Visualisatie van actine en microtubulikoppelingsdynamiek in vitro door total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopie

Summary

Dit protocol is een gids voor het visualiseren van dynamische actine en microtubuli met behulp van een in vitro total internal fluorescence (TIRF) microscopie assay.

Abstract

Traditioneel zijn de actine- en microtubulecytoskeletten bestudeerd als afzonderlijke entiteiten, beperkt tot specifieke cellulaire regio's of processen en gereguleerd door verschillende suites van bindende eiwitten die uniek zijn voor elk polymeer. Veel studies tonen nu aan dat de dynamiek van beide cytoskeletale polymeren met elkaar verweven is en dat deze kruisverwijzing nodig is voor de meeste cellulaire gedragingen. Een aantal eiwitten die betrokken zijn bij actine-microtubule interacties zijn al geïdentificeerd (d.w.z. Tau, MACF, GAS, formins en meer) en zijn goed gekarakteriseerd met betrekking tot actine of microtubuli alleen. Relatief weinig studies toonden echter testen van actine-microtubulecoördinatie met dynamische versies van beide polymeren. Dit kan emergente verbindingsmechanismen tussen actine en microtubuli uitsluiten. Hier maakt een op in vitro reconstitutie gebaseerde in vitro reconstitutietechniek op basis van totale interne reflectiefluorescentie (TIRF) de visualisatie van zowel actine- als microtubulidynamiek van de ene biochemische reactie mogelijk. Deze techniek behoudt de polymerisatiedynamiek van actinefilament of microtubuli afzonderlijk of in aanwezigheid van het andere polymeer. Commercieel beschikbaar Tau-eiwit wordt gebruikt om aan te tonen hoe actine-microtubule gedrag verandert in de aanwezigheid van een klassiek cytoskeletaal crosslinking-eiwit. Deze methode kan betrouwbare functionele en mechanistische inzichten bieden in hoe individuele regulerende eiwitten de dynamiek van actine-microtubuli coördineren met een resolutie van enkele filamenten of complexen van hogere orde.

Introduction

Historisch gezien worden actine en microtubuli gezien als afzonderlijke entiteiten, elk met hun eigen set regulerende eiwitten, dynamisch gedrag en verschillende cellulaire locaties. Overvloedig bewijs toont nu aan dat actine- en microtubulepolymeren zich bezighouden met functionele overspraakmechanismen die essentieel zijn voor het uitvoeren van tal van celprocessen, waaronder migratie, mitotische spindelpositionering, intracellulair transport en celmorfologie 1,2,3,4. De diverse gecoördineerde gedragingen die aan deze voorbeelden ten grondslag liggen, zijn afhankelijk van een ingewikkelde balans van koppelingsfactoren, signalen en fysieke eigenschappen. De moleculaire details die aan deze mechanismen ten grondslag liggen, zijn echter nog grotendeels onbekend omdat de meeste studies zich richten op een enkel cytoskeletaal polymeer tegelijk ^1,2,5.

Actine en microtubuli werken niet direct op^{elkaar in 6,7,8}. De gecoördineerde dynamiek van actine en microtubuli in cellen wordt gemedieerd door aanvullende factoren. Veel eiwitten waarvan wordt gedacht dat ze actine-microtubule-overspraak reguleren, zijn geïdentificeerd en hun activiteiten zijn goed gekarakteriseerd met betrekking tot beide cytoskeletale polymeren alleen ^1,2. Groeiend bewijs suggereert dat deze benadering met één polymeer de dubbele functies van sommige van de eiwitten / complexen heeft verborgen die actine-microtubule-koppelingsgebeurtenissen mogelijk maken 7,8,9,10,11,12,13. Experimenten waarbij beide polymeren aanwezig zijn, zijn zeldzaam en definiëren vaak mechanismen met een enkele dynamische polymeer en statische gestabiliseerde versie van de andere 6,8,9,10,11,14,15,16,17,18 . Er zijn dus methoden nodig om de emergente eigenschappen van actine-microtubuli coördinerende eiwitten te onderzoeken die mogelijk alleen volledig worden begrepen in experimentele systemen die beide dynamische polymeren gebruiken.

De combinatie van directe eiwitetiketteringsbenaderingen, genetisch gecodeerde affiniteitstags en total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopie is met groot succes toegepast in biomimetische reconstitutiesystemen 19,20,21,22,23. Veel bottom-up schema's bevatten niet alle factoren die eiwitten in cellen reguleren. De "biochemie op een dekglass"-technologie heeft echter veel mechanismen van actine- en microtubuledynamica verfijnd op hoge ruimtelijke en temporele schalen, inclusief de componenten die nodig zijn voor polymeerassemblage of -demontage, en motoreiwitbeweging 5,12,23,24,25,26,27 . Hier wordt een minimale component single-filament benadering beschreven om actine-microtubule koppeling in vitro te onderzoeken. Dit protocol kan worden gebruikt met in de handel verkrijgbare of zeer zuivere gezuiverde eiwitten, fluorescerend gelabelde eiwitten, perfusiekamers en uitgebreid naar meer gecompliceerde schema's met celextracten of synthetische systemen. Hier wordt commercieel beschikbaar Tau-eiwit gebruikt om aan te tonen hoe cytoskeletale dynamiek verandert in de aanwezigheid van een actine-microtubule koppelingseiwit, maar kan worden vervangen door andere vermeende actine-microtubule coördinerende factoren. Het grote voordeel van dit systeem ten opzichte van andere benaderingen is de mogelijkheid om tegelijkertijd de dynamiek van meerdere cytoskeletale polymeren in één reactie te volgen. Dit protocol biedt gebruikers ook voorbeelden en eenvoudige hulpmiddelen om veranderingen in cytoskeletale polymeren te kwantificeren. Zo zullen protocolgebruikers betrouwbare, kwantitatieve gegevens met één filamentresolutie produceren om mechanismen te beschrijven die ten grondslag liggen aan hoe diverse regulerende eiwitten de dynamiek van actine-microtubuli coördineren.

Protocol

1. Wassen van de coverslips

OPMERKING: Was (24 mm x 60 mm, #1,5) coverslips volgens Smith et al., 2013²⁸.

1. Schik coverslips in een plastic slide mailer container.
2. Dompel coverslips sequentieel onder in de volgende oplossingen en soniceer gedurende 30-60 minuten, spoel met ddH₂O 10 keer tussen elke oplossing: ddH₂O met één druppel afwasmiddel; 0,1 M KOH. Bewaar coverslips in 100% ethanol gedurende maximaal 6 maanden.
   OPMERKING: Raak glazen oppervlakken niet aan met onbeminde vingers. Gebruik in plaats daarvan een tang.

2. Coating gereinigd (24 mm x 60 mm, #1.5) coverslips met mPEG- en biotine-PEG-silaan

OPMERKING: Dit protocol maakt specifiek gebruik van een biotine-streptavidin-systeem om actine en microtubuli in het TIRF-beeldvormingsvlak te positioneren. Andere coatings en systemen kunnen worden gebruikt (bijv. antilichamen, poly-L-lysine, NEM-myosine, enz.).

1. Ontdooi aliquots van PEG-silaan en biotine-PEG-silaanpoeders.
2. Los PEG-poeders op in 80% ethanol (pH 2,0) om coating stockoplossingen van 10 mg / ml mPEG-silaan en 2-4 mg / ml biotine-PEG-silaan te genereren, net voor het gebruik.
   OPMERKING: PEG-poeders lijken vaak opgelost, maar bevinden zich mogelijk niet op microscopisch niveau. Een goede resuspensie duurt ~ 1-2 minuten met constant pipetteren. Gebruikers worden aangemoedigd om nog eens 10 keer te pipetteren na het verschijnen van poederoplossing.
   LET OP: Draag handschoenen om de huid te beschermen tegen geconcentreerde HCl bij het maken van 80% ethanol (pH 2,0).
3. Verwijder de schone (24 mm x 60 mm, #1,5) afdeksel uit de ethanolopslag met behulp van een tang. Droog met stikstofgas en bewaar in een schone petrischaal.
4. Coat coverslips met 100 μL coatingoplossing: een mengsel van 2 mg/ml mPEG-silaan (MW 2.000) en 0,04 mg/ml biotine-PEG-silaan (MW 3.400) in 80% ethanol (pH 2,0).
   OPMERKING: Gebruik voor schaarse coating (aanbevolen) 2 mg / ml mPEG-silaan en 0, 04 mg / ml biotine-PEG-silaan. Gebruik voor dichte coating 2 mg/ml mPEG-silaan, 4 mg/ml biotine-PEG-silaan.
5. Incubeer dekzeilen bij 70 °C gedurende ten minste 18 uur of tot gebruik.
   OPMERKING: Gecoate coverslips degraderen als ze langer dan 2 weken bij 70 °C worden bewaard.

3. Assembleren van imaging flow kamers

1. Knip 12 stroken dubbelzijdige tape met dubbele rug tot een lengte van 24 mm. Verwijder één kant van de taperug en bevestig stukjes tape naast de zes groeven die aanwezig zijn op een schone beeldkamer.
   OPMERKING: Tape moet plat zijn voor een goede montage, anders zullen beeldkamers lekken. Verwijder voorzichtig de taperug om hobbels te voorkomen. Het wordt aanbevolen om getapete kamers op een schoon oppervlak te schuiven naar gladde tape-kamercontacten.
2. Verwijder het tweede stuk taperug om de kleverige kant van de tape langs elke kamergroef bloot te leggen. Plaats kamertape met de zijkant naar boven op een schoon oppervlak.
3. Meng epoxyhars en verharderoplossingen 1:1 (of volgens de instructies van de fabrikant) in een kleine weegboot.
4. Gebruik een P1000-tip om een druppel gemengde epoxy tussen de tapestrips aan het einde van elke groef van de beeldkamer te plaatsen (rode pijl; Figuur 1A). Plaats kamertape/epoxyzijde naar boven op een schoon oppervlak.
5. Verwijder een gecoate coverslip uit de incubator van 70 °C. Spoel gecoate en ongecoate oppervlakken van coverslips zes keer af met ddH₂O, droog met gefilterd stikstofgas en bevestig vervolgens aan de beeldvormingskamer met de coverslip-coatingzijde naar de tape.
6. Gebruik een P200- of P1000-pipetpunt om druk uit te oefenen op de tape-glasinterface om een goede afdichting tussen de tape en de coverslip te garanderen.
   OPMERKING: Met een goede afdichting wordt dubbelzijdige tape doorschijnend. Beeldvormende kamers zonder voldoende tape-kamercontacten zullen lekken.
7. Incubeer geassembleerde kamers bij kamertemperatuur gedurende ten minste 5-10 minuten om de epoxy in staat te stellen kamerputten volledig af te dichten voor gebruik. Perfusiekamers verlopen binnen 12-18 uur na montage.
   OPMERKING: Afhankelijk van de plaatsing van de tape en de dikte van de dubbelzijdige tape die wordt gebruikt, heeft de geassembleerde kamer een eindvolume van 20-50 μL.

4. Conditionering van perfusiekamers

1. Gebruik een perfusiepomp (snelheid ingesteld op 500 μL/min) om sequentieel conditioneringsoplossingen in de perfusiekamer als volgt uit te wisselen:
   1. Stroom 50 μL van 1% BSA om de beeldkamer te primen. Verwijder overtollige buffer uit het Luer lock fitting reservoir.
   2. Stroom 50 μL van 0,005 mg/ml streptavidin. Incubeer gedurende 1-2 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder overtollige buffer uit het reservoir.
   3. Stroom 50 μL van 1% BSA om niet-specifieke binding te blokkeren. Incubeer gedurende 10-30 s. Verwijder overtollige buffer uit het reservoir.
   4. Debiet 50 μL warme (37 °C) 1x TIRF-buffer (1x BRB80, 50 mM KCl, 10 mM DTT, 40 mM glucose, 0,25% (v/v) methylcellulose (4.000 cp)).
      OPMERKING: Verwijder geen overtollige buffer uit het reservoir. Dit voorkomt dat de kamer uitdroogt, waardoor luchtbellen in het systeem kunnen komen.
   5. Optioneel: Stroom 50 μL gestabiliseerde²⁹ en 50% gebiotinyleerde microtubulizaden verdund in 1x TIRF-buffer.
      OPMERKING: De juiste verdunning moet empirisch worden bepaald en batch-tot-batchvariabiliteit bevatten. Protocollen van ^27,29 worden aanbevolen als uitgangspunten. Een verdunning die 10-30 zaden per gezichtsveld oplevert, werkt goed met deze opstelling.

5. Microscoop voorbereiding

OPMERKING: Biochemische reacties die dynamische actinefilamenten en microtubuli bevatten, worden gevisualiseerd/uitgevoerd met behulp van een omgekeerde Tirf-microscoop (Total Internal Reflection Fluorescence) die is uitgerust met 120-150 mW solid-state lasers, een temperatuurgecorrigeerde 63x olie-onderdompeling TIRF-objectief en een EMCCD-camera. Eiwitten in dit voorbeeld worden gevisualiseerd op de volgende golflengten: 488 nm (microtubuli) en 647 nm (actine).

1. Stel de podium-/objectiefverwarmingsinrichting in op 35-37 °C ten minste 30 minuten voordat de eerste biochemische reactie in beeld wordt gebracht.
2. Stel de parameters voor het verkrijgen van afbeeldingen als volgt in:
   1. Stel het acquisitie-interval in op elke 5 s gedurende 15-20 minuten.
   2. Stel 488 en 647 laserblootstellingen in op 50-100 ms bij 5%-10% vermogen. Stel de juiste TIRF-hoek in voor de microscoop.
      OPMERKING: Ongeacht de opstelling van de microscoop, is de eenvoudigste manier om het laservermogen, de belichting en de TIRF-hoek in te stellen, het maken van aanpassingen op afbeeldingen van beide polymeren alleen (zie 5.2.2.1 en 5.2.2.2, hieronder). Gebruikers worden sterk aangemoedigd om de laagste laservermogens en belichtingsinstellingen te gebruiken die nog steeds detectie mogelijk maken.
      1. Pas de polymerisatiereactie aan (figuur 1C) om actinefilamentassemblage te starten en beelden te verkrijgen bij 647 nm. Breng de juiste aanpassingen aan.
      2. Pas de polymerisatiereactie aan in een tweede geconditioneerde perfusieput om de assemblage van microtubuli te initiëren (figuur 1C) en visualiseer bij 488 nm. Breng de juiste aanpassingen aan.

6. Bereiding van eiwitreactiemengsels

1. Bereid de stamoplossing van fluorescerend geëtiketteerd tubuline.
   1. Bepaal de concentratie van zelfgemaakte ongelabelde tubuline via spectrofotometrie bij Abs₂₈₀, als volgt:
      1. Lege spectrofotometer met 1xBRB80 zonder GTP.
      2. Bereken de concentratie tubuline met behulp van de vastgestelde extinctiecoëfficiënt van 115.000 ^{M-1 cm-1} en de volgende formule:
         
   2. Resuspendeer commercieel gemaakte gelyofiliseerde lysine-gelabelde 488-tubuline tot 10 μM (1 mg / ml; 100% label) met 20 μL van 1x BRB80 zonder GTP.
   3. Ontdooi een aliquot van 7,2 μL van 100 μM ongelabeld gerecycled tubuline²⁹ op ijs.
      OPMERKING: Gerecyclede tubuline is van cruciaal belang voor een succesvolle assemblage van microtubuli in vitro omdat het polymerisatie-incompetente dimeren verwijdert die zijn gevormd in bevroren eiwitvoorraden^29,30.
   4. Combineer 3 μL 10 μM 488-tubuline met de 7,2 μL aliquot van 100 μM ongelabelde tubuline, niet meer dan 15 minuten voor gebruik.
2. Bereid de stamoplossing van fluorescerend geëtiketteerd actine.
   1. Bepaal voor zelfgemaakte eiwitten de concentratie en het percentage label van actine via spectrofotometrie Abs₂₉₀ en Abs₆₅₀, als volgt:
      1. Blanco spectrofotometer met G-buffer.
      2. Bereken de concentratie van niet-geëtiketteerd actine met behulp van de vastgestelde extinctiecoëfficiënt van 25,974 ^{M-1 cm-1} en de volgende formule:
         
      3. Bereken de concentratie van lysine gelabeld Alexa-647-actine met behulp van de extinctiecoëfficiënt van niet-gelabeld actine, de fluorcorrectiefactor van 0,03 en de volgende formule:
         [Alexa-647 actine], μM = (Abs_{290 -}
      4. Bereken het procentuele label van Alexa-647-actin met behulp van de bepaalde ε voor Alexa-647 van 239.000 ^{M-1 cm-1}, als volgt:
         % label van Alexa-647-actine = (Abs₂₉₀ - (
   2. Ontdooi één aliquot van 2 μL van 3 μM 100% gelabeld biotine-actine (geëtiketteerd op lysineresiduen). Verdun 10-voudig door 18 μL G-buffer toe te voegen.
   3. Combineer 3 μL verdund gebiotinyleerd actine, geschikte volumes ongelabelde en gelabelde actine (hierboven) zodat de uiteindelijke mix 12,5 μM totaal actine met 10% -30% fluorescerend label zal zijn.
      OPMERKING: Meer dan 30% procent fluorescerende actinemonomeren (final) kunnen de beeldresolutie in gevaar brengen, omdat filamenten moeilijk te onderscheiden zijn van de achtergrond.
3. Bereid reactiemixen voor (figuur 1C).
   1. Bereid cytoskeletmengsel (buis A) door 2 μL van de 12,5 μM actinemix (6.2.3) te combineren met het tubulinebouillonmengsel (6.1.4), niet meer dan 15 minuten voorafgaand aan de beeldvorming. Bewaren op ijs tot gebruik.
   2. Bereid eiwitreactiemix (buis B) voor door alle andere experimentele componenten en eiwitten te combineren, waaronder: 2x TIRF-buffer, antibleekmiddel, nucleotiden, buffers en accessoire-eiwitten. Een voorbeeld is weergegeven in figuur 1C.
      OPMERKING: De uiteindelijke verdunning resulteert in een 1x TIRF-buffer die ATP, GTP en ionische sterkte bevat binnen het geschatte fysiologische bereik.
4. Incubeer buis A en buis B afzonderlijk bij 37 °C gedurende 30-60 s. Om de reactie op gang te brengen, mengt u en voegt u de inhoud van buis B toe aan buis A (hieronder).

7. Beeld actine en microtubule dynamiek

1. Conditie perfusieput (figuur 1B; stap 4, hierboven).
2. Start de assemblage van actine en microtubuli gelijktijdig door de inhoud van buis B (reactiemengsel) toe te voegen aan buis A (cytoskeletmengsel) (figuur 1C).
3. Stroom 50 μL reactie met 1x TIRF-buffer aangevuld met 15 μM vrije tubuline, 1 mM GTP en 0,5 μM actinemonomeren en geschikte volumes buffercontroles.
4. Neem time-lapse-film op met behulp van microscoopsoftware om elke 5 s gedurende 15-20 minuten te verkrijgen.
   OPMERKING: Initiatie van actine- en microtubuledynamica vindt plaats binnen 2-5 minuten (figuur 2). Langere vertragingen duiden op problemen met temperatuurregeling of concentratiegerelateerde problemen van eiwitten in de reactiemix.
5. Conditioneer een nieuwe perfusieput (stap 4) en vervang het buffervolume door regulerende eiwitten van belang (d.w.z. Tau) en buffercontroles (figuur 1C). Verwerven zoals beschreven in stap 7 (hierboven) om regulerende eiwitten te beoordelen voor emergente actine-microtubule-functies.

8. Verwerk en analyseer afbeeldingen met FIJI-software³¹

1. Open opgeslagen TIRF-films en bekijk deze als een compositie.
2. Analyseer de dynamiek van microtubuli (figuur 3A), als volgt:
   1. Genereer een op tijd gebaseerde maximale Z-projectie vanuit het menu afbeeldingsstapels.
   2. Synchroniseer het Z-projectievenster met de originele TIRF-film vanuit het menu Analyze> Tools> Windows synchroniseren .
   3. Teken een lijn met het rechte lijngereedschap langs een microtubule die van belang is op de tijd geprojecteerde afbeelding.
      1. Open de regio van belang (ROI) manager vanuit het analyseren menu (Analyseren> Tools> ROI Manager).
      2. Sla individuele microtubulilocaties op door op "t" te drukken. Herhaal dit voor alle microtubuli van belang.
   4. Plot kymografen van geselecteerde lijnen met behulp van "/" of voer de multi-kymo macro uit die een video en kymograaf genereert voor elke microtubuli in de ROI manager³¹.
      1. Voeg zowel lengte- (μm) als tijd (min) schaalbalken toe aan kymografen vanuit het menu Balken Analyseren> Extra> Schalen .
   5. Meet de groeisnelheden van microtubuli vanaf kymograafhellingen (figuur 3A, 1-2; helling van zwarte lijnen).
   6. Tel dynamische microtubulegebeurtenissen (catastrofe of hergroei) van de gegenereerde kymograaf of met behulp van beschikbare analysemacro's 5,8,18,25. Rode stippellijnen in figuur 3A, 1-2 vertegenwoordigen catastrofe/snelle demontagegebeurtenissen.
3. Analyseer de actinedynamiek (figuur 3B), als volgt:
   1. Meet actine-nucleatie als volgt:
      1. Tel het aantal actinefilamenten dat 100 s na het initiëren van de reactie in het gezichtsveld aanwezig is en druk uit door het gebied (filamenten per μm²).
      2. Registreer en bewaar gegevens in ROI Manager, zoals in stap 8.2.3.1 hierboven.
   2. Meet de reksnelheid van actinefilamenten (figuur 3B), als volgt:
      1. Teken een lijn langs een interessant actinefilament met behulp van het gereedschap gesegmenteerde lijn.
      2. Voeg regel toe aan ROI-manager zoals in stap 8.2.3.1 hierboven.
      3. Herhaal het volgen van de regel (elke meting toevoegen aan ROI-manager) voor ten minste vier filmframes.
         OPMERKING: Het meten van zeven tot acht opeenvolgende frames wordt aanbevolen, maar sommige omstandigheden vertragen de actinepolymerisatie onder de detecteerbare limiet die kan worden opgelost door objectieve / microscoopopopstellingen. In een dergelijk geval kunnen metingen worden uitgevoerd met regelmatige tussenpozen over niet-opeenvolgende frames (bijvoorbeeld om de vijf frames).
      4. Plot gemeten lengtewaarden over verstreken tijd. De helling van de gegenereerde lijn is de actine-reksnelheid in micron/s.
      5. Breng de uiteindelijke berekende snelheden over als subeenheden ^{s-1 μM-1} met behulp van een correctiefactor van 370 subeenheden om rekening te houden met het aantal actinemonomeren in een micron filament³².
4. Voer correlatieve analyse uit voor regio's van parallelle actine-microtubule associatie (figuur 3C), als volgt:
   1. Teken een lijn langs een microtubuli van belang op een specifiek tijdstip (d.w.z. 300 s na het initiëren van de reactie), met behulp van het rechtlijnige gereedschap.
      1. Voeg regel toe aan ROI-manager zoals in stap 8.2.3.1 hierboven.
   2. Zet de fluorescentie-intensiteit langs de lijn in elk kanaal uit.
      1. Selecteer elk kanaal met de afbeeldingsschuifregelaar en plot de intensiteiten langs de lijn met behulp van "command k".
      2. Sla waarden op of exporteer ze door op de knop "lijst" in het uitvoervenster te klikken.
   3. Druk actine-microtubule-koppelingsgebeurtenissen uit als een verhouding (actine die overlapt met microtubuli) van individuele gebeurtenissen of als een telling van gebeurtenissen in een bepaald gezichtsveld op een consistent tijdstip (figuur 3C).
   4. Alternatief: Gebruik software om de procentuele overlap van beide kanalen te bepalen ^5,12.

Results

Onder de hierboven beschreven omstandigheden (figuur 1) moeten actine- en microtubulepolymeren binnen 2 minuten na beeldacquisitie zichtbaar (en dynamisch) zijn (figuur 2). Zoals met elk op biochemie gebaseerd protocol, kan optimalisatie vereist zijn voor verschillende regulerende eiwitten of batches eiwit. Om deze redenen worden de TIRF-hoek en beeldbelichtingen eerst ingesteld met reacties die elk afzonderlijk polymeer bevatten. Dit bevestigt dat opgeslagen eiwitten functioneel zijn en dat er voldoende gelabeld eiwit aanwezig is voor detectie. Hoewel niet altijd noodzakelijk (en hier niet uitgevoerd), kan nabewerking van films (d.w.z. achtergrondaftrek, middeling of Fouriertransformaties) worden gebruikt om het beeldcontrast (met name van microtubuli) te verbeteren ^5,25,33. De directe visualisatie van enkelvoudige actinefilamenten en microtubuli die door deze test wordt geboden, ondersteunt de kwantitatieve bepaling van verschillende dynamische metingen voor cytoskeletcomponenten alleen of samen, waaronder polymerisatieparameters (d.w.z. nucleatie- of reksnelheid), demontageparameters (d.w.z. krimpsnelheden of catastrofegebeurtenissen) en polymeer coalignment / overlap (figuur 3 ). Verder kunnen deze maatregelen worden gebruikt als uitgangspunt om de binding of invloed van regulerende liganden zoals Tau te ontcijferen (figuur 3). Veel metingen van enkelvoudige actinefilamenten of microtubuli kunnen worden gemaakt van één TIRF-film. Vanwege variaties in coverslipcoating, pipetteren en andere factoren, moeten betrouwbare metingen echter ook meerdere technische replicatiereacties / films omvatten.

Veel facetten van de dynamiek van microtubuli kunnen worden bepaald aan de hand van voorbeeld-kymografen, waaronder de snelheid van microtubule-rek, evenals de frequentie van catastrofe- en reddingsgebeurtenissen (figuur 3A). Het gebruik van kymografen om actinedynamiek in dit systeem te meten is niet zo eenvoudig omdat actinefilamenten ingewikkelder zijn dan microtubuli. Als gevolg hiervan worden parameters van actinefilamentdynamica met de hand gemeten, wat tijdrovend en arbeidsintensief is. Nucleatietellingen worden gemeten als het aantal actinefilamenten dat aanwezig is op een consistent tijdstip voor alle omstandigheden. Deze tellingen variëren sterk tussen TIRF-beeldvormingsvelden, maar kunnen worden gebruikt met veel replicaties of als aanvulling op waarnemingen van andere polymerisatietests. Nucleatietellingen kunnen ook worden gebruikt voor microtubuli als de proefomstandigheden geen gestabiliseerde microtubulizaden hebben. De reksnelheid van actinefilamentfilamenten wordt gemeten als de lengte van het filament in de loop van de tijd van ten minste vier filmframes. Snelheidswaarden worden per micromolair actine overgebracht met een correctiefactor van 370 subeenheden om rekening te houden met het aantal actinemonomeren in een micron filament (figuur 3B)³². Metingen om het gecoördineerde gedrag tussen actine en microtubuli te definiëren zijn minder goed gedefinieerd. Er zijn echter correlatieve analyses toegepast om het toeval van beide polymeren te meten, inclusief lijnscans (figuur 3C) of overlapsoftware ^5,11,34.

Beschikbaarheid van gegevens:
Alle datasets in verband met dit werk zijn gedeponeerd in Zenodo en zijn met redelijk verzoek beschikbaar op: 10.5281/zenodo.6368327.

Figuur 1. Experimentele schema's: flow chamber assembly naar image acquisition. (A) Beeldvormingskamerassemblage. Van boven naar beneden: IBIDI-beeldvormingskamers worden langs perfusieputten geplakt (aangeduid met pijl); de tweede (witte) laag taperug (links op de getoonde afbeelding om gebruikers beter te oriënteren) wordt verwijderd en Epoxy wordt aangebracht aan de rand van de perfusiekamer (pijl). Opmerking: Om gebruikers gemakkelijker te oriënteren waar ze de epoxy moeten plaatsen, is de witte achterkant op deze afbeelding blijven staan. De gereinigde en gecoate coverslip wordt bevestigd aan de beeldkamer met de coatingzijde naar de binnenkant van de perfusieput. (B) Stroomdiagram ter illustratie van de stappen voor conditionering van beeldvormingskamers voor biotine-streptavidin-verbindingen. (C) Voorbeelden van reacties die worden gebruikt om TIRF-films van dynamische microtubuli en actinefilamenten te verkrijgen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2. Beeldsequenties van groeiende actinefilamenten en microtubuli in afwezigheid of aanwezigheid van Tau. Time-lapse beeldmontage van TIRF-assays met 0,5 μM actine (10% Alexa-647-actine en 0,09% biotine-actine gelabeld) en 15 μM vrij tubuline (4% HiLyte-488 gelabeld) in afwezigheid (A) of aanwezigheid (B) van 250 nM Tau. De tijd die is verstreken vanaf de reactie-initiatie (mengen van buis A en buis B) wordt weergegeven. Schaalbalken, 25 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3. Voorbeeldmetingen van microtubuli en actinefilamentdynamica. (A) Gemiddelde tijdprojectie van het tubulinekanaal visualiseert efficiënt de totale microtubulilengtes voor de lijnscans die worden gebruikt om kymografische plots te genereren. Zwarte stippellijnen komen overeen met de twee voorbeeld kymografen van dynamische microtubuli die rechts worden weergegeven. De groeifasen (effen zwarte lijnen) en demontagefasen (gedopeerde roze lijnen; twee aangeduid met roze pijlen) van microtubuli worden op elke kymograaf weergegeven. Tijdschaalbalk, 3 min. Lengte schaalbalk, 10 μm. Reaction bevat 0,5 μM actine (10% 647-label) en 15 μM vrij tubuline (4% 488-HiLyte label). Alleen het tubulinekanaal wordt weergegeven. (B) Twee voorbeeld time-lapse beeldmontages die single-actine filamenten weergeven die actief polymeriseren. Reksnelheden worden berekend als de helling van plots van de lengte van actinefilamenten in de loop van de tijd per micromolair actine. Daarom moet een correctiefactor van twee worden toegepast op actinereacties van 0,5 μM ter vergelijking voor snelheden die doorgaans worden bepaald bij de actineconcentratie van 1 μM. Voorbeelden van vijf filamenten zijn rechts weergegeven. Schaalstaven, 10 μm. Reaction bevat 0,5 μM actine (10% 647-label) en 15 μM vrij tubuline (4% 488-HiLyte label). Alleen het actinekanaal wordt weergegeven. (C) TIRF-beelden van dynamische microtubuli (MT) (groen) en actinefilamenten (paars) die polymeriseren in afwezigheid (links) of aanwezigheid van 250 nM Tau (midden). Blauwe stippellijnen en pijlen markeren waar een lijn is getekend voor de lijnscanplots die overeenkomen met elke voorwaarde (onder elke afbeelding). Overlap tussen microtubuli en actineregio's (weergegeven als zwart) kan worden gescoord op een bepaald tijdstip per gebied (rechts). Schaalbalken, 25 μm. Reacties bevatten 0,5 μM actine (10% 647-label) en 15 μM vrij tubuline (4% 488-HiLyte label) met of zonder 250 nM Tau. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Het gebruik van total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopie om gevisualiseerde gezuiverde eiwitten te visualiseren is een vruchtbare en overtuigende benadering geweest om unieke mechanismen van cytoskeletale regulatie te ontleden 5,23,24,25,26,27,35. In vergelijking met traditionele biochemische assays vereisen TIRF-reacties zeer kleine volumes (50-100 μL) en kwantitatieve metingen van cytoskeletale dynamica kunnen worden afgeleid uit een individuele test. De meeste studies van cytoskeletale dynamica richten zich op een enkel polymeersysteem (d.w.z. actinefilamenten of microtubuli), dus gedetailleerde metingen van de kruisverwijzing of emergent gedrag tussen actinefilamenten en microtubuli die typisch in cellen worden gezien, zijn ongrijpbaar gebleven en moeilijk te recapituleren in de reageerbuis. Om dit probleem op te lossen, beschrijft dit protocol een TIRF-microscopiesysteem met één filament dat de directe visualisatie van dynamische actine- en microtubulepolymeren in dezelfde biochemische reactie mogelijk maakt. Deze methode gaat dus verder dan traditionele testen die het dynamische gedrag van actinefilamenten of microtubuli alleen samenvatten. Deze techniek werd ook uitgevoerd met Tau als voorbeeld van hoe verschillende dynamische eigenschappen veranderen in de aanwezigheid van een cytoskeletkoppelingsfactor. Dit protocol kan worden gebruikt met extra eiwitten waarvan bekend is of vermoed wordt dat ze de dynamiek van actine of microtubuli coördineren, inclusief (maar niet beperkt tot) MACF, GAS, formins en meer. Ten slotte kunnen voorbeeldanalyses worden gebruikt als leidraad om gegevens te kwantificeren die met dit protocol zijn verkregen.

"Zien is geloven" is een dwingende reden om op microscopie gebaseerde testen uit te voeren. Voorzichtigheid is echter geboden bij de uitvoering en interpretatie van TIRF-microscopie-experimenten. Een grote uitdaging van cytoskeletale co-assemblagetests is dat veel veelgebruikte beeldvormingsomstandigheden niet compatibel zijn met elk polymeer. Microtubuli en actine hebben meestal verschillende buffer-, temperatuur-, zout-, nucleotide- en concentratievereisten voor polymerisatie. Actine, tubuline, regulerende eiwitten van belang en de buffers die in dit protocol worden gebruikt, zijn gevoelig voor vries-dooicycli. Daarom is een zorgvuldige omgang met eiwitten en buffers noodzakelijk om dit protocol met succes uit te voeren. Om veel van deze zorgen weg te nemen, wordt het gebruik van vers gerecyclede tubuline (<6 weken ingevroren) en het vooraf opruimen van bevroren / geresuspendeerde actines via ultracentrifugatie sterk aanbevolen. Deze overwegingen zijn ook van toepassing op de talloze regulerende eiwitten die met deze procedure moeten worden beoordeeld, die gevoelig kunnen zijn voor vries-dooicycli of de concentratie van bufferzouten ^5,11,36.

Helaas bestaat er geen one-size-fits-all buffer zonder experimentele afwegingen. Om meer volume toe te eigenen voor eiwitten met een lagere concentratie, kunnen ATP en GTP worden opgenomen in de 2x TIRF-bufferoplossing (figuur 1C). Omdat deze nucleotiden echter extreem gevoelig zijn voor vries-dooicycli, wordt dit niet aanbevolen. De zuurstofopruimingsverbindingen die hier worden gebruikt (d.w.z. catalase en glucose-oxidase) zijn nodig om eiwitten gedurende lange tijd (minuten tot uren) te visualiseren, maar het is bekend dat ze de polymerisatie van microtubuli bij hoge concentraties beperken⁵. In verband met deze bufferoverwegingen is een beperking van dit protocol dat sommige canonieke microtubule-geassocieerde regulerende eiwitten meer of minder zout nodig kunnen hebben om functies in cellen of assays met alleen microtubuli (zonder actine) te recapituleren. Het veranderen van de aard of concentratie van zout om deze zorgen aan te pakken, zal waarschijnlijk van invloed zijn op de polymerisatie van actinefilamenten en / of parameters van de dynamiek van microtubuli. Metingen van meerdere beschrijvende parameters (minimaal, nucleatie, reksnelheden en stabiliteit) (figuur 3) zijn vereist om het succes van het protocol te bevestigen of om de effecten van specifieke buffers of regulerende eiwitten expliciet te documenteren. Te veel actinefilamentpolymerisatie kan bijvoorbeeld actine-microtubule-koppelingsgebeurtenissen binnen enkele seconden verdoezelen. Bijgevolg zal het verfijnen van experimentele omstandigheden door de totale concentratie van actine te verlagen of extra eiwitten op te nemen om actine-nucleatie te onderdrukken (d.w.z. profiline) de totale periode verlengen dat gecoördineerde actine-microtubule-activiteiten duidelijk kunnen worden bekeken. Besturingselementen die aan deze vereisten voldoen, en technische replicaties (buiten meerdere gezichtsvelden) zijn van cruciaal belang voor gebruikers om betrouwbare en reproduceerbare resultaten te genereren.

Celgebaseerde studies bieden beperkte mogelijkheden om directe eiwit-eiwitrelaties of de werking van regulerende complexen te observeren. Daarentegen weerspiegelen sommige van de mechanismen die zijn verkregen uit in vitro assays niet altijd het exacte gedrag van eiwitten die in cellen worden gezien. Dit klassieke biochemische dilemma kan worden aangepakt in toekomstige toepassingen van deze techniek met specifieke aanpassingen. Het toevoegen van functionele fluorescerend gelabelde koppelingseiwitten breidt deze methode bijvoorbeeld uit van studies met één filament naar studies met één molecuul. Assays kunnen verder worden aangepast om celextracten te gebruiken die de "ontbrekende" onbekende sleutelfactoren kunnen toevoegen die nodig zijn om celachtige verschijnselen samen te vatten. Tirf-gebaseerde assays met behulp van gist of Xenopus-extracten hebben bijvoorbeeld contractiele actomyosineringen³⁷, mitotische spindels^26,38, componenten van actine of microtubuliassemblage^39,40 gereconstitueerd, en zelfs dynamiek bij het centrosoom en kinetochoren 36,41,42,43 . Bovendien kunnen dergelijke systemen de weg vrijmaken voor kunstmatige celsystemen met lipiden of signaalfactoren die ^44,45,46 aanwezig zijn.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% BSA (w/v)	Fisher Scientific	BP1600-100	Voor dit doel (TIRF-kamers blokkeren) wordt BSA opnieuw opgelost in ddH20 en gefilterd door een 0.22 µm filter.
1× BRB80	Homemade		80 mM PIPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 6.8 met KOH
10 mg/mL (1000 U) glucose oxidase	Sigma Aldrich Inc, St. Louis, MO	G2133-50KU	Gecombineerd met catalase, gealiquoteerd en bewaard bij -80 oC tot gebruik
100 µM tubuline	Cytoskeleton Inc, Denver, CO	T240	Zelfgemaakte tubulines moeten worden gerecycled voor gebruik om polymerisatie-incompetente tubuline te verwijderen (Hyman et al. (1992)29; Li en Moore (2020)30). Commercieel verkrijgbare tubulines zijn vaak te verdund om te recycleren, maar functioneren goed als ze worden opgelost volgens de instructies van de fabrikant en voorgeklaard via ultracentrifugering (278.000 × g) gedurende 60 minuten, vóór gebruik.
100 mM ATP	Gold Biotechnology Inc, Olivette, MO	A-081	Opnieuw opgelost in ddH20 (pH 7.5) en filter gesteriliseerd.
100 mM GTP	Fisher Scientific	AC226250010	Opnieuw opgelost in 1× BRB80 (pH 6.8) en filter gesteriliseerd.
120-150 mW solid-state lasers	Leica Microsystems	11889151; 11889148
2 mg/mL catalase	Sigma Aldrich Inc, St. Louis, MO	C40-100	Gecombineerd met glucose oxidase, gealiquoteerd en bewaard bij -80 oC tot gebruik
2× TIRF-buffer	Homemade		2× BRB80, 100 mM KCl, 20 mM DTT, 80 mM glucose, 0.5% (v/v) methylcellulose (4.000 cp); Opmerking: 1 µL van 0.1M GTP en 1 µL van 0.1M ATP worden afzonderlijk aan TIRF-reacties toegevoegd om herhaalde bevriezings-ontdooicycli te voorkomen.
24 × 60 mm, #1.5 dekglas	Fisher Scientific, Waltham, MA	22-266882	Het dekglas moet grondig worden gewassen voor gebruik (Smith et al. (2014)22)
37 oC heatblock
37 oC waterbad
5 mg/mL Streptavidin (600x stock)	Avantor, Philadelphia, PA	RLS000-01	Opnieuw opgelost in Tris-HCl (pH 8.8); verdun de aliquot tot 1× in HEK-buffer op de dag van gebruik
5 min epoxyhars en verharder	Loctite, Rocky Hill, CT	1365736	Gecombineerde hars en verharder kunnen tot 30 minuten duren om te drogen.
50% biotinylerde-GpCpp microtubuluszaden	Cytoskeleton Inc; Homemade	T333P	(optioneel) GppCpp of Taxol gestabiliseerd microtubuluszaden kunnen efficiënter microtubuluspolymerisatie mediëren. Taxol en GppCpp stabiliseren microtubuli op verschillende manieren die de microtubulusrasterstructuur en het vermogen van bepaalde regulerende eiwitten om aan de gestabiliseerde delen van het microtubulus te binden, kunnen beïnvloeden. Een methode om verschillende soorten microtubuluszaden te maken, wordt beschreven in Hyman et al. (1992).
70 oC incubator
Actinemix-stock	Homemade; dit protocol		Een 12,5 µM actinemix bestaande uit gelabelde (fluorescente en biotinyleerde) en ongelabelde actine voor maximaal zes reacties. 2 µL van de stock wordt gebruikt in de uiteindelijke TIRF-reactie. De uiteindelijke concentratie van actine die in elke reactie wordt gebruikt, is 0.5 µM (10% Alexa-647; 0,09% biotin-gelabeld).
Gepaste buffercontroles	Homemade		Combinatie van buffers van alle eiwitten die worden beoordeeld
Biotin-PEG-silaan (MW 3.400)	Laysan Bio Inc	biotin-PEG-SIL-3400	Uitgedeeld in 2-5 mg aliquots, teruggevuld met stikstof, gesloten met parafilm en bewaard bij -20 oC met droogmiddel tot gebruik
Biotinyleerde actine	Cytoskeleton Inc; Homemade	AB07	Biotin-actine wordt gemaakt door op lysine-residuen te labelen en wordt dus verondersteld ten minste 100% gelabeld te zijn, maar varieert met verschillende lots/preparaties.  Optimale biotinyleerde actineconcentraties moeten empirisch worden bepaald voor specifieke gebruiken/experimentele ontwerpen. Hogere concentraties laten efficiënter tracking toe, maar kunnen polymerisatie of interacties met regulerende eiwitten belemmeren. Hier is een klein percentage (0,09% of 900 pM) biotinyleerde actine aanwezig in de uiteindelijke TIRF-reactie.
Schelpspoelmiddel	Dawn, Procter and Gamble, Cincinnati, OH		Om onbekende redenen reinigt de blauwe versie dekglazen efficiënter dan andere beschikbare kleuren.
Droogigs
FIJI-software	www.https://imagej.net/software/fiji/downloads		Schneider et al. (2012)31.
Fluorescent gelabelde actine	Cytoskeleton Inc; Homemade	AR05	Zelfgemaakte fluorescent gelabelde actine wordt bewaard in G-buffer aangevuld met 50% glycerol bij -20 oC (Spudich et al. (1971)47; Liu et al. (2022)48). Fluorescerend gelabelde actine wordt gedialyseerd tegen G-buffer en voorgeklaard via ultracentrifugering gedurende 60 minuten bij 278.000 × g vó