Method Article

In het veld inzetbare Candidatus Liberibacter asiaticus detectie met behulp van recombinase polymerase amplificatie in combinatie met CRISPR-Cas12a

DOI:

10.3791/64070

⸱

December 23rd, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1China-USA Citrus Huanglongbing Joint Laboratory, National Navel Orange Engineering Research Center, Gannan Normal University, 2Department of Biological Sciences, Gannan Normal University, 3Citrus Research and Education Center, Department of Microbiology and Cell Science, University of Florida - Institute of Food and Agricultural Sciences

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit werk werd een snelle, gevoelige en draagbare detectiemethode voor Candidatus Liberibacter asiaticus ontwikkeld op basis van recombinasepolymeraseversterking in combinatie met CRISPR-Cas12a.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De vroege detectie van Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) door citrustelers vergemakkelijkt vroegtijdige interventie en voorkomt de verspreiding van ziekten. Een eenvoudige methode voor snelle en draagbare Huanglongbing (HLB) diagnose wordt hier gepresenteerd die recombinase polymerase amplificatie en een fluorescerende reporter combineert met behulp van de nuclease-activiteit van het geclusterde regelmatig tussen elkaar geplaatste korte palindromische repeats / CRISPR-geassocieerde 12a (CRISPR-Cas12a) systeem. De gevoeligheid van deze techniek is veel hoger dan PCR. Bovendien vertoonde deze methode vergelijkbare resultaten als qPCR wanneer bladmonsters werden gebruikt. In vergelijking met conventionele CLas-detectiemethoden kan de hier gepresenteerde detectiemethode in 90 minuten worden voltooid en werkt deze in een isothermische toestand waarvoor geen PCR-machines nodig zijn. Bovendien kunnen de resultaten worden gevisualiseerd via een handheld fluorescerend detectieapparaat in het veld.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Huanglongbing (HLB) is een van de meest problematische citrusziekten wereldwijd1. HLB wordt veroorzaakt door de floëem-koloniserende en kieskeurige bacterie Candidatus Liberibacter spp., waaronder Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), Ca. L. africanus en Ca. L. americanus2. De meest voorkomende HLB-geassocieerde soort in China en de VS is CLas, die wordt overgedragen door Aziatische citrus psylliden (Diaphorina citri) of door enten3. Na besmetting met CLas vertonen citrusbomen groeidaling tot de dood2. De meest voorkomende sy....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bouw van de CLas-DETECTR

OPMERKING: De constructie van CLas-DETECTR is een proces in vier stappen: oplossingsvoorbereiding, citrus totale DNA-isolatie, isothermische DNA-amplificatie en resultaatvisualisatie. Het schema van de CLas-DETECTR-test is geïllustreerd in figuur 1A.

  1. Oplossingsvoorbereiding
    1. Bereid buffer A voor: 20 mM NaOH in 6% PEG 200. Voeg voor 100 ml 113 mg NaOH en 6 g PEG 200 toe aan 80 ml H2O in een fles. Incubeer de fles in een waterbad bij 60 °C totdat alle PEG 200 is opgelost. Voeg vervolgens H2O toe aan een volume van 100 ml.
    2. Bereid oplossin....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier hebben we een draagbaar platform beschreven, CLas-DETECTR, dat de RPA- en CRISPR-Cas12a-systemen kamt om HLB in het veld te diagnosticeren. Het schema van CLas-DETECTR is geïllustreerd in figuur 1A.

Wanneer bladmonsters van de HLB-geïnfecteerde en HLB-niet-geïnfecteerde Newhall-bomen (figuur 1B), waarvoor de aanwezigheid van CLas werd bevestigd door PCR (figuur 1C), werden onderworpen aan de CLas-DET.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie presenteert een snelle en draagbare methode om CLas-DETECTR genaamd te detecteren, die de RPA- en CRISPR-Cas12a-systemen combineert. De workflow wordt geïllustreerd in figuur 1. CLas-DETECTR detecteert CLas met specificiteit en gevoeligheid (figuur 2 en figuur 3). Bovendien detecteert CLas-DETECTR met behulp van Newhall-bladmonsters CLas met dezelfde gevoeligheid als qPCR (figuur 4

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat ze geen tegenstrijdige belangen hebben.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd financieel ondersteund door het National Key R &D-programma van China (2021YFD1400805), het Major Science and Technology R &D-programma van de provincie Jiangxi (20194ABC28007), projecten van het Jiangxi Education Department (GJJ201449) en de Collaborative Innovation of Modern Agricultural Scientific Research in de provincie Jiangxi (JXXTCX2015002 (3 + 2) -003).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AxyPrep DNA Gel Extraction KitCorning09319KE1China
Bacterial Genomic DNA Extraction KitSolarbioD1600China
EnGen LbCas12a TOLOBIO32104-01China
Ex Taq Version 2.0 plus dyeTaKaRaRR902AChina
Handheld fluorescent detection device LUYOR3415RGChina
Hole puncher Deli114China
Magnesium acetate, MgOAcTwistDxTABAS03KITUK
NaOHSCR10019718China
NEB buffer 3.1 NEBB7203USA
PCR strip tubesLABSELECTPST-0208-FT-CChina
PEG 200 SigmaP3015USA
PrimeSTAR Max DNA PolymerasTaKaRaR045AChina
Quick-Load Purple 1 kb Plus DNA Ladder New England BiolabsN0550SUSA
TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)TaKaRaRR820BChina
TwistAmp BasicTwistDxTABAS03KITUK

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ma, W. X., et al. Citrus Huanglongbing is a pathogen-triggered immune disease that can be mitigated with antioxidants and gibberellin. Nature Communications. 13 (1), 529(2022).
  2. Bové, J. M. ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Candidatus Liberibacter AsiaticusHuanglongbing DetectionRecombinase Polymerase AmplificationCRISPR Cas12aField DiagnosticsIsothermal DNA AmplificationCitrus Leaf TestingFluorescent DetectionqPCR ComparisonDNA Extraction

Related Articles