Methodenartikel

Voorbereiding van nucleosoomkerndeeltjes gecomplexeerd met DNA-reparatiefactoren voor cryo-elektronenmicroscopie structurele bepaling

2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/64061

⸱

17 augustus 2022

 ,  ,  ,  , 
1Genome Integrity and Structural Biology Laboratory, National Institute of Environmental Health Sciences, National Institutes of Health

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol schetst in detail de voorbereiding van nucleosomale complexen met behulp van twee methoden voor monstervoorbereiding voor het bevriezen van TEM-roosters.

Samenvatting

DNA-reparatie in de context van chromatine is slecht begrepen. Biochemische studies met nucleosoomkerndeeltjes, de fundamentele herhalende eenheid van chromatine, tonen aan dat de meeste DNA-reparatie-enzymen DNA-schade verwijderen met verminderde snelheden in vergelijking met vrij DNA. De moleculaire details over hoe base excision repair (BER) enzymen DNA-schade in nucleosomen herkennen en verwijderen, zijn niet opgehelderd. Biochemische BER-gegevens van nucleosomale substraten suggereren echter dat het nucleosoom verschillende structurele barrières vertoont, afhankelijk van de locatie van de DNA-laesie en het enzym. Dit geeft aan dat de mechanismen die door deze enzymen worden gebruikt om DNA-schade in vrij DNA te verwijderen, anders kunnen zijn dan die welke in nucleosomen worden gebruikt. Aangezien het grootste deel van het genomische DNA is geassembleerd tot nucleosomen, is structurele informatie van deze complexen nodig. Tot op heden ontbreekt het de wetenschappelijke gemeenschap aan gedetailleerde protocollen om technisch haalbare structurele studies van deze complexen uit te voeren. Hier bieden we twee methoden om een complex van twee genetisch gefuseerde BER-enzymen (Polymerase β en AP Endonuclease1) te bereiden die gebonden zijn aan een single-nucleotide-gap nabij de entry-exit van het nucleosoom voor cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) structurele bepaling. Beide methoden voor monstervoorbereiding zijn compatibel voor het vitrificeren van kwaliteitsroosters via ondervriezen. Dit protocol kan worden gebruikt als uitgangspunt om andere nucleosomale complexen te bereiden met verschillende BER-factoren, pioniertranscriptiefactoren en chromatine-modificerende enzymen.

Inleiding

Eukaryote DNA wordt georganiseerd en verdicht door histoneiwitten, die chromatine vormen. Het nucleosoomkerndeeltje (NCP) vormt de fundamentele herhalende eenheid van chromatine die de toegankelijkheid tot DNA-bindende eiwitten reguleert voor DNA-reparatie, transcriptie en replicatie1. Hoewel de eerste röntgenkristalstructuur van het NCP meer dan twee decennia geleden voor het eerst werd opgelost2 en er sinds 3,4,5,6 nog veel meer structuren van het NCP zijn gepubliceerd, zijn DNA-reparatiemechanismen in nucleosomale substraten nog niet afgebakend. Het blootleggen van de moleculaire details die ten grondslag liggen aan DNA-reparatie in chromatine vereist structurele karakterisering van de deelnemende componenten om te begrijpen hoe lokale structurele kenmerken van het NCP DNA-reparatieactiviteiten reguleren. Dit is met name belangrijk in de context van base-excisieherstel (BER), aangezien biochemische studies met BER-enzymen unieke DNA-reparatiemechanismen in nucleosomen suggereren die afhankelijk zijn van enzymspecifieke structurele vereisten voor katalyse en de structurele positie van de DNA-laesie binnen het nucleosoom 7,8,9,10,11,12,13 . Aangezien BER een essentieel DNA-reparatieproces is, is er veel belangstelling om deze lacunes op te vullen en tegelijkertijd een startpunt vast te stellen van waaruit andere technisch haalbare structurele studies met relevante nucleosomale complexen kunnen worden uitgevoerd.

Cryo-EM wordt snel de voorkeursmethode voor het oplossen van de driedimensionale (3D) structuur van complexen waarvan de grootschalige voorbereiding van homogene monsters een uitdaging is. Hoewel het ontwerp en de zuivering van NCP's gecomplexeerd met een DNA-reparatiefactor (NCP-DRF) waarschijnlijk op maat gemaakte optimalisatie vereist, biedt de hier gepresenteerde procedure om een stabiel NCP-DRF-complex te genereren en te bevriezen details over hoe het monster en de cryo-EM-netwerkvoorbereiding kunnen worden geoptimaliseerd. Twee workflows (die elkaar niet uitsluiten) in figuur 1 en de specifieke details in het protocol identificeren kritieke stappen en bieden strategieën voor het optimaliseren van deze stappen. Dit werk zal het chromatine- en DNA-reparatieveld voortstuwen in een richting waarin het aanvullen van biochemische met structurele studies technisch haalbaar wordt om de moleculaire mechanismen van nucleosomaal DNA-herstel beter te begrijpen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Assembleer nucleosoomkerndeeltjes via zout-gariëntdialyse

OPMERKING: De bereiding van nucleosoomkerndeeltjes met behulp van recombinante histoneiwitten voor structurele studies is uitgebreid in detail beschreven door anderen14,15,16. Volg de zuivering van recombinant X. laevis histonen en histon octameer assemblage beschreven door anderen14,15, en monteer het nucleosomale substraat zoals hieronder beschreven.

  1. Koop drie oligonucleotiden (vermeld in tabel 1) op de aangegeven schaal: UND-197mer, 161mer, 35mer.
    1. PAGE zuivert ultrameren (197mer en 161mer) zoals beschreven17.
      1. Anneale equimolaire hoeveelheden oligonucleotiden in 1x gloeibuffer (10 mM Tris-Cl, pH 8,0, 50 mM NaCl). Meng bijvoorbeeld 40 μL van 161-mer [166,7 μM]; 8 μL van 35-mer [292,4 μM]; 16,8 μL van 197-mer comp streng [408,2 μM]; 10 μL 10x gloeibuffer en 10,9 μL dH2O.
        OPMERKING: Het is van cruciaal belang om de gloeireactie met een temperatuurgradiënt te regelen. Zie tabel 2 voor de details over het temperatuurverloop.
  2. Voer kleinschalige reconstituties uit (schaal met een factor 1/57 van het onderstaande voorbeeld voor een eindvolume van 50 μL) om de verhouding tussen DNA en histonoctameer te bepalen (typische beginverhoudingen van DNA:octameer zijn als volgt: 1:0,9, 1:1.1, 1:1.2, 1:2; weergegeven in figuur 2A); Het is van cruciaal belang om deze verhouding empirisch te bepalen met kleinschalige reconstituties.
    1. Nadat deze verhouding is bepaald, bereidt u een grootschalige reconstitutie voor. Meng bijvoorbeeld 32,9 μL DNA-197 bp [99,4 μM]; 1647,1 μL TE (1x); 1120 μL van 5 M NaCl en 62,3 μL WT histon octameer [2,56 μM].
  3. Dialysebuffers maken: RBlaag en RBhoog zoals beschreven in respectievelijk tabel 3 en tabel 4; Stel de reconstituties in zoals eerder beschreven14.
    1. Breng de dialysebuis over in het bekerglas met RBhoog en laat de dialyse onder zacht roeren gedurende 16 uur doorgaan of totdat 2 L RBlaag in het afvalbeker is overgebracht.
  4. Breng de dialysebuis over in een bekerglas van 1 L met RB50mM-buffer (tabel 5) en laat het monster gedurende ten minste 3 uur of een nacht dialyseren.
    1. Evalueer de reconstitutie-efficiëntie op een 6% polyacrylamide niet-denaturerende gel, waarbij ervoor wordt gezorgd dat er minder dan 10% vrij DNA en een enkele NCP-band is; bewaar NCP's bij 4 °C. Zie figuur 2A (baan 5) en figuur 2B voor representatieve optimale reconstitutieresultaten.

2. Bereid NCP-DNA reparatiefactor complex (NCP-DRF) voor

  1. Zuivering door preparatieve gel-elektroforese
    OPMERKING: Deze methode is de meest arbeidsintensieve (van de twee beschreven), en hoewel het effectief is in het verwijderen van soorten met een hoog moleculair gewicht (HMW) (Figuur 6A) vanwege de hoge verdunningsfactor kan dit leiden tot enige demontage zoals weergegeven in Figuur 7A (NCP prep cell out lane), waarbij DNA vrijkomt. Tot 25% vrij DNA is echter nog steeds compatibel met cryo-EM-studies. Vanwege de hoge verdunning, gebruik deze methode om alleen het NCP te zuiveren, in plaats van het hele complex.
    1. Bereid 70 ml 6% niet-denaturerende polyacrylamide-geloplossing in 0,2x TBE, met polyacrylamide-geloplossing 37,5:1, acrylamide:bisacrylamide. Giet een cilindrische gel met een buitenradius van 28 mm en polymeriseer 's nachts.
    2. Monteer het preparatieve gelloopapparaat met behulp van een dialysemembraan met een 6-8 kDa MW-afsnijding. Gebruik 0,25x TBE als loopbuffer en 1x elutiebuffer (50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH 7,5). Laat de cilindrische gel gedurende 1 uur op een constante 12 W lopen en verzamel fracties die de peristaltische pomp laten draaien met een stroomsnelheid van ongeveer 1 ml / min.
      OPMERKING: Als er geen UV-detector beschikbaar is om fracties met DNA te identificeren, kan een screeningsexperiment met 32P-NCP worden uitgevoerd om de fracties van belang te identificeren. Door alle omstandigheden hetzelfde te houden, kunnen ongelabelde NCP's vervolgens worden gezuiverd zonder een UV-detector.
    3. Concentreer de 2,8 ml NCP tot 250 μL met behulp van een centrifugaalfilter (MW-afsnijding 30 kDa) en laad gedurende in totaal 6 uur op de preparatieve gel en elektroforese. Na 2 uur, wanneer de xyleencyanol de gel op heeft, begint u met het verzamelen van fracties van 1,5 ml.
      OPMERKING: Na 2,5 uur zijn fracties vrij van xyleencyanol; het DNA (197mer) elueert op ongeveer 3-3,5 h, en het NCP zal naar verwachting elueren bij 4,5-5 h mark.
    4. Analyseer fracties van belang op een 6% niet-denaturerende polyacrylamidegel. Poolfracties die de NCP bevatten en concentreer onmiddellijk met een centrifugaalfilter (MW-afsnijding 30 kDa) tot 1 mg / ml. Evalueer de volgende dag de kwaliteit van de NCP op een 6% polyacrylamide niet-denaturerende gel voordat u complexeert met de DNA-reparatiefactor (DRF) van belang.
    5. Incubeer het NCP en de DRF van belang op ijs gedurende 15 minuten met behulp van een optimale buffer voor het specifieke complex. Meng bijvoorbeeld 1.000 μL NCP [1,2 μM]; 260 μL 5x bindingsbuffer (250 mM HEPES, pH 8, 500 mM KCl, 25 mM MgCl2), 22 μL 3 M KCl en 18 μL MBP-Pol β-APE1 [338 μM].
      OPMERKING: De temperatuur en ionische sterkte waarbij het complex is gemaakt, moeten mogelijk worden geoptimaliseerd voor verschillende complexen.
    6. Voeg glutaaraldehyde (vers geopend; EM-graad) tot een eindconcentratie van 0,005%. Voeg daarom aan deze reactie 26,8 μL 0,25% glutaaraldehyde toe met 13,2 μL dH2O. Meng goed en incubeer gedurende 13 minuten bij kamertemperatuur.
    7. Blus met 1 M Tris-Cl, pH 7,5, tot een eindconcentratie van 20 mM Tris-Cl, pH 7,5. Concentraat tot ~50 μL en vervang de buffer met 1x vriesbuffer: 50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH 7,5 met behulp van een ontzoutingskolom.
      LET OP: Glutaaraldehyde kan ernstige brandwonden en oogbeschadiging veroorzaken; Het is schadelijk als het wordt ingeslikt en het is giftig als het wordt ingeademd. Draag een laboratoriumjas, bril, handschoenen en hanteer glutaaraldehyde in een zuurkast en draag een masker.
      OPMERKING: Het is van cruciaal belang om de crosslinkingreactie in een groot volume uit te voeren met de NCP bij deze lagere concentratie. Eerdere pogingen tot crosslinking, zelfs bij deze concentratie van glutaaraldehyde, maar bij een 10x hogere geconcentreerde NCP leidden tot aggregatie van het monster en over-crosslinking zoals aangegeven door SDS PAGE en grootte-uitsluitingschromatografie. Deze roosters hadden geen waarneembare deeltjes met alleen klonten (figuur 5D,E).
    8. Bepaal de absorpties bij OD 280 en OD 260 en concentreer indien nodig verder om 1,3-3 mg / ml te bereiken, op basis van OD 280 (typische verhouding van OD260 / OD 280 = 1,7-2 levert goede deeltjes op). Voor dit kleine volume van 50 μL is de beste methode om monsterverlies te verminderen het maken van een dialyseknop met een deksel van een buis van 1,7 ml bedekt met een dialysemembraan (6-8 kDa MW afsnijding), het snijden van de onderkant van de buis en het gebruik van de rand van de buis om het membraan bovenop het deksel af te dichten.
    9. Plaats de dialyseknop met het monster bovenop een polyethyleenglycolbed, met het membraan naar beneden gericht (controleer de voortgang elke 2 minuten). Deze methode heeft de voorkeur wanneer de benodigde concentratie kleiner is dan of gelijk is aan 2,5-voudig om te voorkomen dat het monster in de concentrator wordt verdund of verloren. Het is van cruciaal belang om na deze stap onmiddellijk cryo-EM-roosters van het complex voor te bereiden.
  2. Zuivering door grootte-uitsluitingschromatografie
    1. De dag voor het invriezen, was en balanceer een grootte uitsluitingskolom met 60 ml dH2O, gevolgd door 80 ml vriesbuffer (50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH 8) 's nachts met een snelheid van 0,4 ml / min. Gebruik NCP's direct na reconstitutie en bereid hetzelfde complex met 2,5x grotere hoeveelheden als volgt: meng 2.500 μL NCP [1,2 μM]; 650 μL 5x bindingsbuffer; 45 μL MBP-Pol β-APE1 [338 μM] en 55 μL 3M KCl.
    2. Incubeer het mengsel op ijs zonder crosslinker gedurende 15 min. Voeg vervolgens glutaaraldehyde toe tot een uiteindelijke concentratie van 0,005% zoals beschreven in de preparatieve gelmethode. Concentreer het complex in dit geval echter in een vooraf gebalanceerd (met vriesbuffer) centrifugaalfilter tot ongeveer 120 μL.
    3. Analyseer onmiddellijk de piekfracties en concentreer die fracties die de histonen en MBP-Pol β-APE1 bevatten, zoals eerder aangegeven. Zie figuur 5A,B,C voor succesvolle resultaten met behulp van de grootte-uitsluitingsmethode en figuur 7 met beide methoden.

3. Bevries nucleosomaal complex

  1. Nadat u de diepvries hebt ingeschakeld en de luchtbevochtiger hebt gevuld met 50 ml dH2O, stelt u de kamertemperatuur in op 22 °C en HR (vochtigheid) op 98%. Plaats de ethaanbeker en de beker met vloeibare stikstof (met een gelabelde rasterdoos) in hun respectievelijke ruimtehouders.
  2. Bedek de ethaanbeker met de ethaandekseldispenser en giet er voorzichtig vloeibare stikstof (LN2) overheen, terwijl u ook de LN 2-beker vult met LN2. Wanneer het LN2-niveau is gestabiliseerd en 100% en een temperatuur van -180 °C bereikt, opent u voorzichtig de ethaanklep en vult u de ethaanbeker totdat deze een bel vormt op het heldere deksel. Verwijder de ethaandispenser.
  3. Plaats twee filterpapieren op de opberginrichting en zet ze vast met een metalen ring. Ga naar de set-up en gebruik de volgende parameters voor blotting: 0 pre-blot, 3 s blot, 0 post-blot; selecteer A-plunge en klik op OK.
  4. Klik in het hoofdscherm op Load Forceps en laad ze met een raster met de koolstof- / applicatiezijde naar links gericht (voorbereid zoals voorheen). Kalibreer de tang en stel de Z-as in om een stevige vlek te garanderen. Klik op de Tweede Kamer en breng 3 μL van het complex aan (1,3-3 mg / ml; OD280). Klik op Blot/A-plunge. Dit zal het rooster draaien om van de voorkant te vegen en zal het bevriezen.
  5. Breng het raster over en bewaar het in de rasterdoos in de LN2-kamer . Wanneer alle vier de roosters zijn bevroren en in de roosterdoos zijn geplaatst, draait u het deksel naar de neutrale positie, waar alle roosters door het deksel worden bedekt, en draait u de schroef vast. Rasters kunnen worden opgeslagen in LN2 totdat de screening wordt gestart.

4. Schermrasters

  1. Voordat u de monsters in de microscoop laadt, plaatst u de verglaasde roosters op een ring en zet u ze vast met een C-clip. Voer dit knipproces onder LN2 uit in een ruimte met een vochtige omgeving, om ijsverontreiniging te voorkomen.
  2. Plaats bij het laden van de microscoop de roosters in een cassette met 12 sleuven. Breng de cassette in een nanocab-capsule en laad deze in de autoloader. Het robotmechanisme van de autoloader initieert het proces.
  3. Breng het rooster over van de cassette naar het microscoopstadium. Pas het podium aan op eucentrische hoogte door het podium 10° te wiebelen en tegelijkertijd de Z-hoogte te bewegen totdat er een minimale vlakke verschuiving in de beelden wordt waargenomen.
  4. Zodra de eucentrische hoogte is bereikt, begint u met beeldvorming. Verkrijg eerst de atlas door een 3 x 3 montageafbeelding van het raster te maken, waarin elke montage wordt genomen met een vergroting van 62x. Kies drie vierkanten van verschillende grootte; Neem de eucentrische hoogte en maak vervolgens een afbeelding met een vergroting van 210x.
  5. Zodra een vierkant is afgebeeld, kiest u elk een gat van de rand, het midden en daartussen binnen de vierkanten. Beeld elk gat af bij een vergroting van 2600x.
  6. Voordat deze hoge vergrotingsfoto wordt gemaakt, vindt de autofocus plaats op een offset van het beeldgebied. Neem het hoge vergrotingsbeeld vanuit het midden van het gat bij een vergroting van 36.000x en bij een belichtingstijd van 7,1 s, 60 frames, een grootte van 1,18 pixels en een onscherpte van 3 μm. Zie representatieve beelden van screening in figuur 5, figuur 6 en figuur 7.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Goed geassembleerde NCP's (figuur 2) werden gebruikt om een complex te maken met een recombinant fusie-eiwit van MBP-Polβ-APE1 (figuur 3). Om de verhouding van NCP tot MBP-Polβ-APE1 te bepalen om een stabiel complex te vormen, voerden we elektroforetische mobiliteitsverschuivingstests (EMSA) uit (figuur 4), die een afzonderlijk verschoven band van de NCP toonden met 5-voudige molaire overmaat van MBP-Polβ-APE1. Tijdens de optimalisa...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Een specifiek protocol voor het zuiveren van de DNA-reparatiefactor zal afhankelijk zijn van het enzym van belang. Er zijn echter enkele algemene aanbevelingen, waaronder het gebruik van recombinante methoden voor eiwitexpressie en -zuivering18; als het eiwit van belang te klein is (<50 kDa), was structuurbepaling door cryo-EM tot voor kort bijna onmogelijk door het gebruik van fusiesystemen19, nanobody-bindende steigers20 en het optimaliseren van be...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.

Dankbetuigingen

We bedanken Dr. Mario Borgnia van de cryo-EM-kern van het National Institute of Environmental Health Sciences en Dr. Joshua Strauss van de Universiteit van North Carolina in Chapel Hill voor hun mentorschap en training in de cryo-EM-netwerkvoorbereiding. We danken ook Dr. Juliana Mello Da Fonseca Rezende voor de technische assistentie in de beginfase van dit project. We waarderen de belangrijke bijdrage en steun van wijlen Dr. Samuel H. Wilson en zijn laboratoriumleden, in het bijzonder Dr. Rajendra Prasad en Dr. Joonas Jamsen voor de zuivering van het genetisch gefuseerde APE1-Polβ-complex. Onderzoek is ondersteund door het intramurale onderzoeksprogramma van de National Institutes of Health, National Institute of Environmental Health Sciences [subsidienummers Z01ES050158, Z01ES050159 en K99ES031662-01].

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1 M HEPES; pH 7.5Thermo Fisher Scientific15630080
1 M MgCl2Thermo Fisher ScientificAM9530G
10x TBEBio-rad1610733
25% glutaraldehydeFisher Scientific50-262-23
3 M KClThermo Fisher Scientific043398.K2
491 prep cellBio-rad1702926
Amicon Ultra 15 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa)Millipore SigmaZ717185
Amicon Ultra 4 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa)Millipore SigmaUFC8030
AutoGrid TweezersTed Pella47000-600
Automatic Plunge FreezerLeicaLeica EM GP
C-1000 touch thermocyclerBio-rad1851148
C-clips and ringsThermo Fisher6640--6640
Clipping stationSubAngostromSCT08
Dialysis Membrane (MW cutoff 6-8 kDa)Fisher Scientific15370752
Diamond TweezersTechni-Pro758TW0010
dsDNAIntegrated DNA technologiesN/A
FEI Titan KriosThermo FisherKRIOSG4TEM
FPLC purification systemAKTA Pure29018224
Fraction collector Model 2110Bio-rad7318122
Glow Discharge Cleaning SystemTed Pella91000S
Grid BoxesSubAngostromPB-E
Grid Storage Accessory PackSubAngostromGSAX
Liquid EthaneN/AN/A
Liquid NitrogenN/AN/A
Minipuls 3 peristaltic two-head pumpGilsonF155008
NanodropThermo Fisher ScientificND-2000
Novex 16%, Tricine, 1.0 mm, Mini Protein GelsThermo Fisher ScientificEC6695BOX
PipetmanGilsonFA10002M
Pipette tips (VWR) Low RetentionVWR76322-528
Polyacrylamide gel solution (37.5:1)Bio-rad1610158
polyethylene glycol (PEG)Millipore SigmaP4338-500G
Pur-A-lyzer Maxi 3500Millipore SigmaPURX35050
Purified recombinant DNA repair factorN/AN/A
R 1.2/1.3 Cu 300 mesh GridsQuantifoilN1-C14nCu30-01
Recombinant histone octamerN/AN/A
Spring clipping toolsSubAngostromCSA-01
Superdex 200 column 10/300Millipore SigmaGE28-9909-44
Transmission Electron MicroscopeThermo FisherTalos Arctica 200 kV
Tweezers Assembly for FEI Vitrobot Mark IV-ITed Pella47000-500
UltraPure GlycerolThermo Fisher Scientific15514011
VitrobotThermo FisherMark IV System
Whatman Filter paper (55 mM)Cytiva1005-055
Xylene cyanolThermo Fisher Scientific440700500
Zeba Micro Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 75 µLThermo Fisher Scientific89877

Referenties

  1. Ehrenhofer-Murray, A. E. Chromatin dynamics at DNA replication, transcription and repair. European Journal of Biochemistry. 271 (12), 2335-2349 (2004).
  2. Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
  3. Davey, C. A., Sargent, D. F., Luger, K., Maeder, A. W., Richmond, T. J. Solvent mediated interactions in the structure of the nucleosome core particle at 1.9 a resolution. Journal of Molecular Biology. 319 (5), 1097-1113 (2002).
  4. Suto, R. K., Clarkson, M. J., Tremethick, D. J., Luger, K. Crystal structure of a nucleosome core particle containing the variant histone H2A.Z. Nature Structural Biology. 7 (12), 1121-1124 (2000).
  5. Tachiwana, H., et al. Crystal structure of the human centromeric nucleosome containing CENP-A. Nature. 476 (7359), 232-235 (2011).
  6. McGinty, R. K., Tan, S. Nucleosome structure and function. Chemical Reviews. 115 (6), 2255-2273 (2015).
  7. Rodriguez, Y., Hinz, J. M., Laughery, M. F., Wyrick, J. J., Smerdon, M. J. Site-specific acetylation of histone H3 decreases polymerase beta activity on nucleosome core particles in vitro. The Journal of Biological Chemistry. 291 (21), 11434-11445 (2016).
  8. Rodriguez, Y., Hinz, J. M., Smerdon, M. J. Accessing DNA damage in chromatin: Preparing the chromatin landscape for base excision repair. DNA Repair (Amst). 32, 113-119 (2015).
  9. Rodriguez, Y., Horton, J. K., Wilson, S. H. Histone H3 lysine 56 acetylation enhances AP endonuclease 1-mediated repair of AP sites in nucleosome core particles. Biochemistry. 58 (35), 3646-3655 (2019).
  10. Rodriguez, Y., Howard, M. J., Cuneo, M. J., Prasad, R., Wilson, S. H. Unencumbered Pol beta lyase activity in nucleosome core particles. Nucleic Acids Research. 45 (15), 8901-8915 (2017).
  11. Rodriguez, Y., Smerdon, M. J. The structural location of DNA lesions in nucleosome core particles determines accessibility by base excision repair enzymes. The Journal of Biological Chemistry. 288 (19), 13863-13875 (2013).
  12. Olmon, E. D., Delaney, S. Differential ability of five DNA glycosylases to recognize and repair damage on nucleosomal DNA. ACS Chemical Biology. 12 (3), 692-701 (2017).
  13. Odell, I. D., Wallace, S. S., Pederson, D. S. Rules of engagement for base excision repair in chromatin. Journal of Cellular Physiology. 228 (2), 258-266 (2013).
  14. Dyer, P. N., et al. Reconstitution of nucleosome core particles from recombinant histones and DNA. Methods in Enzymology. 375, 23-44 (2004).
  15. Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. Preparation of nucleosome core particle from recombinant histones. Methods in Enzymology. 304, 3-19 (1999).
  16. McGinty, R. K., Makde, R. D., Tan, S. Preparation, crystallization, and structure determination of chromatin enzyme/nucleosome complexes. Methods in Enzymology. 573, 43-65 (2016).
  17. Lopez-Gomollon, S., Nicolas, F. E. Purification of DNA oligos by denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). Methods in Enzymology. 529, 65-83 (2013).
  18. Burgess, R. R. D., Murray, P. Guide to Protein Purification. 463, Academic Press. (2009).
  19. Coscia, F., et al. Fusion to a homo-oligomeric scaffold allows cryo-EM analysis of a small protein. Scientific Reports. 6, 30909(2016).
  20. Wu, X., Rapoport, T. A. Cryo-EM structure determination of small proteins by nanobody-binding scaffolds (Legobodies). Proceedings of the Nationall Academy of Sciences of the United States of America. 118 (41), 2115001118(2021).
  21. Herzik, M. A., Wu, M., Lander, G. C. High-resolution structure determination of sub-100 kDa complexes using conventional cryo-EM. Nature Communications. 10 (1), 1032(2019).
  22. Takizawa, Y., et al. Cryo-EM structure of the nucleosome containing the ALB1 enhancer DNA sequence. Open Biology. 8 (3), 170255(2018).
  23. Anderson, C. J., et al. Structural basis for recognition of ubiquitylated nucleosome by Dot1L methyltransferase. Cell Reports. 26 (7), 1681-1690 (2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Base excisie reparatiechromatinestructuurmonstervoorbereidinggrootte uitsluitingschromatografieelectrophoretische mobiliteitsverschuivingcrosslinking conditiesplunge vriezen

Gerelateerde artikelen