Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Reconstitutie van septineassemblage bij membranen om biofysische eigenschappen en functies te bestuderen

2.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/64090

⸱

28 juli 2022

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Biophysics, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Curriculum in Genetics and Molecular Biology, University of North Carolina at Chapel Hill, 3Department of Biology, University of North Carolina at Chapel Hill

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Celvrije reconstitutie is een belangrijk hulpmiddel geweest om de cytoskeletassemblage te begrijpen, en het werk in het afgelopen decennium heeft benaderingen vastgesteld om septinedynamica in minimale systemen te bestuderen. Hier worden drie complementaire methoden gepresenteerd om septineassemblage in verschillende membraancontexten te observeren: vlakke bilayers, sferische steunen en staafsteunen.

Samenvatting

De meeste cellen kunnen hun vorm waarnemen en veranderen om fundamentele celprocessen uit te voeren. In veel eukaryoten is het septinecytoskelet een integraal onderdeel van het coördineren van vormveranderingen zoals cytokinese, gepolariseerde groei en migratie. Septines zijn filamentvormende eiwitten die zich verzamelen om diverse structuren van hogere orde te vormen en in veel gevallen worden aangetroffen in verschillende delen van het plasmamembraan, met name in regio's met een positieve kromming op micronschaal. Het monitoren van het proces van septineassemblage in vivo wordt belemmerd door de beperkingen van lichtmicroscopie in cellen, evenals de complexiteit van interacties met zowel membranen als cytoskeletale elementen, waardoor het moeilijk is om septinedynamiek in levende systemen te kwantificeren. Gelukkig is er in het afgelopen decennium aanzienlijke vooruitgang geboekt bij het reconstitueren van het septinecytoskelet in een celvrij systeem om de mechanismen te ontleden die de septineassemblage regelen bij hoge ruimtelijke en temporele resoluties. De kernstappen van septineassemblage omvatten septine heterooligomeer associatie en dissociatie met het membraan, polymerisatie in filamenten en de vorming van hogere orde structuren door interacties tussen filamenten. Hier presenteren we drie methoden om septineassemblage in verschillende contexten te observeren: vlakke bilayers, sferische steunen en staafsteunen. Deze methoden kunnen worden gebruikt om de biofysische parameters van septines in verschillende stadia van assemblage te bepalen: als enkele octameren die het membraan binden, als filamenten en als assemblages van filamenten. We gebruiken deze parameters in combinatie met metingen van krommingsbemonstering en preferentiële adsorptie om te begrijpen hoe krommingsdetectie werkt op verschillende lengte- en tijdschalen.

Inleiding

De vormen van cellen en veel van hun interne compartimenten zijn afhankelijk van de lipidemembranen die hen omringen. Membranen zijn visco-elastische structuren die kunnen worden vervormd door interacties met eiwitten, lipidensortering en werkende interne en externe krachten om een verscheidenheid aan vormen te genereren 1,2,3,4. Deze vormen worden vaak beschreven in termen van membraankromming. Cellen gebruiken een gevarieerde reeks eiwitten die bij voorkeur kunnen assembleren op, of "detecteren", bepaalde membraankrommingen om gedefinieerde spatio-temporele controle over processen zoals celhandel, cytokinese en migratie te garanderen 5,6. De dynamiek van celmachines aan het membraan is met name moeilijk waar te nemen vanwege de moeilijkheid om tijd en ruimtelijke resolutie in evenwicht te brengen met de gezondheid van cellen. Hoewel superresolutietechnieken een gedetailleerd beeld van dergelijke structuren kunnen bieden, vereisen ze langdurige acquisities die niet geschikt zijn voor de tijdschalen van montage / demontage voor de meeste machines. Bovendien maken de moleculaire complexiteit van deze assemblages in hun oorspronkelijke omgeving en de veelheid aan rollen die een enkele component kan spelen, minimale reconstitutiesystemen een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van de functionele capaciteit van moleculen.

Minimale membraan mimetica zijn ontwikkeld om membraaneigenschappen en eiwit-membraan interacties buiten de cel te bestuderen. Membraan mimetica variëren van vrijstaande lipide bilayers, zoals liposomen of gigantische unilamellaire blaasjes, tot ondersteunde lipide bilayers (SLBs)7,8,9,10. SWB's zijn biomimetische membranen verankerd aan onderliggende ondersteuning, meestal samengesteld uit glas, mica of silica11,12. Een verscheidenheid aan geometrieën kan worden gebruikt, waaronder vlakke oppervlakken, bollen, staven en zelfs golvende of micropatterned substraten om eiwit-membraaninteracties op zowel concave als convexe krommingen tegelijkertijdte onderzoeken 1 3,14,15,16,17,18 . Bilayer-vorming begint met adsorptie van blaasjes op een hydrofiel oppervlak, gevolgd door fusie en breuk om een continue bilayer te vormen (figuur 1)19. Ondersteunde bilayers zijn bijzonder vatbaar voor licht- en elektronenmicroscopie en bieden zowel een betere tijd als ruimtelijke resolutie dan vaak haalbaar is in cellen. Gebogen SWB's bieden vooral een aantrekkelijk middel om de gevoeligheid van eiwitkromming te onderzoeken bij afwezigheid van significante membraanvervorming, waardoor men onderscheid kan maken tussen krommingsdetectie en krommingsinductie, die vaak onmogelijk te scheiden zijn in vrijstaande systemen.

Septines zijn een klasse van filamentvormende cytoskeletale eiwitten die bekend staan om hun vermogen om te assembleren op positief gebogen membranen 6,18,20. In de loop van de celcyclus in gist verzamelen septines zich tot een ring en moeten ze zich herschikken om de zandloper- en dubbele ringstructuren te vormen die verband houden met knopopkomst en cytokinese, respectievelijk21. Hoewel er prachtig werk is gedaan met behulp van platina replica elektronenmicroscopie om septinearchitectuur te observeren in verschillende celcyclusstadia22, heeft het kijken naar septineassemblage in de loop van de tijd met behulp van lichtmicroscopie in gist een beperkte ruimtelijke resolutie ontmoet. Eerder werk aan septines met behulp van lipide monolagen gevisualiseerd door transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) was in staat om verschillende interessante septinestructuren zoals ringen, bundels en gaasjes te reconstitueren23. EM-technieken zijn echter ook beperkt in hun temporele resolutie, in tegenstelling tot fluorescentiemicroscopie. Om de kinetische parameters van het multischaalproces van septineassemblage beter op te lossen, wendden we ons tot ondersteunde membraan mimetica, waar men de membraangeometrie, monsteromstandigheden en beeldvormingsmodaliteit zorgvuldig kan regelen.

De hier beschreven protocollen maken gebruik van planaire of gebogen SLBs, gezuiverd eiwit en een combinatie van microscopietechnieken. Kwantitatieve fluorescentie confocale microscopie en totale interne reflectie fluorescentiemicroscopie (TIRFM) werden gebruikt om zowel bulkeiwitbinding op verschillende membraankrommingen te meten, als om de bindingskinetiek van afzonderlijke moleculen te meten. Bovendien is dit protocol aangepast om te worden gebruikt met scanning elektronenmicroscopie (SEM) om eiwit ultrastructuur op verschillende membraankrommingen te onderzoeken. Hoewel de focus van deze protocollen ligt op het septinecytoskelet, kunnen de protocollen eenvoudig worden aangepast om de krommingsgevoeligheid van elk eiwit te onderzoeken dat de lezer interessant vindt. Bovendien kunnen degenen die werkzaam zijn op gebieden zoals endocytose of vesiculaire handel deze technieken nuttig vinden voor het onderzoeken van de krommingsafhankelijke assemblages van multi-eiwitcomplexen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

OPMERKING: Het vormen van ondersteunde lipide bilayers vereist de bereiding van monodispersed kleine unilamellaire blaasjes (SUV's). Raadpleeg een eerder gepubliceerd protocol24 over SUV-formatie. Kortom, alle SUV's worden gevormd door sonde-sonicatie gedurende 12 minuten in totaal bij 70% amplitude via 4 minuten ultrasoonapparaatperioden gevolgd door 2 minuten rustperioden in ijswater. SUV-oplossingen moeten goed worden verduidelijkt en monodispersed in grootte. Grootteverdelingen van SUV's kunnen bijvoorbeeld worden gemeten door dynamische lichtverstrooiing25.

1. Vlakke lipide bilayers

  1. Plasmareiniging van de dia's
    OPMERKING: Plasmareiniging verwijdert organische verontreinigingen en verhoogt de hydrofielheid van het glas, wat zorgt voor een efficiënte lipidenadsorptie. De volgende stappen kunnen veranderen of moeten worden geoptimaliseerd, afhankelijk van de gebruikte plasmareiniger en glazen afdekplaten.
    1. Spoel de plasmareiniger gedurende 5 minuten met zuurstof om lucht uit de leidingen en kamer te verwijderen. Dit is om ervoor te zorgen dat, wanneer de plasmareiniger wordt uitgevoerd, er voornamelijk zuurstof in de lijnen en kamer is, waardoor meer consistente tweelaagse preparaten worden geboden.
    2. Laat tijdens het purgeren een inert gas, zoals N2 of Ar, over de micro-cover glasglijden stromen om stof en deeltjes te verwijderen.
      OPTIONEEL: Afdekglasglaasjes kunnen worden gewassen door elke kant te besproeien met 100% isopropanol gevolgd door water. Herhaal de isopropanol-waterwas 3x en droog dan met een N2-stroom .
    3. Schik droge glasglijbanen in een keramische wieg. Plaats de houder aan de achterkant van de plasmakamer, zodat de afdekplaten evenwijdig zijn aan de lange rand van de kamer (dit houdt ze op hun plaats tijdens plasmareiniging). Laat de plasmareiniger gedurende 15 minuten met zuurstof op maximaal vermogen draaien.
  2. Kamervoorbereiding
    OPMERKING: De hier beschreven methode maakt gebruik van zelfgemaakte kamers van plastic PCR-buizen om de reactievolumes te ondersteunen, maar andere materialen met een lage hechting, zoals siliconenputten, kunnen ook geschikt zijn.
    1. Knip met een scheermesje of schaar de dop af net onder het matte deel van een 0,2 ml PCR-buis (figuur 2).
    2. Verf de rand van de PCR-buis met UV-geactiveerde lijm en vermijd de binnenkant van de buis. Plaats de PCR-buislijm voorzichtig in het midden van een plasmagezuiverde coverslip.
      OPMERKING: Om lijm in de kamer te voorkomen, gebruikt u de minimale hoeveelheid lijm om een afdichting te krijgen en behandelt u onmiddellijk met UV zonder de kamer te stoten of te verstoren.
    3. Plaats de kamer gedurende 5-7 minuten onder UV-licht met lange golflengte om de lijm uit te harden.
  3. Bilayer formatie
    OPMERKING: Monodispersed SUV's moeten in deze stap worden gebruikt voor efficiënte bilayer-vorming. Tabel 1 geeft recepten voor alle buffers die in de dubbellaagse formatie worden gebruikt, inclusief voorraad- en eindbufferconcentraties.
    1. Voeg 40 μL ondersteunde lipide bilayer buffer (SLBB: 300 mM KCl, 20 mM HEPES, pH 7,4, 1 mM MgCl2; Tabel 1), 10 μL van 5 mM SUV's, en 1 μL van 100 mM CaCl2 naar de put. Schud de kamers voorzichtig van links naar rechts om de SUV's te verstoren en incubeer vervolgens bij 37 °C gedurende 20 minuten.
      OPMERKING: Om verdamping te beperken, incubeer in een afgedekte petrischaal met een nat doekje.
  4. Overtollige lipiden wegspoelen
    OPMERKING: Deze stap verwijdert overtollige SUV's en fungeert als een bufferuitwisselingsstap. Het is erg belangrijk om de dubbellaag met de pipetpunt niet te schrapen tijdens het wassen; als het glas wordt blootgesteld, zullen septines en vele andere eiwitten onomkeerbaar binden, waardoor de effectieve eiwitconcentratie afneemt.
    1. Spoel na incubatie de bilayer 6x af met 150 μL SLBB, pipetteer op en neer om elke keer te mengen terwijl bubbels worden vermeden.
      OPMERKING: Voeg 150 μL direct toe aan de 50 μL buffer en SUV's die al aanwezig zijn voor een totaal van 200 μL in de reactieput.
    2. Wanneer u klaar bent om te beginnen met broeden met de septines of een ander eiwit naar keuze, wast u de dubbellaag 6x met 150 μL reactiebuffer (RXN: 33,3 mM KCl, 50 mM HEPES, pH 7,4, 1,4 mg/ml BSA, 0,14% methylcellulose, 1 mM BME).
      OPMERKING: Voor het beste resultaat, maak de reactiebuffer vers en wees heel voorzichtig tijdens het goed mengen van de reactie om bubbels te voorkomen.
    3. Verwijder bij de laatste wasstap 125 μL reactiebuffer en laat 75 μL in de put achter. Voeg 25 μL septines verdund in septineopslagbuffer (SSB: 300 mM KCl, 50 mM HEPES, pH 7,4, 1 mM BME) toe in de gewenste concentratie en beeld door TIRF-microscopie26.
      OPMERKING: Wanneer u deze test voor de eerste keer opzet of een nieuwe lipidensamenstelling opneemt, is het een goede gewoonte om ervoor te zorgen dat lipiden vrijelijk op het oppervlak diffunderen met behulp van fluorescentieherstel na fotobleaching (FRAP). Hoewel de snelheid van herstel anders zal zijn voor verschillende lipidesamenstellingen en inherent lager dan voor vrijstaande systemen, mogen de lipiden niet onbeweeglijk zijn.

Ondersteunde Lipid Bilayer Buffer (SLBB)
VoorraadVolumeEindconcentratie
2 MKCl1,5 ml300m
1 M HEPES200 μL20m
500 mm mgcl2 20 μL1 mM
Water8 ml
Pre-reactiebuffer (PRB)
VoorraadVolumeEindconcentratie
2 MKCl166 μL33,3 mM
1 M HEPES500 μL50m
Water9,33 ml
Reactie buffer
VoorraadVolumeEindconcentratie
2 MKCl166 μL33,3 mM
1 M HEPES300 μL50m
10 mg/ml BSA1,39 ml1,39 mg/ml
1% Methylcellulose1,39 ml0.0014
WaterTot 10 ml
Bme0,7 μL1 mM
Septin Opslag Buffer (SSB)
VoorraadVolumeEindconcentratie
2 MKCl1,5 ml300m
1 M HEPES500 μL50m
WaterTot 10 ml
Bme0,7 μL1 mM

Tabel 1: Buffercomponenten voor de bereiding van ondersteunde lipide bilayer en reacties. Volumes van voorraadoplossingen die zijn opgenomen in buffers en de uiteindelijke concentraties van elk onderdeel worden weergegeven. SLB en PRB kunnen bij kamertemperatuur worden bewaard en tussen experimenten worden hergebruikt. Reactiebuffer en SSB worden voor elk experiment vers gemaakt.

2. Bolvormige ondersteunde lipide bilayers

OPMERKING: Dit protocol maakt gebruik van silicamicrosferen gesuspendeerd in ultrapuur water met een dichtheid van 10%. Voor elk werk aan de kinetische parameters van eiwitassemblage is het belangrijk om het totale membraanoppervlak tussen experimenten en krommingen strikt te controleren. Tabel 2 toont de gecorrigeerde volumes kralen en buffer om 5 mm2 van het totale membraanoppervlak te behouden. Dit protocol borduurt voort op een eerder gepubliceerde methode 8,18.

  1. Bilayer formatie
    OPMERKING: Wat betreft planaire bilayers, is het belangrijk om hoogwaardige SUV's te hebben voor robuuste bilayer-vorming. Tabel 2 geeft een overzicht van het volume kralen uit een oplossing met een dichtheid van 10% en hun respectieve SLBB-volumes die worden gebruikt om een eindoppervlak van 5 mm2 te verkrijgen voor een reeks kraaldiameters.
    1. Silica-microsferen (ook wel kralen genoemd) hebben de neiging om te bezinken en samen te klonteren; om de kralen te mengen en eventuele clusters te breken, vortex de fles gedurende 15 s, vervolgens bad-soniceren gedurende 1 minuut, en vortex opnieuw voor 15 s.
    2. Meng het juiste volume kralen (tabel 2) met het overeenkomstige volume SLBB en 10 μL 5 mM SUV's in een microcentrifugebuis met lage adhesie van 0,5 ml.
    3. Schommel het kraal-lipidenmengsel end-over-end gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Zorg ervoor dat deze incubatie op een rotator wordt uitgevoerd om sedimentatie te voorkomen.
  2. Bereid kamers voor op PEGylated coverslips
    OPMERKING: Wat betreft planaire bilayers, zelfgemaakte kamers van plastic PCR-buizen worden gebruikt om de reactievolumes te ondersteunen, maar andere materialen met een lage hechting, zoals siliconenputten, kunnen net zo goed werken.
    1. Terwijl de kralen schommelen, ontdooi je een PEGylated coverslip bij kamertemperatuur. Knip een PCR-buis van 0,2 ml en lijm deze op de afdekplaat zoals beschreven in stap 1.2. Voor 24 mm x 50 mm dia's passen tot 10 kamers op één glijbaan.
      OPMERKING: Dit protocol maakt gebruik van 24 mm x 50 mm PEGylated glazen coverslips die van tevoren zijn voorbereid. Kortom, glazen coverslips worden grondig gereinigd door ultrasoonapparaat in aceton, methanol en 3 M KOH. Coverslips worden vervolgens gefunctionaliseerd met n-2-aminoethyl-3-aminopropyltrimethoxysilaan en covalent gekoppeld aan mPEG-succinimidylvalraat. Afgewerkte PEGylated coverslips worden vacuüm verzegeld bewaard bij −80 °C. Voor een soortgelijk passiveringsprotocol, zie het werk van Gidi et al.27. Hoewel PEGylated glazen coverslips hier worden voorgesteld, kunnen andere passiveringsmiddelen, zoals BSA of poly-L-lysinemethoden, effectief zijn.
  3. Overtollige lipiden wegspoelen
    OPMERKING: Deze stap werkt om overtollige SUV's te verwijderen en een bufferuitwisseling uit te voeren. Kralen worden in totaal 4x gewassen met pre-reactiebuffer (PRB: 33,3 mM KCl, 50 mM HEPES, pH 7,4). Tabel 3 geeft een overzicht van de spinsnelheden in RCF voor een reeks kraaldiameters.
    1. Spin kralen op de aangewezen RCF gedurende 30 s (tabel 3). Als u meerdere kraalmaten gebruikt, laat kralen dan schommelen totdat het hun tijd is om te worden gewassen.
      OPMERKING: Het is niet de moeite waard om grotere kralen in dezelfde spin te bezinken als kleinere kralen met de kleinere bedelbezinkingssnelheid om tijd te besparen. Dit kan ervoor zorgen dat kralen aan elkaar blijven plakken en de integriteit van de bilayer in gevaar brengen.
    2. Verwijder na de eerste spin 50 μL supernatant en voeg 200 μL PRB toe. Verwijder na de tweede en derde draai 200 μL en voeg 200 μL PRB toe. Verwijder na de vierde spin 200 μL en voeg 220 μL PRB toe. Pipetteer krachtig voor elke wasbeurt.
      LET OP: Het uiteindelijke resuspensievolume is anders dan de wasbeurten. Vortex de kralen niet na incubatie met de lipiden, omdat dit gaten in de bilayers kan achterlaten. Om sedimentatie te voorkomen tijdens het werken met de andere kraalgroottes of het opzetten van andere delen van de test, plaatst u de kraalmengsels terug op de end-over-end rotator.
  4. Voorbereiding van de reactie
    OPMERKING: Deze reactie is ontworpen om het totale membraanoppervlak van de reactie op 5 mm2 te houden en een eindreactietoestand van 100 mM KCl, 50 mM HEPES, 1 mg/ml BSA, 0,1% methylcellulose en 1 mM BME te produceren.
    1. Als u een wedstrijdtest doet met meerdere kraalgroottes, maak dan een 1: 1 mengsel door gelijke volumes van elke kraalgrootte samen te mengen. Meng vervolgens 29 μL van het gewenste kraalmengsel (of van een enkele kraal) met 721 μL RXN-buffer.
      OPMERKING: Het is belangrijk om de kralen bij elke stap grondig te mengen met een pipet om dichte clusters van kralen te voorkomen; dit zal resulteren in een gelijkmatigere kraalverdeling en een nauwkeurig totaal oppervlak.
    2. Meng 75 μL verdunde kralen en 25 μL eiwit verdund in SSB naar de putjes.
      OPMERKING: De auteurs beeldten meestal gist septinecomplexen af op 1-50 nM.
    3. Als septines in een steady-state worden gemeten, incubeer dan gedurende 1 uur bij kamertemperatuur en beeld vervolgens af met bijna-TIRF of confocale microscopie.
Kraal Diameter (μm)Volume goed gemengde kralen (μL)Volume SLB-buffer (μL)Volume SUV's (μL)
6.468.9461.110
5.0676310
3.174.3965.610
0.961.3368.710
0.540.7569.310
0.310.4369.610

Tabel 2: Genormaliseerde volumes van microsferen. Om een gelijk oppervlak van elke kraalgrootte te behouden en om het totale membraanoppervlak consistent te houden tussen experimenten, werden volumes voor elke kraalgrootte en buffer berekend die de totale oppervlakte normaliseerde.

Kraal diameter (μm)Sedimentatiesnelheid (RCF)
0.314.5
0.544.5
0.962.3
3.170.8
5.060.3

Tabel 3: Sedimentatiesnelheden voor microsferen met verschillende diameters. Voor elke kraaldiameter werden de getoonde minimale sedimentatiesnelheden gebruikt om de kralen te pelleteren voor het wegspoelen van ongebonden liposomen.

3. Staaf ondersteunde lipide bilayers

OPMERKING: In tegenstelling tot de andere hier gepresenteerde assays, laat de staaftest geen zorgvuldige controle van het totale membraanoppervlak toe. Men kan consistent zijn in hoeveelheden en volumes tussen experimenten, maar omdat dit resulteert in staven van verschillende lengtes en diameters, is het moeilijk om het totale membraanoppervlak in de reactie te extrapoleren. Hoewel dit dus een uitstekende test is voor het onderzoeken van krommingsdetectie met meerdere krommingen op een enkel oppervlak en nuttig is geweest voor het verkennen van septine-ultrastructuur, wordt het niet aanbevolen voor kinetische metingen. Deze methode werd eerder gemeld18 en wordt hier uitgebreid.

  1. Borosilicaatstaven verkrijgen uit glazen microvezelfilters
    1. Scheur een enkel GF/C-glasmicrovezelfilter van 42,5 mm-kwaliteit in kleine stukjes en plaats ze in een bekerglas van 100 ml met 60 ml 100% ethanol. Bad-sonicate totdat de oplossing ondoorzichtig wordt; dit kan slechts 20-30 minuten duren met een fijn versnipperd filter.
      OPMERKING: Soniceer grondig om grote brokken op te breken; hoe meer gedissocieerd/ondoorzichtig, hoe beter.
    2. Bedek de oplossing met folie en bewaar de oplossing 's nachts bij kamertemperatuur.
  2. Het vormen van dubbellagen op de staven
    OPMERKING: Deze stap wordt uitgevoerd met overtollige lipiden om volledige staafdekking te bereiken, omdat het onmogelijk is om het totale oppervlak in deze methode te kwantificeren.
    1. De volgende dag wordt de ethanoloplossing bezinkt (stap 3.1.2.), dus meng het goed voor gebruik. Combineer 10 μL staafoplossing en 70 μL SLBB.
    2. Draai op topsnelheid in een minicentrifuge gedurende 30 s en verwijder 50 μL van het supernatant. Resuspenseer in nog eens 50 μL SLBB en herhaal de spin voor een totaal van vier wasbeurten om de ethanol te verdunnen.
      OPMERKING: Staafsteunen vormen geen vaste pellet aan de onderkant van de buis. Ze worden in plaats daarvan langs de zijkant van de buis gesmeerd; dit maakt ze moeilijk om volledig te bewaren tijdens het wassen. Aangezien de totale oppervlakte in deze test niet wordt gecontroleerd, is het prima als ze worden verstoord.
    3. Combineer 10 μL goed gemengde staafoplossing met 50 μL 5 mM SUV's en 20 μL SLBB. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur en draai end-over-end zoals bij het vormen van dubbellagen op de microsferen.
  3. Overtollige lipiden wegspoelen
    1. Net als bij stap 3.2.2, draait u de lipidenstaafoplossing op topsnelheid in een minicentrifuge gedurende 30 s om de met membraan gecoate staven uit de oplossing te pelleteren.
    2. Verwijder na de eerste spin 50 μL van het supernatant en voeg 200 μL PRB toe. Verwijder na de tweede en derde draai 200 μL en voeg 200 μL PRB toe. Verwijder na de vierde spin 200 μL, voeg 220 μL PRB toe en pipetteer krachtig om te mengen.
  4. Voorbereiding van de reactie
    1. Meng in een microcentrifugebuis van 1,5 ml 721 μL reactiebuffer met 29 μL staafoplossing. Meng goed.
    2. Combineer in een PCR-buis van 0,2 ml 75 μL staafjes in reactiebuffer en 25 μL septines in de gewenste concentratie, verdund in SSB. Laat het minstens 1 uur bij kamertemperatuur incuberen.
  5. Voorbereiding op scanning elektronenmicroscopie
    1. Voeg na incubatie het 100 μL septine-staafmengsel toe aan een ronde, PEG-gecoate 12 mm afdeklip en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur in een gesloten petrischaal.
    2. Bevestig het monster door de bodem van de petrischaal (10 ml zou voldoende moeten zijn) gedurende 30 minuten te vullen met 2,5% glutaaraldehyde in 0,05 M natriumcacodylaat (NaCo), pH 7,4. Adem de vloeistof op met een glazen pipet. Was het monster door het gedurende 5 minuten te incuberen met 10 ml 0,05 M NaCo en herhaal dit gedurende in totaal twee wasbeurten.
    3. Postfix in 0,5% OsO4 cacodylaatbuffer gedurende 30 min, en was vervolgens 3x in 0,05 M NaCo (5 min/wash).
    4. Incubeer het monster met 1% looizuur gedurende 15 minuten en was het vervolgens 3x in NaCo. Incubeer gedurende 15 min in 0,5% OsO4 en was 3x met NaCo.
    5. Droog de monsters uit met behulp van toenemende ethanolconcentraties: 30% EtOH gedurende 5 minuten, 2x; 50% EtOH gedurende 5 min; 75% EtOH gedurende 5 min; en 100% EtOH gedurende 5 min, 2x. Volg met nog een incubatie van 10 minuten.
    6. Incubeer in overgangsvloeistof (hexamethyldisilazane) 3x (5 min, 10 min, dan 5 min).
    7. Laat aan de lucht drogen en plaats de monsters vervolgens in een exsiccator tot een sputtercoating. Sputter-coat de 4 nm laag met een goud/palladium legering en vervolgens beeld op een scanning elektronenmicroscoop.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Na de bereiding van elke SLB kunnen septines of het eiwit van belang worden geïncubeerd met de gewenste ondersteuning en in beeld worden gebracht via TIRFM, confocale microscopie of SEM. De hier getoonde resultaten gebruiken septines die recombinant tot expressie zijn gebracht en gezuiverd van E. coli17. Met behulp van TIRFM op vlakke SLB's is het mogelijk om de lengte van filamenten en hun flexibiliteit te bepalen, de diffusiecoëfficiënten te meten en de assemblage in de loop van de tijd...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Celmembranen nemen veel verschillende vormen, krommingen en fysisch-chemische eigenschappen aan. Om de machinerie op nanometerschaal te bestuderen waarmee cellen assemblages op micrometerschaal bouwen, is het noodzakelijk om minimale reconstitutiesystemen van membraanmi mimetica te ontwerpen. Dit protocol presenteert technieken die zowel de membraankromming als de samenstelling nauwkeurig regelen, terwijl de gebruiker eenvoudig kwantitatieve fluorescentiemetingen kan uitvoeren met behulp van algemeen beschikbare microsco...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) Grant no. R01 GM-130934 en National Science Foundation (NSF) Grant MCB- 2016022. B.N.C, E.J.D.V. en K.S.C. werden gedeeltelijk ondersteund door een subsidie van het National Institute of General Medical Sciences in het kader van de toekenning T32 GM119999.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.2 mL PCR Tubes with flat cap, NaturalWatson137-211C(EX)
0.5 mL low adhesion tubesUSA Scientific1405-2600
Beta mercaptoethanol (BME)Sigma-AldrichM6250-100ML
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-AldrichA4612-25G
Coverglass voor het maken van PEGylated coverslipsThermo Scientific152450Richard-Allan Scientific SLIP-RITE Cover Glass 24x50 #1.5
DOPCAvanti Polar Lipids850375
Egg Liss Rhodamine PEAvanti Polar Lipids810146
EMS Glutaraldehyde Aqueous 25%, EM GradeVWR16220
EMS Sodium Cacodylate BufferVWR11652
Ethanol, 200 proofFisher Scientific04-355-223EA
HEPESSigma AldrichH3375-1KG
HexamethyldisilazaneSigma-Aldrich440191
Magnesium chlorideVWR7791-18-6
Methyl cellulose 4000cpSigma-AldrichM052-100G
Microglass coverslips voor planaire bilayersMatsunamiDiscontinued22x22
Mini centrifuge
Non-Functionalized Silica MicrospheresBangs Laboratories, Inc.Afhankelijk van de grootte: SS0200*-SS0500*Silica in waterige suspensie
Optical AdhesiveNorland ThorlabsNOA 68Flexibele kleefstof voor glas of kunststof
Osmium tetroxideMillipore Sigma20816-12-0
ParafilmVWR52858-000
Plasma CleanerPlasma EtchPE-25Voltage: 120V, 60Hz. Stroom: 15 AMPS
Potassium chlorideVWR0395-1kg
Round coverglass, #1.5 12mm  VWR64-0712
Sonicator bathBranson1510R-MTBransonic Ultrasoonreiniger. 50-60 Hz. Output: 70W
Soy PIAvanti Polar Lipids840044
Tabletop centrifugeEppendorf22331
UV LampSpectrolineENF-260C115 Volts, 60 Hz, 0.20 AMPS
WhatmanGlass Microfiber Filter PaperVWR28455-03042,5 mm diameter, Grade GF/C

Referenties

  1. Zimmerberg, J., Kozlov, M. M. How proteins produce cellular membrane curvature. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (1), 9-19 (2006).
  2. Parthasarathy, R., Groves, J. T. Curvature and spatial organization in biological membranes. Soft Matter. 3 (1), 24-33 (2007).
  3. Mao, Y., Baum, B. Tug of war-The influence of opposing physical forces on epithelial cell morphology. Developmental Biology. 401 (1), 92-102 (2015).
  4. Ranganathan, R., Alshammri, I., Peric, M. Lipid organization in mixed lipid membranes driven by intrinsic curvature difference. Biophysical Journal. 118 (8), 1830-1837 (2020).
  5. Bigay, J., Casella, J. -F., Drin, G., Mesmin, B., Antonny, B. ArfGAP1 responds to membrane curvature through the folding of a lipid packing sensor motif. The EMBO Journal. 24 (13), 2244-2253 (2005).
  6. Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton. Journal of Cell Biology. 213 (1), 5-6 (2016).
  7. Picard, F., Paquet, M. -J., Dufourc, ÉJ., Auger, M. Measurement of the lateral diffusion of dipalmitoylphosphatidylcholine adsorbed on silica beads in the absence and presence of melittin: A 31P two-dimensional exchange solid-state NMR study. Biophysical Journal. 74 (2), 857-868 (1998).
  8. Fu, R., et al. Spherical nanoparticle supported lipid bilayers for the structural study of membrane geometry-sensitive molecules. Journal of the American Chemical Society. 137 (44), 14031-14034 (2015).
  9. Vanni, S., Hirose, H., Barelli, H., Antonny, B., Gautier, R. A sub-nanometre view of how membrane curvature and composition modulate lipid packing and protein recruitment. Nature Communications. 5 (1), 4916(2014).
  10. Gill, R. L., et al. Structural basis for the geometry-driven localization of a small protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (15), 1908-1915 (2015).
  11. Pan, J., Dalzini, A., Song, L. Cholesterol and phosphatidylethanolamine lipids exert opposite effects on membrane modulations caused by the M2 amphipathic helix. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1861 (1), 201-209 (2019).
  12. Beckers, D., Urbancic, D., Sezgin, E. Impact of nanoscale hindrances on the relationship between lipid packing and diffusion in model membranes. The Journal of Physical Chemistry B. 124 (8), 1487-1494 (2020).
  13. Lee, A. A., et al. Stochasticity and positive feedback enable enzyme kinetics at the membrane to sense reaction size. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (47), 2103626118(2021).
  14. Ferhan, A. R., et al. Nanoplasmonic sensing architectures for decoding membrane curvature-dependent biomacromolecular interactions. Analytical Chemistry. 90 (12), 7458-7466 (2018).
  15. Beber, A., et al. Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments. Nature Communications. 10 (1), 420(2019).
  16. Lou, H. -Y., et al. Membrane curvature underlies actin reorganization in response to nanoscale surface topography. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (46), 23143-23151 (2019).
  17. Bridges, A. A., et al. Septin assemblies form by diffusion-driven annealing on membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (6), 2146-2151 (2014).
  18. Cannon, K. S., Woods, B. L., Crutchley, J. M., Gladfelter, A. S. An amphipathic helix enables septins to sense micrometer-scale membrane curvature. Journal of Cell Biology. 218 (4), 1128-1137 (2019).
  19. Johnson, J. M., Ha, T., Chu, S., Boxer, S. G. Early steps of supported bilayer formation probed by single vesicle fluorescence assays. Biophysical Journal. 83 (6), 3371-3379 (2002).
  20. Lobato-Márquez, D., et al. Mechanistic insight into bacterial entrapment by septin cage reconstitution. Nature Communications. 12 (1), 4511(2021).
  21. Gladfelter, A. S., Pringle, J. R., Lew, D. J. The septin cortex at the yeast mother-bud neck. Current Opinion in Microbiology. 4 (6), 681-689 (2001).
  22. Ong, K., Wloka, C., Okada, S., Svitkina, T., Bi, E. Architecture and dynamic remodelling of the septin cytoskeleton during the cell cycle. Nature Communications. 5, 1-10 (2014).
  23. Bertin, A., et al. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate promotes budding yeast septin filament assembly and organization. Journal of Molecular Biology. 404 (4), 711-731 (2010).
  24. Bridges, A. A., Gladfelter, A. S. In vitro reconstitution of septin assemblies on supported lipid bilayers. Methods in Cell Biology. 136, 57-71 (2016).
  25. Hupfeld, S., Holsæter, A. M., Skar, M., Frantzen, C. B., Brandl, M. Liposome size analysis by dynamic/static light scattering upon size exclusion-/field flow-fractionation. Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 6 (9), 3025-3031 (2006).
  26. Johnson, D. S., Jaiswal, J. K., Simon, S. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy illuminator for improved imaging of cell surface events. Current Protocols in Cytometry. (1), Chapter 12, Unit 12.29(2012).
  27. Gidi, Y., Bayram, S., Ablenas, C. J., Blum, A. S., Cosa, G. Efficient one-step PEG-silane passivation of glass surfaces for single-molecule fluorescence studies. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (46), 39505-39511 (2018).
  28. Woods, B. L., et al. Biophysical properties governing septin assembly. bioRxiv. , (2021).
  29. Cannon, K. S., et al. A gene duplication of a septin provides a developmentally-regulated filament length control mechanism. bioRxiv. , (2021).
  30. Pincet, F., et al. FRAP to characterize molecular diffusion and interaction in various membrane environments. PLOS One. 11 (7), 0158457(2016).
  31. Reimhult, E., Höök, F., Kasemo, B. Intact vesicle adsorption and supported biomembrane formation from vesicles in solution: Influence of surface chemistry, vesicle size, temperature, and osmotic pressure. Langmuir. 19 (5), 1681-1691 (2003).
  32. Cha, T., Guo, A., Zhu, X. -Y. Formation of supported phospholipid bilayers on molecular surfaces: Role of surface charge density and electrostatic interaction. Biophysical Journal. 90 (4), 1270-1274 (2006).
  33. Andrews, J. T., et al. Formation of supported lipid bilayers (SLBs) from buffers containing low concentrations of group I chloride salts. Langmuir. 37 (44), 12819-12833 (2021).
  34. Gurtovenko, A. A., Vattulainen, I. Effect of NaCl and KCl on phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine lipid membranes: Insight from atomic-scale simulations for understanding salt-induced effects in the plasma membrane. The Journal of Physical Chemistry B. 112 (7), 1953-1962 (2008).
  35. Danuser, G., Waterman-Storer, C. M. Quantitative fluorescent speckle microscopy of cytoskeleton dynamics. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 35 (1), 361-387 (2006).
  36. Chan, Y. -H. M., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Membraanreconstitutieondersteunde lipide dubbellageneiwit membraaninteractievorming van septinefilamentenkrommingsdetectieTIRF microscopieconfocale microscopieliposoompreparatie
Reconstitutie van septineassemblage bij membranen om biofysische eigenschappen en functies te bestuderen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.