Methodenartikel

Inkoop en perfusie-decellularisatie van porcine gevasculariseerde flappen in een aangepaste perfusiebioreactor

DOI:

10.3791/64068

⸱

1 augustus 2022

 ,  ,  , 
1Latner Thoracic Surgery Research Laboratories, Toronto General Hospital Research Institute, University Health Network, 2Institute of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto, 3Division of Thoracic Surgery, Department of Surgery, University of Toronto, 4Division of Plastic and Reconstructive Surgery, Department of Surgery, University of Toronto

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het protocol beschrijft de chirurgische verkrijging en daaropvolgende decellularisatie van gevasculariseerde varkensflappen door de perfusie van natriumdodecylsulfaatwater door de flapvasculatuur in een aangepaste perfusiebioreactor.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Grote volumeke delen defecten leiden tot functionele tekorten en kunnen de kwaliteit van leven van de patiënt sterk beïnvloeden. Hoewel chirurgische reconstructie kan worden uitgevoerd met behulp van autologe vrije flaptransfer of gevasculariseerde composiet allotransplantatie (VCA), hebben dergelijke methoden ook nadelen. Problemen zoals morbiditeit op de donorplaats en de beschikbaarheid van weefsel beperken autologe vrije flaptransfer, terwijl immunosuppressie een significante beperking van VCA is. Gemanipuleerde weefsels in reconstructieve chirurgie met behulp van decellularisatie / recellularisatiemethoden vertegenwoordigen een mogelijke oplossing. Gedecellulariseerde weefsels worden gegenereerd met behulp van methoden die native cellulair materiaal verwijderen met behoud van de onderliggende extracellulaire matrix (ECM) microarchitectuur. Deze acellulaire steigers kunnen vervolgens worden gerecellulariseerd met ontvangerspecifieke cellen.

Dit protocol beschrijft de inkoop- en decellularisatiemethoden die worden gebruikt om acellulaire steigers in een varkensmodel te bereiken. Daarnaast geeft het ook een beschrijving van het ontwerp en de opstelling van de perfusiebioreactor. De flappen omvatten het varkensomentum, de tensor fascia lata en de radiale onderarm. Decellularisatie wordt uitgevoerd via ex vivo perfusie van natriumdodecylsulfaat (SDS) wasmiddel met lage concentratie, gevolgd door DNase-enzymbehandeling en perazijnzuursterilisatie in een aangepaste perfusiebioreactor.

Succesvolle weefseldecellularisatie wordt gekenmerkt door een wit-ondoorzichtig uiterlijk van flappen macroscopisch. Acellulaire flappen tonen de afwezigheid van kernen op histologische kleuring en een significante vermindering van het DNA-gehalte. Dit protocol kan efficiënt worden gebruikt om gedecellulariseerde weke delen steigers te genereren met geconserveerde ECM en vasculaire microarchitectuur. Dergelijke steigers kunnen worden gebruikt in latere recellularisatiestudies en hebben het potentieel voor klinische vertaling in reconstructieve chirurgie.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Traumatisch letsel en tumorverwijdering kunnen leiden tot grote en complexe defecten van zacht weefsel. Deze defecten kunnen de kwaliteit van leven van de patiënt aantasten, functieverlies veroorzaken en leiden tot blijvende invaliditeit. Hoewel technieken zoals autologe weefselflapoverdracht vaak worden toegepast, zijn problemen met de beschikbaarheid van flappen en morbiditeit van de donorplaats belangrijke beperkingen 1,2,3. Gevasculariseerde composiet allotransplantatie (VCA) is een veelbelovend alternatief dat samengestelde weefsels, bijvoorbeeld spieren, huid, vasculatuur, als een enkele eenheid overdraagt aan ontvangers. VCA vereist echter langdurige immunosuppressie, wat leidt tot geneesmiddeltoxiciteit, opportunistische infecties en maligniteiten 4,5,6.

Tissue-engineered acellulaire steigers zijn een mogelijke oplossing voor deze beperkingen7. Acellulaire weefselsteigers kunnen worden verkregen met behulp van decellularisatiemethoden, die cellulair materiaal uit inheemse weefsels verwijderen met behoud van de onderliggende extracellulaire matrix (ECM) microarchitectuur. In tegenstelling tot het gebruik van synthetische materialen in tissue engineering, biedt het gebruik van biologisch afgeleide steigers een biomimetisch ECM-substraat dat biocompatibiliteit en het potentieel voor klinische vertaling mogelijk maakt8. Na decellularisatie kan de daaropvolgende recellularisatie van scaffolds met ontvangerspecifieke cellen vervolgens functionele, gevasculariseerde weefsels genereren met weinig tot geen immunogeniciteit 9,10,11. Door een effectief protocol te ontwikkelen om acellulaire weefsels te verkrijgen met behulp van perfusie-decellularisatietechnieken, kan een breed scala aan weefseltypen worden gemanipuleerd. Op zijn beurt maakt het voortbouwen op deze techniek de toepassing op complexere weefsels mogelijk. Tot op heden is perfusie-decellularisatie van gevasculariseerde zachte weefsels onderzocht met behulp van eenvoudige gevasculariseerde weefsels zoals een fasciocutane flap van volledige dikte bij knaagdier12, varkens13 en menselijke modellen14, evenals varkens rectus abdominis skeletspieren15. Bovendien zijn complexe gevasculariseerde weefsels ook perfusie gedecellulariseerd, zoals aangetoond in varkens- enmensenoormodellen 16,17 en menselijke full-face transplantaatmodellen18.

Hier beschrijft het protocol de decellularisatie van gevasculariseerde vrije flappen met behulp van biologisch afgeleide ECM-steigers. We presenteren de decellularisatie van drie klinisch relevante flappen: 1) het omentum, 2) de tensor fascia lata en 3) de radiale onderarm, die allemaal representatief zijn voor werkpaardflappen die routinematig worden gebruikt in reconstructieve chirurgie en niet eerder zijn onderzocht in dierstudies in de context van weefseldecellularisatie. Deze bio-technische flappen bieden een veelzijdig en direct beschikbaar platform dat het potentieel heeft voor klinische toepassingen voor gebruik op het gebied van reparatie en reconstructie van grote weke delendefecten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle procedures met betrekking tot dierenonderwerpen zijn goedgekeurd door het University Health Network Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) en worden uitgevoerd in overeenstemming met het protocol en de procedures van het University Health Network Animal Resource Centre en de richtlijnen van de Canadian Council on Animal Care. Vijf Yorkshire-varkens (35-50 kg; leeftijd ongeveer 12 weken oud) werden gebruikt voor alle experimenten.

1. Fabricage van perfusiebioreactoren

  1. Zie figuur 1 voor alle componenten die in de perfusiebioreactor worden gebruikt. Gebruik voor de fabricage van de weefselkamer in de handel verkrijgbare polypropyleen snap-lock containers met waterdichte en luchtdichte deksels met een siliconen afdichtingsvoering. Zorg ervoor dat de containers compatibel zijn met de autoclaaf.
  2. Boor twee 1/4 in gaten langs de zijkanten van de container en rijg een kort segment van L / S-16 platina-gecoate siliconenbuizen. Eén buis draagt het instroomperfusaat en de andere is voor de uitstroom.
  3. Bevestig voor de instroombuis een mannelijke Luer-connector aan het interne gedeelte dat zal worden gebruikt om verbinding te maken met de weefselcanule. Bevestig een vrouwelijke Luer-connector aan het externe uiteinde van de instroombuis die zal worden gebruikt om verbinding te maken met een driewegstopkraan.
  4. Boor een enkel gat van 1/4 op het deksel van de kamer en rijg een ander kort segment van L / S-16 platina-gecoate siliconenbuizen. Deze buis zal dienen als de luchtrooster.
  5. Maak de in- en uitstroombuizen door ongeveer 50 cm L/S-16 platina-gecoate siliconenbuizen te meten. Sluit het ene uiteinde aan op een gele driestops pompbuis en het andere uiteinde op een steriele serologische pipet van 2 ml om perfusaat van de reinigingsmiddelreservoirs naar de bioreactorkamer te brengen.
  6. Autoclaaf alle componenten (kamer en buis) in individueel verpakte steriele verpakkingen.

figure-protocol-1
Figuur 1: Fabricage van de perfusiebioreactor. De perfusiebioreactor bestaat uit (A) een kunststof polypropyleen weefselkamer (B) met zijgaten geboord om perfusiebuizen met lucht- en waterdicht deksel te huisvesten. (C) Stopkranen worden aan buizen bevestigd om de perfusiebuis mogelijk te maken die decellularisatiemiddelen uit het detergentreservoir naar afval brengt op een single-pass manier. (D) Compatibele pompcassettes worden gebruikt om de driestopslang aan te sluiten op de peristaltische pomp. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Bereiding van decellularisatieoplossingen

  1. Bereid gehepariniseerde normale zoutoplossing (15 IE/ml) door 1,5 ml 1000 I.U./ml heparinebouillonoplossing te verdunnen in 100 ml normale zoutoplossing.
  2. Bereid 0,05% w/v natriumdodecylsulfaat (SDS)-oplossing door langzaam 9 g SDS-poeder toe te voegen aan 18 l geautoclaveerd gedestilleerd gedeïoniseerd water. Gebruik een groot volume polypropyleen (PP) carboy om de SDS-oplossing te huisvesten. De oplossing is klaar voor gebruik wanneer deze volledig is opgelost. Bewaren bij kamertemperatuur.
  3. Bereid DNase I werkoplossing voor. Reconstitueer eerst gelyofiliseerde DNase I tot een voorraadconcentratie van 10 mg/ml met 5 mM CaCl2 in steriel dH2O. Bewaar de gereconstitueerde DNase I-oplossing als aliquots in een vriezer van −20 °C totdat deze klaar is voor gebruik. Verdun op de dag van gebruik DNase I stock 1:100 met Mg++(1,29 mM) en Ca++(1,98 mM) in steriele dH2O tot een eindconcentratie van 0,1 mg/ml.
    OPMERKING: DNase-activiteit zal afnemen, tenzij bevroren opgeslagen. Alleen vers werkende DNase-oplossing mag worden gebruikt voor de enzymatische vertering van DNA bij kamertemperatuur.
  4. Bereid 1x PBS-oplossing door 10x PBS-voorraad 1:10 te verdunnen met steriel geautoclaveerd water in een 5 L eindvolume in een PP-carboy. Bewaren bij kamertemperatuur.
  5. Bereid 1% antibiotica/antimycotica (A/A) in PBS. Verdun 100x antibiotica/antimycotica 1:100 met steriele 1x PBS oplossing tot een eindvolume van 1 L. Bewaren bij kamertemperatuur.
  6. Bereid 0,1% (v/v) perazijnzuur (PAA)/4% (v/v) ethanol (EtOH) door toevoeging van 3,13 ml PAA + 40 ml 100 % ethanol + 956 ml steriele dH2O. Breng het uiteindelijke volume op 1.000 ml en bewaar het bij kamertemperatuur.

3. Aankoop van varkensflappen

OPMERKING: Dit is een terminale procedure. Eén varken werd gebruikt om alle drie de flappen te kopen. Humane euthanaseer het dier na het verkrijgen van alle flappen.

  1. Preoperatieve zorg
    1. Snelle varkens ten minste 12 uur voorafgaand aan de operatie. Verdoof de dieren met ketamine (20 mg/kg intramusculair, IM), atropine (0,04 mg/kg IM) en midazolam (0,3 mg/kg IM).
    2. Anesthesie induceren door inhalatie van 5% isofluraan door een masker met een stroomsnelheid van 22-44 ml / kg / min voor perifere lijninbrenging en intubatie. Onderhoud anesthesie met 0,5% -2% isofluraan bij 22-44 ml / kg / min. Zorg voor een voldoende diepte van de anesthesie door de hemodynamische stabiliteit te controleren en noteer afwezige palpebrale / pedaalonttrekkingsreflexen of kaakspiertonus om een geschikt niveau van toegediende anestheticum aan te geven. Intraveneuze remifentanil (10-20 μg/kg/h) continue infusie toe tijdens de operatie voor analgesie.
    3. Intubeer het varken met een geschikte endotracheale buis (7-8 mm) en sluit de buis aan op een ventilatorset met een getijdenvolume van 8 ml / kg, PEEP van 5 cm H20, FiO2 van 0,5 en ademhalingsfrequentie van 14.
    4. Breng een angiokatheter van 22 G in de oorader. Zodra intraveneuze (IV) toegang is verkregen, injecteert u gedurende de hele procedure een warme 0,9% normale zoutoplossing bij 5-10 ml / kg / h om de gemiddelde arteriële druk tussen 60 mmHg en 90 mmHg te behouden.
    5. Controleer continu de hartslag, pulsoximetrie enco-2 van het eindgetijden. Beoordeel de bloeddruk en lichaamstemperatuur elke 5 min.
    6. Breng oogzalf aan om oculaire droogheid te voorkomen terwijl u onder narcose bent. Bereid het hele chirurgische veld voor met povidon-jodium. Drapeer het chirurgische veld met steriele handdoeken.
  2. Omental flap
    1. Plaats het varken in rugligging en voer een xypho-navelstreng laparotomie uit.
    2. Bij het betreden van de buik, mobiliseer de maagcephalad om het grotere omentum te visualiseren. Plaats het omentum voorzichtig in het operatieveld en identificeer de gastro-epiploïsche vaten die langs de grotere kromming van de maag lopen (figuur 2A).
    3. Begin bij het linker aspect van de grotere kromming waar de linker gastro-epiploïsche slagader zich aansluit bij de miltslagader. Gebruik een rechte Stevens-tenotomieschaar, skelet zowel de linker gastro-epiploïsche slagader als de ader. Ligate verdeel vervolgens beide afzonderlijk met behulp van chirurgische banden of clips.
    4. Ga verder langs de grotere kromming van de maag van links naar rechts. Lirk en verdeel de korte vaattakken die voortkomen uit het omentum dat de grotere kromming van de maag levert. Zorg ervoor dat u de belangrijkste gastro-epiploïsche pedikel van het omentum tijdens deze stap niet verwondt.
    5. Ga door met de mobilisatie van het grotere omentum totdat de kruising van de rechter gastro-epiploïsche vaten en de gastroduodenale slagader wordt aangetroffen. Verdeel met clips of banden vervolgens de juiste gastro-epiploïsche slagader en aderen afzonderlijk om de omentale flap te bevrijden.
    6. Eenmaal bevrijd, kan het omentum langs het midden in twee helften worden verdeeld, waarbij elke helft vergezeld gaat van een respectieve gastro-epiploïsche slagader en ader. Dit maakt de aanschaf van twee omentale vrije flappen van één dierbewerking mogelijk. Individueel cannuleer de gastro-epiploïsche vaten met een canule van 20-22 G en bevestig ze vervolgens met 3-0 zijden banden.
    7. Spoel gehepariniseerde zoutoplossing (15 I.U./ml) in de gastro-epiploïsche arteriële canule totdat een duidelijke veneuze uitstroom wordt waargenomen.
  3. Tensor fascia lata flap
    OPMERKING: Het protocol is gebaseerd op een eerdere beschrijving van de varkenstensor fascia lata flap door Haughey et al.19. Er wordt een wijziging aangebracht om alleen het fasciale gedeelte van de tensor fascia lata flap te isoleren.
    1. Plaats het varken in de laterale decubituspositie en scheer de hele bovenste achterklep bilateraal. Bereid en drapeer met behulp van de gebruikelijke steriele procedures.
    2. Markeer de voorste grens van de flap met een lijn die zich uitstrekt van de anterieure superieure iliacale wervelkolom (ASIS) naar de laterale patella. De locatie van de pedikel is ongeveer 6-8 cm van de ASIS langs deze lijn.
    3. Markeer een parallelle achterste lijn op ongeveer 8 cm tot 10 cm van de voorste incisie langs de as van het dijbeen om de breedte van de flap op te nemen. Markeer de distale rand van de flap bij de laterale patella.
    4. Begin de dissectie aan de distale rand bij de patella met een scherpe incisie van de huid met behulp van een scalpel. Verdiep de huidincisie met cautery door het onderhuidse weefsel totdat de fascia boven de rectus femoris wordt aangetroffen.
    5. Ga door met de huidincisies in de richting van de ASIS langs de gemarkeerde voorste en achterste grenzen zoals hierboven beschreven. Om alleen de fasciale flap te isoleren, verwijdert u de bovenliggende huidcomponent uit de onderliggende fasciale laag. Ligate of cauteriseer kleine perforatorvaten op de huid.
    6. Keer terug naar de distale rand van de flap en snijd de diepe fascia in om mobilisatie van de onderliggende vastus lateralis-spier mogelijk te maken. Mobiliseer de fascia naar de ASIS.
    7. Identificeer tijdens de mobilisatie de vasculaire pedikel die ontstaat tussen de spieren vastus lateralis en rectus femoris (figuur 2B). Zorg ervoor dat u overmatige tractie vermijdt om de pedikelvaten niet te verwonden.
    8. Dissecteer het proximale aspect van de ASIS terwijl u de vasculaire pedikel beschermt. Ontleed totdat de flap voldoende gemobiliseerd is over zijn steel.
    9. Volg de pedikel naar de diepe femorale vaten. Skeletiseer zowel de laterale circumflexe femorale slagader als de ader die de fasciale flap levert. Ligate verdeel vervolgens beide vaten proximaal waar ze zich bij de diepe femorale vaten voegen.
    10. Cannuleer de pedikelvaten individueel met 20 G tot 24 G angiokatheters, beveiligd met 3-0 zijden banden. Spoel gehepariniseerde zoutoplossing (15 I.U./ml) in de flap arteriële canule totdat een duidelijke veneuze uitstroom wordt waargenomen.
  4. Radiale onderarmklep
    OPMERKING: Het onderstaande protocol is gebaseerd op een gepubliceerde beschrijving van het radiale onderarmflapmodel van varkens door Khachatryan et al.20.
    1. Plaats het varken op de operatietafel in de laterale decubituspositie. Plaats de afhankelijke voorpoot binnen het operatieveld.
    2. Markeer een huidflap van ongeveer 3 cm x 3 cm op de radiale onderarm. Teken een lijn tussen het middelpunt van de proximale flapmarge en de antecubitale fossa om het geschatte verloop van de radiale slagader pedikel aan te geven. Bevestig het arteriële beloop met palpatie.
      OPMERKING: In het varkensmodel bevinden de radiale vaten zich relatief dieper dan bij mensen. Hun locatie is tussen de flexor carpi radialis en brachioradialis.
    3. Snijd de huid in met behulp van een scalpel op het distale aspect met een diepte tot aan de antebrachiale fascia. Stompe dissectie met tenotomieschaar totdat de distale radiale slagader en de twee venae comitantes worden aangetroffen. Ligaat de slagader en aderen met chirurgische banden afzonderlijk en verdeel.
    4. Ga door met de huidincisies op de radiale en ulnaire randen van het gemarkeerde huidplein. Mobiliseer de flap van het onderliggende radiale bot met een chirurgisch mes dat van een radiale naar ulnaire richting gaat, terwijl ook de huidflap proximaal naar de antecubitale fossa wordt verhoogd.
      OPMERKING: Onderhoud een subfasciaal dissectievlak om ervoor te zorgen dat de radiale slagader pedikel geassocieerd blijft met de bovenliggende huidlaag.
    5. Trek in de proximale marge de ruimte tussen de brachioradialis en flexor carpi radialis in met een zelfklevend retractor om de proximale radiale slagader en de venae-comitantes bloot te leggen (figuur 2C).
    6. Gebruik een tenotomieschaar, skelet de radiale slagader en venae comitantes proximaal bij de antecubitale fossa waar ze respectievelijk de brachiale slagader en aderen verbinden. Ontleed de vaten van de omliggende fibrofatty weefsels om een voldoende pedikellengte van ongeveer 5-6 cm te bereiken. Ligaat en verdeel de slagader en venae afzonderlijk om de radiale onderarmklep vrij te maken.
    7. Cannuleer de pedikelvaten met 20 G tot 24 G angiokatheters, beveiligd met 3-0 zijden banden. Spoel gehepariniseerde zoutoplossing (15 IE/ml) in de flap arteriële canule totdat een duidelijke veneuze uitstroom wordt waargenomen.
    8. Houd na het verkrijgen van de flappen de kleppen in koude zoutoplossing bij 4 °C totdat ze klaar zijn voor decellularisatie. Onder diepe isofluraan anesthesie, euthanaseer de dieren met een intraveneuze injectie van kaliumchloride (100 mg / kg IV). Bevestig de dood door de afwezigheid van vitale functies.

figure-protocol-2
Figuur 2: Verkrijging van drie gevasculariseerde flappen van varkens. (A) Omentum. De rechter (i) en linker (ii) gastro-epiploïsche slagaders zijn gecannuleerd in de omentale flap (iii). (B) Tensor fascia lata. De pedikel van de flap (iv) is de opgaande tak van de laterale femorale circumflexe slagader (v). (C) Radiale onderarmklep. De verkrijging van de radiale onderarmflap (vi) is gebaseerd op de radiale slagader en de vena comitantes (vii) als de vasculaire pedikel (OPMERKING: Gordijnen werden weggelaten voor demonstratiedoeleinden). Schaalbalken: 3 cm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. Opzetten van het decellularisatiesysteem

  1. Monteer de weefselkamer met flappen onder steriele omstandigheden in een laminaire flow bioveiligheidskast.
  2. Bevestig een driewegstopkraan aan zowel de instroom- als de uitstroompoorten van de bioreactor. Bevestig een filter van 0,2 μm aan de ventilatiepoort op het deksel van de tissuekamer. Prime de instroombuis met steriele gehepariniseerde zoutoplossing om luchtbellen te elimineren.
  3. Plaats de flappen in de kamer. Sluit met behulp van steriele hemostaten de flappen aan op de instroombuis met behulp van de mannelijke Luer-connector. Schroef de respectievelijke arteriële canule van elke flap op de mannelijke Luer en zorg voor een strakke afdichting.
  4. Spoel gehepariniseerde zoutoplossing door de stopkraan om te controleren of de Luer-verbinding zonder lekken is en of de kleppen kunnen worden doordrenkt met bewijs van veneuze uitstroom. Sluit het deksel van de tissuekamer.
  5. Verbind de instroombuis met een gele driestops pompslang met de instroomstop van de weefselkamer. Bevestig ook een inline druksensortransducer aan de instroom driewegstopkraan om perfusiedrukbewaking mogelijk te maken.
  6. Schakel de peristaltische instroompomp in. Ga op het beginscherm naar het derde tabblad met behulp van de pijltoets om de buis-ID in te stellen op 1,85 mm. Ga vervolgens naar het tweede tabblad om de perfusiesnelheid in te stellen. Invoersnelheid als leveringswijze en ingesteld op 2 ml/min. Zorg ervoor dat de stroomrichting correct is zoals weergegeven op het scherm. Laad de driestops pompslang naar de peristaltische pomp met een compatibele cassette.
  7. Herhaal de procedure voor de peristaltische pomp met uitstroom, vergelijkbaar met hierboven. Stel de instelling van de uitstroompomp in op 4 ml/min. Verbind de uitstroombuis met een gele driestops pompslang met de uitstroomstop van de weefselkamer. Laad de driestops pompslang naar de peristaltische pomp met een compatibele cassette. Start de stroom voor beide pompen door op de aan /uit-knop te drukken.
    OPMERKING: De hogere snelheid van de uitstroompomp is een cruciale veiligheidsmaatregel om overloop van de weefselkamer te voorkomen, zodat de uitstroom van de kamer altijd groter is dan de instroom tijdens de decellularisatie. De volledige geassembleerde decellularisatie-opstelling is weergegeven in figuur 3.

figure-protocol-3
Figuur 3: Geassembleerd perfusie-decellularisatiesysteem. (A) Schematische weergave van het perfusiedecellularisatiesysteem. De instroombuis voert perfusaat van het reinigingsmiddelreservoir in de weefselkamer op een single-pass manier met druksensorbewaking. De uitstroombuis verwijdert perfusaat actief uit de weefselkamer in de afvalcontainer. Zwarte pijlen geven de richting van de perfusiestroom aan. Een peristaltische pomp wordt gebruikt met de linkerpomp om de instroom te regelen. De uitstroom wordt actief verwijderd met behulp van een tweede peristaltische pomp door de respectieve buizen. Figuur gemaakt met BioRender.com. (B) Foto van het perfusie-decellularisatiesysteem dat op de benchtop is geassembleerd met de instroomperistaltische pomp (i) aangesloten op de weefselkamers (ii) en vervolgens de uitstroom peristaltische pomp (iii). De instroomperfusaatdruk wordt bewaakt met een in-line druksensor (iv) voordat de weefselkamer wordt betreden. Hier worden drie flappen parallel gedecellulariseerd. Zowel de wasmiddel- als de afvalreservoirs bevinden zich onder de bovenkant en zijn niet gefotografeerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

5. Decellularisatie van varkensflappen

  1. Voer alle volgende stappen uit voor perfusie-decellularisatie bij kamertemperatuur. Voor een overzicht van de perfusiepercentages en -duur, zie tabel 1. Begin met de perfusie van heparinized zoutoplossing bij 2 ml / min met behulp van een peristaltische pomp en perfuseer de flappen met heparinized zoutoplossing in de weefselkamer gedurende 15 minuten om eventuele achtergebleven bloedstolsels te verwijderen.
  2. Na voltooiing van heparinized zoutoplossing perfusie, aspirateer resterende zoutoplossing in de weefselkamer. Vul de weefselkamer met ongeveer 500 ml SDS-decellularisatieoplossing om de flap voldoende onder te dompelen.
  3. Breng de instroomslang over naar de SDS-decellularisatieoplossing en perfuseer het weefsel met 2 ml / min. De duur van de perfusie varieert afhankelijk van de flap; perfuseer SDS gedurende 2 dagen voor omentum, 3 dagen voor tensor fascia en 5 dagen voor radiale onderarm fascio-cutane flap.
  4. Na voltooiing van de SDS-decellularisatie, aspirateer het bestaande SDS-perfusaat in de weefselkamer. Breng de instroomslang over in 1x PBS-oplossing en laat de flappen gedurende 1 dag op 2 ml / min perfuseren.
  5. Verwijder de vorige PBS-oplossing en breng de instroombuis over in de DNase-werkoplossing. Perfuseer gedurende 2 uur bij 2 ml/min. Verwijder de DNase-oplossing uit de weefselkamer en plaats de instroomslang in 1x PBS-oplossing. Dompel de weefsels onder met 1x PBS-oplossing in de kamer en perfuseer 1x PBS-oplossing gedurende 1 dag op 2 ml / min.
  6. Steriliseer de flappen met PAA/EtOH oplossing. Breng de instroomslang over in PAA/EtOH in dH2O-oplossing en dompel de weefsels onder in dezelfde oplossing. Perfuseer PAA/EtOH op 2 ml/min gedurende 3 uur. Zodra de PAA/EtOH-sterilisatie is voltooid, koppelt u de slang los van de driewegstoppunten.
  7. Verwijder de flappen met behulp van een aseptische techniek en plaats de steriele instrumenten in PBS met 1% antibiotica/antimycotica (A/A). Dompel de flappen met PBS + 1% A/A gedurende 15 minuten onder in twee afzonderlijke wasbeurten om restzuur volledig te neutraliseren. Houd de flappen in PBS + 1% A/A op 4 °C totdat ze klaar zijn voor recellularisatie.
  8. Controleer de steriliteit van de steigers door een wattenstaafje op agarplaten uit te voeren en onderzoek op microbiële groei. Ent agarplaten in met wattenstaafjes van elk flapoppervlak. Kweek de agarplaten op 37 °C gedurende maximaal 2 weken. Steriliteit wordt aangetoond door de afwezigheid van microbiële koloniegroei.

Tabel 1: Samenvatting van de protocolparameters voor perfusie-decellularisatie. Klik hier om deze tabel te downloaden.

6. Evaluatie van decellularisatie

  1. Met behulp van een ponsbiopsie, verkrijg monsters van 3 mm tot 10 mm dik uit de flappen.
  2. Voor histologie, fixeer biopsieën in histologische cassettes in normaal gebufferd formaline gedurende 24 uur bij kamertemperatuur.
  3. Was de biopsiecassettes gedurende 15 minuten in water of PBS en plaats ze vervolgens in 70% ethanol totdat ze klaar zijn voor weefselverwerking. Verwerk de cassettes in een tissue processor volgens standaard protocollen.
  4. Integreer de biopten in paraffine, zodat de was gedurende 10-15 minuten op een koude plaat stolt. Sectieparaffineblokken op een microtoom tot een dikte van 5 μm. Beits de dia's met hematoxyline en eosine (H&E) volgens standaardprotocollen. Beeld de weefseldia's af met lichtmicroscopie.
  5. Voor de kwantificering van het DNA-gehalte moet het drooggewicht van de weefselbiopten worden verkregen na een nachtdroging van het weefsel in een oven bij 60 °C. Verwerk de monsters in een papaïne-extractiebuffer bij 65 °C 's nachts. Centrifugeer de verteerde monsters bij 10.000 x g en breng het supernatant over in een verse microcentrifugebuis. Test het DNA-gehalte met een commerciële DNA-extractiekit volgens de instructies van de fabrikant.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol voor het decellulariseren van gevasculariseerde varkensflappen is afhankelijk van de perfusie van een ionische wasmiddel, SDS, door de flap vasculatuur in een aangepaste perfusiebioreactor. Voorafgaand aan de decellularisatie werden drie gevasculariseerde flappen in een varkensmodel verkregen en gecannuleerd volgens hun belangrijkste aanvoervaten. De flappen werden onmiddellijk na aankoop gespoeld om een gepatenteerde, doorlaatbare vasculatuur te behouden om succesvolle decellularisatie mogelijk te maken. Me...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het voorgestelde protocol maakt gebruik van de perfusie van SDS met lage concentratie om een reeks van varkens afgeleide flappen te decellulariseren. Met deze procedure kunnen acellulair omentum, tensor fascia lata en radiale onderarmflappen met succes worden gedecellulariseerd met behulp van een protocol dat SDS met lage concentratie bevordert. Voorlopige optimalisatie-experimenten hebben vastgesteld dat SDS bij een lage concentratie (0,05%) tussen 2 dagen tot 5 dagen in staat is om cellulair materiaal voor het omentum,...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.2 µm pore Acrodisk FilterVWRCA28143-310
0.9 % Sodium Chloride Solution (Normal Saline)BaxterJF7123
20 L Polypropylene CarboyCole-ParmerRK-62507-20
3-0 Sofsilk Nonabsorbable Surgical TieCovidien LS639
3-way StopcockCole-ParmerUZ-30600-04
Adson ForcepsFine Science Tools11027-12
Antibiotic-Antimycotic Solution, 100XWisent450-115-EL
Atropine Sulphate 15 mg/30mlRafter 8 Products238481
BD Angiocath 20-GaugeVWRBD381134
BD Angiocath 22-GaugeVWRBD381123
BD Angiocath 24-GaugeVWRBD381112
Calcium ChlorideSigma-AldrichC4901DNAse Co-factor
DNase I from bovine pancreasSigma-AldrichDN25
DNA assay (Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit)InvitrogenP7589
DPBS, 10XWisent311-415-CL without Ca++/Mg++
Halsted-Mosquito HemostatFine Science Tools13008-12
Heparin, 1000 I.U./mLLeo Pharma A/S453811
Ketamine Hydrochloride  5000 mg/50 mlBimeda-MTC Animal Health Inc.612316
Ismatec Pump Tygon 3-Stop TubingCole-ParmerRK-96450-40Internal Diameter:  1.85 mm
Ismatec REGLO 4-Channel PumpCole-Parmer78001-78
Ismatec Tubing CassettesCole-ParmerRK-78016-98
Isoflurane 99.9%, 250 mlPharmaceutical Partners of Canada Inc.2231929
LB Agar LennoxBioshop CanadaLBL406.500Sterility testing agar plates
Magnesium SulfateSigma-AldrichM7506DNAse Co-factor
Masterflex L/S 16 TubingCole-ParmerRK-96410-16
Midazolam 50 mg/10 mlPharmaceutical Partners of Canada Inc.2242905
Monopolar Cautery PencilValleylabE2100
Normal Buffered Formalin, 10%Sigma-AldrichHT501128
N°11 scalpel bladeSwann Morton303
Papain from papaya latexSigma-AldrichP3125
Peracetic AcidSigma-Aldrich269336
Plastic Barbed Connector for 1/4" to 1/8" Tube IDMcMaster-Carr5117K61
Plastic Barbed Tube 90° Elbow ConnectorsMcMaster-Carr5117K76
Plastic Quick-Turn Tube PlugsMcMaster-Carr51525K143Male Luer
Plastic Quick-Turn Tube SocketsMcMaster-Carr51525K293Female Luer
Punch Biopsy ToolIntegra Miltex3332
Potassium Chloride 40 mEq/20 mlHospira Healthcare Corporation37869
Povidone-Iodine, 10%Rougier833133
Serological Pipet, 2mLFisher Science13-678-27D
Snap Lid Airtight ContainersSnapLock142-3941-4
Sodium Dodecyl Sulfate PowderSigma-AldrichL4509
Surgical Metal Ligation Clips, SmallTeleflex001200
Stevens Tenotomy Scissors, 115 mm, straightB. BraunBC004R
TruWave Pressure Monitoring SetEdwards LifesciencesPX260

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Richardson, D., Fisher, S. E., Vaughan, D. E., Brown, J. S. Radial Forearm Flap Donor-Site Complications and Morbidity: A Prospective Study. Plastic and Reconstructive Surgery. 99 (1), 109-115 (1997).
  2. Edsander-Nord, Å, Jurell, G., Wickman, M. Donor-site morbidity after pedicled or free TRAM flap surgery: A prospective and objective study. Plastic and Reconstructive Surgery. 102 (5), 1508-1516 (1998).
  3. Qian, Y., et al. A systematic review and meta-analysis of free-style flaps: Risk analysis of complications. Plastic and Reconstructive Surgery. Global Open. 6 (2), 1651(2018).
  4. Issa, F. Vascularized composite allograft-specific characteristics of immune responses. Transplant International. 29 (6), 672-681 (2016).
  5. Kueckelhaus, M., et al. Vascularized composite allotransplantation: Current standards and novel approaches to prevent acute rejection and chronic allograft deterioration. Transplant International. 29 (6), 655-662 (2016).
  6. Iske, J., et al. Composite tissue allotransplantation: Opportunities and challenges. Cellular and Molecular Immunology. 16 (4), 343-349 (2019).
  7. Londono, R., Gorantla, V. S., Badylak, S. F. Emerging implications for extracellular matrix-based technologies in vascularized composite allotransplantation. Stem Cells International. 2016, 1541823(2016).
  8. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
  9. Hussey, G. S., Dziki, J. L., Badylak, S. F. Extracellular matrix-based materials for regenerative medicine. Nature Reviews Materials. 3, 159-173 (2018).
  10. Colazo, J. M., et al. Applied bioengineering in tissue reconstruction, replacement, and regeneration. Tissue Engineering. Part B Reviews. 25 (4), 259-290 (2019).
  11. Rouwkema, J., Rivron, N. C., van Blitterswijk, C. A. Vascularization in tissue engineering. Trends in Biotechnology. 26 (8), 434-441 (2008).
  12. Zhang, Q., et al. Decellularized skin/adipose tissue flap matrix for engineering vascularized composite soft tissue flaps. Acta Biomaterialia. 35, 166-184 (2016).
  13. Jank, B. J., et al. Creation of a bioengineered skin flap scaffold with a perfusable vascular pedicle. Tissue Engineering - Part A. 23 (13-14), 696-707 (2017).
  14. Giatsidis, G., Guyette, J. P., Ott, H. C., Orgill, D. P. Development of a large-volume human-derived adipose acellular allogenic flap by perfusion decellularization. Wound Repair and Regeneration. 26 (2), 245-250 (2018).
  15. Zhang, J., et al. Perfusion-decellularized skeletal muscle as a three-dimensional scaffold with a vascular network template. Biomaterials. 89, 114-126 (2016).
  16. Duisit, J., et al. Decellularization of the porcine ear generates a biocompatible, nonimmunogenic extracellular matrix platform for face subunit bioengineering. Annals of Surgery. 267 (6), 1191-1201 (2018).
  17. Duisit, J., et al. Perfusion-decellularization of human ear grafts enables ECM-based scaffolds for auricular vascularized composite tissue engineering. Acta Biomaterialia. 73, 339-354 (2018).
  18. Duisit, J., et al. Bioengineering a human face graft: The matrix of identity. Annals of Surgery. 266 (5), 754-764 (2017).
  19. Haughey, B. H., Panje, W. R. A porcine model for multiple musculocutaneous flaps. The Laryngoscope. 99 (2), 204-212 (1989).
  20. Khachatryan, A., et al. Radial Forearm Flap. Microsurgery Manual for Medical Students and Residents: A Step-by-Step Approach. , Springer. Denmark. 177-181 (2021).
  21. Hammouda, B. Temperature effect on the nanostructure of SDS micelles in water. Journal of Research of the National Institute of Standards and Technology. 118, 151-167 (2013).
  22. Qu, J., Van Hogezand, R. M., Zhao, C., Kuo, B. J., Carlsen, B. T. Decellularization of a fasciocutaneous flap for use as a perfusable scaffold. Annals of Plastic Surgery. 75 (1), 112-116 (2015).
  23. Keane, T. J., Swinehart, I. T., Badylak, S. F. Methods of tissue decellularization used for preparation of biologic scaffolds and in vivo relevance. Methods. 84, 25-34 (2015).
  24. Mendibil, U., et al. Tissue-specific decellularization methods: Rationale and strategies to achieve regenerative compounds. International Journal of Molecular Sciences. 21 (15), 5447(2020).
  25. Lupon, E., et al. Engineering vascularized composite allografts using natural scaffolds: A systematic review. Tissue Engineering. Part B Reviews. 28 (3), 677-693 (2022).
  26. Duisit, J., Maistriaux, L., Bertheuil, N., Lellouch, A. G. Engineering vascularized composite tissues by perfusion decellularization/recellularization: Review. Current Transplantation Reports. 8, 44-56 (2021).
  27. Adil, A., Xu, M., Haykal, S. Recellularization of bioengineered scaffolds for vascular composite allotransplantation. Frontiers in Surgery. 9, 843677(2022).
  28. Phelps, E. A., García, A. J. Engineering more than a cell: Vascularization strategies in tissue engineering. Current Opinion in Biotechnology. 21 (5), 704-709 (2010).
  29. Pozzo, V., et al. A reliable porcine fascio-cutaneous flap model for vascularized composite allografts bioengineering studies. Journal of Visualized Experiments. (181), e63557(2022).
  30. Uygun, B. E., et al. Decellularization and recellularization of whole livers. Journal of Visualized Experiments. (48), e2394(2011).
  31. Uzarski, J. S., et al. Epithelial cell repopulation and preparation of rodent extracellular matrix scaffolds for renal tissue development. Journal of Visualized Experiments. (102), e53271(2015).
  32. Sullivan, D. C., et al. Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system. Biomaterials. 33 (31), 7756-7764 (2012).
  33. Choudhury, D., Yee, M., Sheng, Z. L. J., Amirul, A., Naing, M. W. Decellularization systems and devices: State-of-the-art. Acta Biomaterialia. 115, 51-59 (2020).
  34. Schilling, B. K., et al. Design and fabrication of an automatable, 3D printed perfusion device for tissue infusion and perfusion engineering. Tissue Engineering. Part A. 26 (5-6), 253-264 (2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Tissue EngineeringDecellularized ScaffoldsExtracellular MatrixSoft Tissue ReconstructionOmental FlapSodium Dodecyl SulfateRecellularization Methods

Gerelateerde artikelen