7) en breng de kamer, het objectief en de voorverwarmer gedurende ~ 5-10 minuten in evenwicht om een constante mediatemperatuur van 37 °C te bereiken. Visualiseer myocyten met het 40x water onderdompelingsobjectief op de microscoop tijdens deze evenwichtstijd.
10. Activeer de pacingstimulator (aanvullende figuur 2B-13) door de spanning in te stellen op 1,5x de instelling die nodig is om 80% van de staafvormige cellen samen te trekken, wat meestal 35-40 V is. Stel de stimulatiefrequentie in op 0,2 Hz om de contractiele functie en myocytenoverleving te optimaliseren.
11. Verzamel contractiele verkortings- en herverlengingssporen van continu doordrenkte en getemporeerde myocyten. Om verkortingsmetingen te verzamelen, gebruikt u een CCD-camera (aanvullende figuur 2A-4) die is aangesloten op een CCD-controller (aanvullende figuur 2B-5, C) en een speciale computer met een I/O-controllerkaart (aanvullende figuur 2B-14; zie materiaaltabel). Het platform meet sarcomeerverkorting in myocyten van ratten, hoewel vergelijkbare resultaten worden verkregen uit myocytenmetingen verzameld aan de lengteranden van myocyten (zie Ecklerle et ^al.14).
12. Als u sarcomeerverkortingssporen wilt verzamelen, opent u de software op de computer, selecteert u OK en vervolgens Bestand > Nieuw. Bereid een schermsjabloon voor door Traces > Gebruikerslimieten bewerken > Sarcomere-lengte te selecteren en vervolgens maximum- en minimumwaarden in te stellen, die meestal tussen 2,0 μm en 1,5 μm liggen. Kalibreer de CCD-camera met een graticule van 0,01 mm voordat de myocyten worden gemeten (figuur 1D).
13. Als u sporen van de sarcomeerlengte wilt vastleggen, selecteert u Bestand > Nieuw. Identificeer een samentrekkende myocyt en plaats de myocyt langs de lengteas van de camera, zodat het dwarsdoorsnedepatroon verticaal is (figuur 1B).
14. Gebruik de computermuis om het vak 'area of interest' (ROI) (roze vak) over de myocyt te plaatsen (figuur 1C). Selecteer Verzamelen en starten om de contractiele functie vast te leggen. Record verkorting gedurende 60 s van elke myocyt bij lage stimulatiefrequenties (≤0,5 Hz).
15. Registreer sarcomeerverkorting van 5-10 cellen per CS. Voer metingen uit bij 1 cel/CS als studies behandeling met agonisten/antagonisten omvatten. Bereid afzonderlijke voorverwarmde media en een ander, speciaal stuk perfusiebuis voor dat in een meerkanaals peristaltische pomp is geladen en volg de stappen 2.9.-2.14. om de impact van medicijn- of neurohormoonafgifte op de contractiele functie van myocyten te meten.
16. Om verkorting over een reeks frequenties te meten, versnelt u myocyten op elke frequentie om steady-state verkorting te verkrijgen voordat^{u 5 opneemt}. Verdubbel voor deze studies de perfusiesnelheid en begin met het opnemen van 15-20 s na stimulatie op een nieuwe frequentie om consistente steady-state contractiele responsen te verkrijgen voor frequenties in het bereik van 0,2 Hz en 2 Hz. Neem doorgaans niet meer dan 2 myocyten / CS op voor verkorting over het gegeven bereik van stimulatiefrequenties.
17. Neem ten minste 7 contracties/cellen op om betrouwbare signaalgemiddelde gegevens te verkrijgen bij het analyseren van de opnames (zie stap 3.).

3. Gegevensanalyse van de contractiele functie in geïsoleerde myocyten

1. Selecteer om te beginnen Bestand, kies een opgenomen tracering en selecteer vervolgens Openen. Selecteer Tab 1 (linkerkant) van de basistracering en stel vervolgens het gele paneel boven aan de trace in op Sarc-Length. Selecteer Traces en de schermsjabloon die in stap 2.12 zijn voorbereid.
2. Als u een analysesjabloon wilt voorbereiden, selecteert u Bewerkingen, Monotone transiënte analyseopties, TTL-gebeurtenismarkering in het vak Definitie van t0 en de volgende opties in het menu: Basislijn (rustsarcomeerlengte), Vertreksnelheid ten opzichte van t0 (dep v), Piek (piekhoogte en %piekhoogte/basislijn of bl%piek h), Retoursnelheid ten opzichte van tPeak (ret v), Time to Peak 50% (TTP_50%) met t0 en Time to Baseline 50% (TTR_50%) met tPeak. Sla deze analyseopties op door Sjablonen te selecteren > Analysesjabloon opslaan met een id. Laad deze analysesjabloon voordat u elke tracering analyseert.
3. Als u wilt beginnen met gegevensanalyse, selecteert u Markeringen > Gate > Tijdelijke > converteren vanuit gebeurtenismarkering > analysebereik. Stel nu het tijdsbereik in van -0,01 s tot 1,20 s voor myocyten met een tempo van 0,2 Hz (figuur 2A, rode markeringen op het onderste deel van het onbewerkte spoor). Selecteer een korter tijdsbereik voor myocyten gestimuleerd op hogere frequenties.
4. Produceer een signaalgemiddelde tracering door Bewerkingen > gemiddelde gebeurtenissen te selecteren. Een signaalgemiddelde opname wordt weergegeven onder het oorspronkelijke basisspoor.
5. Selecteer Tab 1 van de signaalgemiddelde tracering (linkerkant van het scherm) en selecteer vervolgens Markeringen in het bovenste menu, gevolgd door Transiënt toevoegen. Selecteer Bewerkingen in het bovenste menu en Monotone transiënte analyse om de signaalgemiddelde waarden voor baseline sarcomeerlengte, piekhoogte, bl%peak h, dep v, ret v, TTP_50% en TTR_50% weer te geven in het signaalgemiddelde weergavepaneel.
6. Breng elke sarcomeertransiënte analyse over naar een spreadsheet voor de samengestelde analyse van meerdere myocyten door Export > Monotone Transiënte Analyse > Klembordstroom te selecteren. Plak deze gegevens in de spreadsheet voor elke tracering.
7. Als u de signaalgemiddelde tracering wilt kopiëren, selecteert u > huidige tracering > Klembord exporteren > Opties en stelt u de decimalen in op 5, selecteert u vervolgens Tabs Scheidingsteken en klikt u op OK en OK. Plak de signaalgemiddelde sporen voor elke myocytenopname in een tweede spreadsheet.

4. Opname ca²⁺ transiënten in volwassen hartmyocyten van ratten

1. Voordat u Ca²⁺ transiënten meet, schakelt u de platformcomponenten in die zijn beschreven in stap 2.2., samen met aanvullende fluorescentiebeeldvormingscomponenten (zie aanvullende componenten voor Ca²⁺ beeldvormingsanalyse in de tabel met materialen; Aanvullende figuur 2A-5,6; 2B-12).
2. Bereid Fura-2AM stamoplossing met 1 mM Fura-2AM plus 0,5 M probenecide in dimethylsulfoxide (DMSO). Probenecide minimaliseert Fura-2AM lekkage¹⁵.
3. Verdun de stamoplossing tot 5 μM Fura-2AM en 2,5 mM probenecide in 2,5 ml media (zie Materiaaltabel) in één putje van een 6-well plaat. Voeg alleen 2,5 ml media (geen Fura-2AM) toe aan drie extra putjes in de plaat, bedek de plaat met aluminiumfolie en verwarm de media voor op 37 °C.
4. Breng een CS met myocyten over van de pacingkamer naar de put met Fura-2AM, dek af en breng de plaat terug naar de incubator van 37 °C met 5% CO₂ gedurende 4 minuten. Monteer slangen in de perfusiepomp en perfuseer met media tijdens de Fura-2AM-laadperiode, zoals beschreven in stap 2.4.
5. Schakel kamerverlichting uit of minimaliseer deze om fluorescentiefotobleaching te verminderen en het fluorescentiesignaal te optimaliseren. Verwijder de 6-wellsplaat uit de incubator en was vervolgens de CS gedurende 10 s in elk van de drie putjes die alleen media bevatten. Breng de CS over op een kleine weegboot met voorgewarmde media (geen toegevoegde Fura-2AM).
6. Monteer de CS op een vers ingevette CS-kamer nadat u de onderkant van de CS voorzichtig hebt afgeveegd. Voeg voorzichtig een druppel media toe aan de CS en monteer vervolgens de elektrodebevestiging over de CS, gevolgd door een tweede CS en de bovenste houder. Gebruik #0 pan-head schroeven om de montage van de celkamer te voltooien, zoals beschreven in stap 2.6.-2.7.
7. Sluit de pompslang gevuld met media aan op de voorverwarmer, sluit de voorverwarmer aan op de CS-kamer en plaats deze in een podiumadapter, zoals beschreven in stap 2.8. Verzamel de media met het vacuümslangsysteem en schakel het verwarmingssysteem in (aanvullende figuur 2A, D-7) om de kamer in evenwicht te brengen tot 37 °C, zoals beschreven in stap 2.8.-2.9.
8. Activeer de pacingstimulator (aanvullende figuur 2B-13) ingesteld op 35-40 V en 0,2 Hz, zoals beschreven in stap 2.10.
9. Voordat u een Ca²⁺ transiënt opneemt, schakelt u een kleine zaklamp of booklight in die in de buurt van het toetsenbord van de computer is gemonteerd om het toetsenbord te helpen zien. Noteer bovendien de fluorescentieachtergrond in een gebied zonder cardiale myocyten. Selecteer om te beginnen Bestand > Start > Nieuw, zoals beschreven in stap 2.12.
10. Selecteer een ROI en stel één tabblad (of traceerbalk, linkerkant) in voor de onbewerkte teller en een tweede tabblad voor de onbewerkte noemer, gedefinieerd in het midden boven op elk tabblad. Neem de achtergrond op voor 10-20 s. Klik met de rechtermuisknop en sleep over één traceerbalkpaneel om de onbewerkte signaalgemiddelde teller- en noemerwaarden te verkrijgen. Voer deze waarden in door de bewerkingen > constanten te selecteren en voer de onbewerkte waarden in.
11. Bereid een nieuwe schermsjabloon voor om zowel verkorting als Ca²⁺ transiënten te verzamelen. Voor de lengte van sarcomeer selecteert u Tab 1 en gebruikt u hetzelfde proces als beschreven in stap 2.13. Voor Ca²⁺ -afbeeldingen selecteert u Tab 2 > Ratio (boven het midden van het tabblad) > Traces > Gebruikerslimieten bewerken om de minimum- en maximumniveaus voor de verhouding in te stellen, die doorgaans tussen 1 en 5 worden ingesteld. Gebruik hetzelfde proces om de teller- en noemerbereiken voor tabbladen 3 en 4 (linkerkant) te definiëren.
12. Plaats een ROI-vak boven een myocytenafbeelding, zoals beschreven in stap 2.14. Selecteer Bestand > Nieuwe > verzamelen. Selecteer nu Start om verkortings- en ratiometrische Ca²⁺ gegevens te verzamelen. Noteer ≥7 contracties/cel voor signaalgemiddelde analyse.
13. Herhaal de achtergrondspooropname die wordt beschreven in stap 4.10. na opname van 2-4 myocyten. Noteer meestal 4-5 myocyten / CS of minder myocyten als er significante veranderingen zijn in de achtergrondmeting.

5. Data-analyse van Ca²⁺ transiënten in geïsoleerde myocyten.

1. Open het gewenste bestand voor analyse en selecteer Sjablonen > Schermsjabloon voor verkorting plus Ca²⁺ transiënten. Selecteer vervolgens de tabbladen 1 en 2 (links) om respectievelijk de sarcomeerlengte en ca²⁺ -verhouding weer te geven. Selecteer Bewerkingen > constanten en voer de waarden van de teller en noemer in de ca²⁺ achtergrondtracering in.
2. Bereid analysesjablonen voor voor verkorting plus Ca²⁺ transiënte gegevens. Selecteer tabblad 1 (linkerkant) en gebruik hetzelfde proces als beschreven in stap 3.2. om de sarcomeerlengteanalysesjabloon in te stellen.
3. Selecteer tabblad 2 (linkerkant) en selecteer Bewerkingen, Monotone transiënte analyseopties, TTL-gebeurtenismarkering in het vak Definitie van t0 en de volgende opties in het menu: Basislijn (basale verhouding), Vertreksnelheid ten opzichte van t0 (dep v), Piek (piekhoogte en %piekhoogte/basislijn of bl%piek h), Vervalsnelheid ten opzichte van tPeak (ret v), Time to Peak 50% (TTP_50%) met t0 en Time to Baseline 50% (TTR_50%) met tPeak. Sla deze analyseopties op door Sjablonen en Analysesjabloon opslaan te selecteren met een nieuwe id-naam. Laad deze analysesjabloon voordat u elke tracering analyseert.
4. Gebruik hetzelfde proces als beschreven in stap 3.3.-3.6. om het signaal te gemiddelden en vervolgens de sarcomeerlengte te analyseren, gevolgd door dezelfde stappen voor Ca²⁺ transiënten. Stel afzonderlijke markeringen in voor de lengte van de sarcomeer en voor het ca²⁺ transiënte ratiospoor.

Results

Contractiele functiestudies worden uitgevoerd op myocyten van ratten vanaf de dag na isolatie (dag 2) tot 4 dagen na isolatie. Hoewel myocyten de dag na isolatie (d.w.z. dag 2) kunnen worden geregistreerd, zijn vaak langere kweektijden nodig na genoverdracht of behandelingen om de contractiele functie te wijzigen⁸. Voor myocyten die langer dan 18 uur na isolatie zijn gekweekt, helpt het in sectie 1 beschreven pacingprotocol t-tubuli en consistente verkortings- en verlengingsresultaten te behouden....

Discussion

Het chronische pacingprotocol dat in stap 1 wordt beschreven, verlengt de nuttige tijd voor het bestuderen van geïsoleerde myocyten en het beoordelen van de impact van langere behandelingen. In ons laboratorium werden consistente resultaten verkregen tot 4 dagen na isolatie bij het meten van de contractiele functie met behulp van sarcomeerlengte op chronisch getemporiseerde myocyten. De contractiele functie van myocyten verslechtert echter snel bij gebruik van media ouder dan 1 week om myocyten te versnellen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
MEDIA
Bovine serum albumin	Sigma (Roche)	3117057001	Finale concentratie = 0,2% (w/v)
Glutathione	Sigma	G-6529	Finale concentratie = 10 mM
HEPES	Sigma	H-7006	Finale concentratie = 15 mM
M199	Sigma	M-2520	1 fles maakt 1 L; pH 7,45
NaHCO3	Sigma	S-8875	Finale concentratie = 4 mM
Penicillin/streptomycin	Fisher	15140122	Finale concentratie = 100 U/mL penicilline, 100 μg/mL streptomycine
REAGENTS SPECIFIEK VOOR Ca2+ IMAGING
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma	D2650
Fura-2AM	Invitrogen (Molecular Probes)	F1221	50 μg/vial;  Bereid een stamoplossing van 1 mM Fura-2AM + 0,5 M probenicid in DMSO;  De finale Fura2-AM concentratie in media is  5 μM
Probenicid	Invitrogen (Fisher)	P36400	Voeg 7,2 mg probenicid (0,5 M) toe aan 1 mM Fura-2AM stam; Finale concentratie in media is 2,5 mM
MATERIALEN VOOR RAT MYOCYTE PACING
#1 22  mm2 glass coverslips	Corning	2845-22
3 x 36 inch kabels met banana jacks	Pomona Electronics	B-36-2	Aanvullend Figuur 1, paneel C
37oC Incubator  met 95% O2:5% CO2	Forma	3110	Aanvullend Figuur 1, paneel E.  Meerdere modellen zijn geschikt
Klasse II A/B3 Bioveiligheidskast met UV-lamp	Forma	1286	Meerdere modellen zijn geschikt
Forceps - Dumont #5 5/45	Fine Science Tools	11251-35
Hot bead sterilisator	Fine Science Tools	1800-45
Inverteerd microscoop met lage vergroting	Leica	DM-IL	Plaats deze microscoop naast de incubator om gepacede myocyten te controleren op contractie aan het begin van pacing en na media verversingen;  4X en 10X objectieven worden aanbevolen
Pacing kamer	Custom		Aanvullend Figuur 1, paneel A. Het Ionoptix C-pace systeem is een commercieel verkrijgbare optie of zie 22
Stimulator	Ionoptix	Myopacer	Aanvullend Figuur 1, paneel D.
MATERIALEN VOOR CONTRACTIELE FUNCTIE en/of Ca2+ IMAGING ANALYSE			ID in Aanvullend Figuur 2 & Alternatieven/Aanbevolen Opties
Aanvullende componenten voor Ca2+ imaging analyse	Ionoptix	Essentiële systeem componenten: -- Foton telsysteem            --  Xenon voeding met dubbele excitatie lichtbron            --  Fluorescerende interface	- Het foton telsysteem bevat een fotomultiplier (PMT) buis en dichroische spiegel en is geïnstalleerd naast de CCD camera  (paneel A #4).                                                                                                                                                                                                               - De voeding voor de xenon bulb lichtbron (zie paneel A #5 en paneel C, links) is geïntegreerd met een dubbele excitatie interface (340/380 nm  excitatie en 510 nm emissie) getoond in paneel A #6.                        &