Methodenartikel

Whole-Brain Single-Cell Imaging en Analyse van Intacte Neonatale Muizenhersenen Met behulp van MRI, Tissue Clearing en Light-Sheet Microscopie

3.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/64096

⸱

1 augustus 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1UNC Neuroscience Center, University of North Carolina, Chapel Hill, 2Department of Genetics, University of North Carolina, Chapel Hill, 3Department of Psychiatry, University of North Carolina, Chapel Hill, 4Center for Animal Magnetic Resonance Imaging, The University of North Carolina at Chapel Hill, 5Biomedical Research Imaging Center, The University of North Carolina at Chapel Hill, 6Department of Neurology, The University of North Carolina at Chapel Hill, 7Department of Computer Science, The University of North Carolina at Greensboro

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft methoden voor het uitvoeren van magnetische resonantie beeldvorming, clearing en immunolabeling van intacte muizenhersenen met behulp van iDISCO +, gevolgd door een gedetailleerde beschrijving van beeldvorming met behulp van light-sheet microscopie en downstream analyses met behulp van NuMorph.

Samenvatting

Weefselopruiming gevolgd door light-sheet microscopie (LSFM) maakt beeldvorming met cellulaire resolutie van intacte hersenstructuur mogelijk, waardoor kwantitatieve analyse van structurele veranderingen veroorzaakt door genetische of omgevingsverstoringen mogelijk is. Beeldvorming van de hele hersenen resulteert in een nauwkeurigere kwantificering van cellen en de studie van regiospecifieke verschillen die kunnen worden gemist met veelgebruikte microscopie van fysiek gesneden weefsel. Het gebruik van light-sheet microscopie om gewiste hersenen in beeld te brengen, verhoogt de acquisitiesnelheid aanzienlijk in vergelijking met confocale microscopie. Hoewel deze beelden zeer grote hoeveelheden structurele hersengegevens produceren, zijn de meeste computationele hulpmiddelen die functiekwantificering uitvoeren in afbeeldingen van gewist weefsel beperkt tot het tellen van schaarse celpopulaties, in plaats van alle kernen.

Hier demonstreren we NuMorph (Nuclear-Based Morphometry), een groep analysetools, om alle kernen en nucleaire markers te kwantificeren binnen geannoteerde gebieden van een postnatale dag 4 (P4) muizenhersen na clearing en beeldvorming op een light-sheet microscoop. We beschrijven magnetische resonantie beeldvorming (MRI) om het hersenvolume te meten voorafgaand aan krimp veroorzaakt door uitdrogingsstappen van weefsel, weefsel opruimen met behulp van de iDISCO + -methode, inclusief immunolabeling, gevolgd door light-sheet microscopie met behulp van een commercieel beschikbaar platform om muizenhersenen met cellulaire resolutie in beeld te brengen. Vervolgens demonstreren we deze pijplijn voor beeldanalyse met Behulp van NuMorph, dat wordt gebruikt om intensiteitsverschillen te corrigeren, beeldtegels te naaien, meerdere kanalen uit te lijnen, kernen te tellen en hersengebieden te annoteren door registratie op openbaar beschikbare atlassen.

We hebben deze aanpak ontworpen met behulp van openbaar beschikbare protocollen en software, waardoor elke onderzoeker met de nodige microscoop en computationele middelen deze technieken kan uitvoeren. Deze weefselopruimings-, beeldvormings- en computationele hulpmiddelen maken het mogelijk om de driedimensionale (3D) organisatie van celtypen in de cortex te meten en kwantificeren en zouden op grote schaal toepasbaar moeten zijn op elk wild-type / knock-out muisstudieontwerp.

Inleiding

Beeldvorming van de hele hersenen met eencellige resolutie is een belangrijke uitdaging in de neurowetenschappen. Hersenbeelden met cellulaire resolutie maken gedetailleerde analyse en het in kaart brengen op systeemniveau van hersencircuits mogelijk en hoe die circuits worden verstoord door genetische of omgevingsrisicofactoren voor neuropsychiatrische aandoeningen, cellulair gedrag bij het ontwikkelen van embryo's, evenals neurale circuits in de volwassen hersenen 1,2,3. Er zijn meerdere histologische methoden die beelden met hoge resolutie van het gereconstrueerde 3D-brein mogelijk maken; deze technieken vereisen echter dure, gespecialiseerde apparatuur, zijn mogelijk niet compatibel met immunolabeling en de tweedimensionale (2D) aard van sommige methoden kan leiden tot weefselbeschadiging en afschuiving tijdens sectie 4,5.

Recente ontwikkelingen hebben een alternatieve benadering geboden voor het in beeld brengen van hele hersenen waarvoor geen weefselsectie nodig is; ze omvatten het gebruik van weefselzuivering om hersenen transparant te maken. Transparantie wordt bereikt in de meeste weefselzuiveringsmethoden door zowel lipiden te verwijderen, omdat ze een belangrijke bron van lichtverstrooiing zijn, als door de brekingsindex (RI) van het object af te stemmen op de RI van de monsterdompelingsoplossing tijdens beeldvorming. Licht kan dan de grens tussen materialen passeren zonder 6,7,8,9 te worden verstrooid.

Weefselzuiveringsmethoden, zoals iDISCO+, worden vaak gecombineerd met snelle 3D-beeldvorming met behulp van single-photon excitatiemicroscopie, zoals LSFM 6,7,10. In transparante weefsels gelabeld met een fluorofoor, licht-sheet fluorescentie microscopie beelden secties door excitatie met een dun lichtvlak11. Het belangrijkste voordeel van LSFM is dat een enkele optische sectie tegelijkertijd wordt verlicht, waarbij alle fluorescentie van de moleculen in die sectie wordt geëxciteerd, wat fotobleaching minimaliseert. Bovendien maakt het in beeld brengen van een volledig optisch segment cameragebaseerde detectie van dat opgewonden segment mogelijk, waardoor de snelheid toeneemt ten opzichte van puntscanning12. LSFM produceert niet-destructief goed geregistreerde optische secties die geschikt zijn voor 3D-reconstructie.

Hoewel de iDISCO + -methode goedkope weefselzuivering binnen ~ 3 weken mogelijk maakt, kunnen uitdrogingsstappen binnen het protocol leiden tot weefselkrimp en mogelijke verandering van de morfologie van het monster, waardoor volumetrische metingen worden beïnvloed 6,10. Het toevoegen van een secundaire beeldvormingsmethode, zoals MRI, die voorafgaand aan de weefselopruimingsprocedure moet worden gebruikt, kan de mate van door weefselzuivering geïnduceerde krimp over het monster meten. Tijdens de dehydratiestappen kunnen verschillen in mechanische eigenschappen tussen grijze en witte stof leiden tot niet-uniforme hersenmaterievervormingen, wat resulteert in ongelijksoortige weefselzuivering-geïnduceerde volumevervormingen tussen wildtype en mutante monsters en kan interpretaties van volumetrische verschillen in deze monsters verstoren10,13 . MRI wordt uitgevoerd door het dier eerst te perfuseren met een contrastmiddel (bijv. gadolinium), gevolgd door het geëxtraheerde weefsel van belang in een onderdompelingsoplossing (bijv. fomblin) te incuberen voordat beeldvormingplaatsvindt 14. MRI is compatibel met het opruimen van weefsel en het uitvoeren van LSFM op hetzelfde monster.

LSFM wordt vaak gebruikt om grootschalige microscopiebeelden te maken voor kwalitatieve visualisatie van het hersenweefsel van belang in plaats van kwantitatieve evaluatie van de hersenstructuur (figuur 1). Zonder kwantitatieve evaluatie is het moeilijk om structurele verschillen aan te tonen die het gevolg zijn van genetische of milieubeledigingen. Naarmate weefselzuiverings- en beeldvormingstechnologieën verbeteren, samen met lagere kosten van opslag en rekenkracht, wordt het kwantificeren van celtypelokalisaties in het weefsel van belang toegankelijker, waardoor meer onderzoekers deze gegevens in hun studies kunnen opnemen.

Met meer dan 100 miljoen cellen in het muizenbrein15 en beeldvormingssessies voor de hele hersenen die terabytes aan gegevens kunnen genereren, is er een toegenomen vraag naar geavanceerde beeldanalysetools die nauwkeurige kwantificering van functies in de afbeeldingen, zoals cellen, mogelijk maken. Er bestaan een groot aantal segmentatiemethoden voor weefselgeklaarde afbeeldingen die drempels toepassen voor nucleaire kleuringsintensiteit en filterobjecten met vooraf gedefinieerde vormen, maten of dichtheden 10,16,17,18. Onnauwkeurige interpretaties van resultaten kunnen echter het gevolg zijn van variaties in parameters zoals celgrootte, beeldcontrast en labelintensiteit. Dit artikel beschrijft ons gevestigde protocol om celkernen in het muizenbrein te kwantificeren. Eerst beschrijven we stappen voor weefselverzameling van de P4-muizenhersenen, gevolgd door een weefselzuiverings- en immunolabelingprotocol dat is geoptimaliseerd met de openbaar beschikbare iDISCO + -methode10. Ten tweede beschrijven we beeldacquisitie met behulp van MRI en lichtbladmicroscopie, inclusief de parameters die worden gebruikt voor het vastleggen van beelden. Ten slotte beschrijven en demonstreren we NuMorph19, een reeks beeldanalysetools die onze groep heeft ontwikkeld en die celtypespecifieke kwantificering mogelijk maakt na weefselzuivering, immunolabeling met nucleaire markers en light-sheet beeldvorming van geannoteerde regio's.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle muizen werden gebruikt in overeenstemming met en goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) aan de Universiteit van North Carolina in Chapel Hill.

1. Muisdissectie en perfusie

OPMERKING: De volgende dissecties werden uitgevoerd op P4- en P14-muizen met behulp van een spuit. Het volume perfusievloeistof zal variëren afhankelijk van de leeftijd van het dier.

  1. Perfusie
    LET OP: Paraformaldehyde (PFA) is een gevaarlijke chemische stof. Voer alle perfusiestappen uit in een chemische zuurkast.
    1. Dien voorafgaand aan de operatie pentobarbital toe via intraperitoneale injectie (100 mg/kg) en laat de verdoving inwerken.
    2. Zodra het dier een chirurgisch niveau van anesthesie heeft bereikt, gebruikt u de teenknijpende responsmethode om de niet-responsiviteit te bevestigen.
    3. Maak een laterale incisie onder de ribbenkast om de thoracale holte van het dier bloot te leggen.
    4. Snijd met behulp van een gebogen, chirurgische schaar voorzichtig door de ribbenkast tot aan het sleutelbeen aan de ene kant van het dier en maak een identieke snede aan de andere kant, waardoor het borstbeen kan worden weggetild, waardoor het hart wordt blootgesteld.
    5. Zonder de dalende aorta te beschadigen, snijdt u zorgvuldig elk weefsel dat verbonden is met het hart voordat u een kleine incisie maakt in het rechteratrium om bloed uit de vasculatuur te laten stromen.
    6. Gebruik een op spuit gebaseerde methode om de muis door de linkerkamer te laten perfuseren met 10 ml en 7 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) voor respectievelijk P14 en P4, met een perfusiesnelheid van 1,5 ml / min door het systeem.
    7. Zodra het bloed is geklaard, perfuseer opnieuw met 10 ml PBS + 4% PFA en 7 ml PBS + 4% PFA voor respectievelijk P14 en P4 bij 4 °C met een perfusiesnelheid van 1,5 ml / min om het dier te fixeren.
      OPMERKING: Fixatietremoren zullen worden waargenomen en het dier zal stijf zijn na voltooiing. Als u MRI op monsters gebruikt, perfuseer dan met vergelijkbare volumes PBS en PFA voor elk tijdstip + 20% op gadolinium gebaseerd MRI-contrastmiddel in de PFA-oplossing.
    8. Verwijder de kop met een chirurgische schaar en drop-fix met PBS + 4% PFA gedurende 24 uur bij 4 °C voor volledige fixatie.
      OPMERKING: In dit stadium blijven de hersenen intact met de schedel aan (zie rubriek 2). Pauzepunt: hersenen kunnen in dit stadium enkele maanden worden bewaard in PBS + 0,1% natriumazide bij 4 °C.

2. MR-gebaseerde bruto hersenstructuur beeldvorming met intacte schedel en analyse

OPMERKING: De hersenen moeten worden doordrenkt en geïncubeerd in gadolinium zoals hierboven beschreven zonder uit de schedel te worden verwijderd. Alle MRI vindt plaats vóór verwijdering van de hersenen uit de schedel om onbedoeld weefselverlies tijdens dissectie te voorkomen. Beeldvorming met een intacte schedel biedt ook ondersteuning aan de hersenen in de monsterhouder (d.w.z. spuit) tijdens de voorbereiding en beeldvorming van het monster.

  1. Monstervoorbereiding
    OPMERKING: De volgende stappen zijn geoptimaliseerd voor hersenmonsters van P4- en P14-muizen. De benodigde spuitgrootte is afhankelijk van de fysieke grootte van het monster.
    1. Als u MRI op het monster uitvoert, verwijdert u de huid van de schedel en incubeert u in PBS + 3% gadolinium gedurende 23 dagen bij 4 °C vóór beeldvorming14. Spoel de monsters na 23 dagen snel in PBS.
    2. Gebruik spuiten van 5 ml om een monsterhouder voor MRI te maken, gebruik spuitzuigers om elk uiteinde van de houder gemaakt met de spuit20 te sluiten. Gebruik plastic stukjes om de schedel stevig op zijn plaats in de houder te houden (figuur 2A). Verwijder de markeringen op de spuit met ethanol om artefacten bij beeldvorming te voorkomen.
    3. Plaats de schedel veilig in de monsterhouder en vul deze met een dompeloplossing die compatibel is met MRI (zie de tabel met materialen). Sluit de houder en verwijder alle luchtbellen met een spuit.
      OPMERKING: Pauzepunt: De schedel kan enkele maanden in de onderdompelingsoplossing worden bewaard voordat de beeldvorming plaatsvindt.
  2. Beeldvorming van de bruto hersenstructuur (MRI)
    1. Breng de monsters in beeld met een 9,4T/30 cm horizontaal, dierlijk MRI-systeem met behulp van een 15 mm volumespoel en een op spin-echo gebaseerde sequentie met de volgende parameters: Ruimtelijke resolutie: 60 μm x 60 μm x 60 μm; totale scantijd: 7 h 12 min; echotijd (TE): 6,83 ms; herhalingstijd (TR): 40 ms; excitatie / herfocussing flip hoeken: 90/180 graden; beeldgrootte: 166 x 168 x 209 voxels; Gezichtsveld (FOV): 9,9 mm x 10,1 mm x 12,4 mm; bandbreedte: 100.000 kHz.
  3. Computationele bruto hersenstructuur analyse
    1. Verwijder de omliggende schedel uit onbewerkte MRI-beelden door het muizenbrein handmatig te traceren met behulp van segmentatiesoftware. Pas vervolgens de voxel-gewijze vermenigvuldigingsoperatie toe tussen het maskerbeeld en de onbewerkte MRI-afbeelding om het MRI-beeld van de schedel gestripte hersenen te genereren.
      OPMERKING: De uitvoer is een binair maskerbeeld waarbij de intensiteit voor hersenvxels anders is ingesteld op 1 en 0.
    2. Pas rigide beeldregistratie toe (alleen vertaling en rotatie schatten) met behulp van 'flirt' in het FSL-pakket21,22 om het schedelgestripte MRI-beeld (bewegend beeld) uit te lijnen met het overeenkomstige lichtbladmicroscopiebeeld (referentiebeeld).
    3. Pas niet-rigide registratie toe (met behulp van 'SyN' in ANTS-software23) om de point-to-point overeenkomsten te vinden tussen het rigide MRI-beeld in stap 2.3.2 en het light-sheet beeld (hetzelfde referentiebeeld in stap 2.3.2).
      OPMERKING: De uitvoer omvat het vervormde MRI-beeld en het vervormingsveld dat is gekoppeld aan de volumeveranderingen van MRI naar de lichtbladafbeeldingen.
    4. Bereken de Jacobiaanse determinant op het vervormingsveld gegenereerd in stap 2.3.3, die de volumeverandering in een lokale buurt van 3 x 3 x 3 voxel kwantificeert.
    5. Lijn schedel-gestripte afbeeldingen uit op de Allen Developmental Mouse Brain Atlas met behulp van vervormbare beeldregistratie.
      OPMERKING: De vastgestelde ruimtelijke point-to-point correspondentie maakt automatische annotatie van hersengebieden van belang in het nieuwe muisbeeld mogelijk (figuur 2C-H).

3. Hersendissectie uit de schedel

  1. Maak een middenlijnincisie langs de bovenkant van de schedel van de nek tot de neus om de schedel bloot te leggen.
  2. Leg de basis van de schedel bloot door de resterende nekspier en alle andere resterende spieren weg te snijden.
  3. Gebruik een scherpe chirurgische schaar, knip voorzichtig langs het binnenoppervlak van de schedel en zorg ervoor dat de hersenen niet worden beschadigd door een zachte opwaartse druk te handhaven tijdens het snijden met de scherpe chirurgische apparatuur.
  4. Gebruik een pincet om de twee gesneden helften van de schedel weg te pellen van de hersenen en snijd overtollig vet dat aan de hersenen is bevestigd zorgvuldig weg.
  5. Gebruik een chirurgische schaar om elke dura te trimmen die de hersenen met de schedel verbindt en gebruik vervolgens een spatel om de hersenen voorzichtig van het hoofd te verwijderen.
  6. Verwijder de hersenen, was met PBS en wissel vervolgens naar PBS met 0,1% natriumazide en bewaar op 4 °C voor langdurige opslag.

4. Weefsel opruimen

OPMERKING: Dit protocol is aangepast van het iDISCO+ protocol voor P4 muizen6, met kleine wijzigingen. Sommige details kunnen veranderen voor verschillende tijdstippen/soorten/experimenten). LET OP: Methanol, dichloormethaan (DCM) en dibenzylether (DBE) zijn gevaarlijke chemicaliën. Deze weefselzuiveringsstappen worden uitgevoerd in een chemische zuurkast.

  1. Antilichaam validatie
    OPMERKING: Methanolcompatibiliteit van niet-geteste antilichamen moet worden gecontroleerd omdat ze negatief kunnen worden beïnvloed door de agressieve methanolwassingen die vereist zijn in het iDISCO + -protocol. Voor een lijst van antilichamen waarvan is aangetoond dat ze werken in iDISCO +, zie de website24.
    1. Oogst 10 μm bevroren secties van het PFA-gefixeerde weefsel van belang op stereologische dia's.
    2. Incubeer de secties in 100% methanol gedurende 3 uur bij kamertemperatuur.
    3. Rehydrateer in PBS voordat u doorgaat met standaard immunohistochemische protocollen om te bepalen of het antilichaam het verwachte fluorescentiepatroon vertoont na methanolwassingen. Gebruik voor positieve controle een dia die niet is behandeld met methanol.
  2. Buffervoorbereiding
    1. Bereid buffers voor volgens het officiële iDISCO-protocol. Zie de tabel met materialen voor de samenstelling van de buffers en andere oplossingen die in dit protocol worden gebruikt.
  3. Voorbehandeling
    1. Droog het monster uit met methanol / PBS-serie: 20%, 40%, 60%, 80%, 100%; 1 uur elk bij kamertemperatuur.
      OPMERKING: Het gebruik van PBS tijdens uitdroging helpt scheuren van de monsters in methanolwasbeurten te voorkomen.
    2. Was het monster in 100% methanol gedurende 1 uur en koel vervolgens gedurende 1 uur op 4 °C voordat u een nacht broedt met schudden in 66% DCM/33% methanol bij kamertemperatuur.
    3. Was het monster 2x in 100% methanol op kamertemperatuur en koel het vervolgens af op 4 °C.
    4. Gebruik verse 5% H2O2 in methanol om het monster een nacht bij 4 °C te bleken.
    5. Rehydrateer het monster met methanol / PBS-serie: 80%, 60%, 40%, 20%, PBS; 1 uur elk op kamertemperatuur en 2x gedurende 1 uur wassen in PTx.2 op kamertemperatuur.
    6. Incubeer het monster in 1x PBS/0,2% TritonX-100/20% DMSO bij 37 °C 's nachts.
    7. Incubeer het monster in 1x PBS/0,1% Tween-20/0,1% TritonX-100/0,1% Deoxycholaat/0,1% NP40/20% DMSO bij 37 °C 's nachts.
    8. Tweemaal 1 uur in PTx.2 wassen op kamertemperatuur.
  4. Immunolabeling
    1. Incubeer de monsters in permeabilisatieoplossing bij 37 °C gedurende 2 dagen (~ 48 uur).
    2. Blokkeer de monsters in Blokkeeroplossing bij 37 °C gedurende 2 dagen (~48 uur).
    3. Incubeer de monsters met primair antilichaam in PTwH / 5% DMSO / 3% Serum bij 37 °C gedurende 4 dagen (~ 96 h) (bijv. Konijn (Rb) Brn2 / POU3F2 mAb (1:100) en anti-Ctip2 rat (Rt) antilichaam (1:400) (Tabel van materialen).
    4. Was 3 x 1 uur in PTwH. Was nog eens 2 uur in PTwH. Laat de wasoplossing een nacht op kamertemperatuur staan.
    5. Incubeer de monsters met secundair antilichaam en een nucleaire kleurstof, zoals TO-PRO-3, in PTwH / 3% Serum bij 37 °C gedurende 4 dagen (~ 96 h; bijvoorbeeld geiten-anti-Rb (1:50) en (geit anti-Rt(1:200)) (Materiaaltabel).
    6. Was 3 x 1 uur in PTwH Wash nog eens 2 uur in PTwH. Laat de wasoplossing een nacht op kamertemperatuur.
  5. Verrekening
    1. Droog in methanol/PBS-serie-20%, 40%, 60%, 80%, 100%-1 uur elk bij kamertemperatuur. Incubeer gedurende 3 uur, met schudden, in 66% DCM / 33% methanol bij kamertemperatuur.
      OPMERKING: Het monster kan direct na uitdroging een nacht bij kamertemperatuur worden achtergelaten in 100% methanol.
    2. Incubeer tweemaal 15 minuten in 100% DCM bij kamertemperatuur (met schudden) om de MeOH te wassen.
    3. Incubeer in dibenzylether (DBE) zonder te schudden bij kamertemperatuur. Zorg ervoor dat de buis bijna volledig is gevuld met DBE om oxidatie van het monster te voorkomen. Voltooi het mengen van de oplossing door een paar keer om te keren voordat u het in beeld brengt.

5. Beeldvorming van lichte vellen

OPMERKING: iDISCO weefsel-gezuiverde hersenen werden in beeld gebracht met een lichtplaatmicroscoop, uitgerust met een 2X / 0,5 NA-objectief, een complementaire metaaloxide halfgeleidercamera en microscoopbedienings- en beeldacquisitiesoftware op 0,75 x 0,75 x 4 μm / voxel voor het P4-tijdspunt, omdat dit eencellige resolutie in de cortex mogelijk maakte (figuur 3A, B).

  1. Monster montage
    1. Monteer het monster voorzichtig in de juiste monstergroottehouder, zodat het monster is georiënteerd met de z-afmeting niet meer dan 5,2 mm diep vanwege de nominale werkafstand van de lichtplaatmicroscoop (5,7 mm minus 0,5 mm veiligheidsmarge)25.
    2. Plaats de houder in de monsterhouder met de schroef van de houder in een hoek van 45° ten opzichte van de wiegsteunen (figuur 1B). Plaats de houder zo dat het lichtpad loodrecht op het monster staat (figuur 1C).
  2. Beeldparameters
    1. Stel de zoombody op de microscoop in op 4x vergroting of hoger met een opbrengst van 0,75 μm/pixel.
      OPMERKING: Eencellige computationele analyses op P4-lichtplaatbeelden kunnen worden uitgevoerd met elke in de handel verkrijgbare lichtplaatmicroscoop die een resolutie van 0,75 x 0,75 x 4 μm / voxel of hoger mogelijk maakt. Een lagere resolutie is voldoende voor hersenen op latere tijdstippen waarin kernen schaarser verdeeld zijn.
    2. Selecteer in de beeldacquisitiesoftware een enkele lichtplaat met een NA = ~0,08 (stap van 9 μm dikte/4 μm z).
      OPMERKING: Deze instelling in combinatie met horizontale dynamische focus maakt beeldvorming van de hele hersenen mogelijk met een resolutie van een muishersen binnen een redelijke tijd. Voor een postnatale dag 4 (P4) hersenen wordt de beeldacquisitietijd geschat op 11-15 uur voor drie kanalen, afhankelijk van de grootte van de hersenen.
    3. Om ervoor te zorgen dat de axiale resolutie over de breedte van de afbeelding wordt gehandhaafd, selecteert u Horizontaal dynamisch scherpstellen en past u het aanbevolen aantal stappen toe, afhankelijk van de golflengte van de laser. Voor een heel P4-muizenbrein stel je de horizontale dynamische focus in op 11. Pas de fijnfocus voor elk kanaal aan met betrekking tot het registratiekanaal.
      OPMERKING: Hier is het TO-PRO-3-kanaal (647 nm) geregistreerd in de Allen Developmental Mouse Brain Atlas, omdat dit alle kernen labelt.
    4. Pas het laservermogen per kanaal aan met betrekking tot de kanaaleigenschappen.
      OPMERKING: Langere golflengten vereisen een hoger laservermogen in vergelijking met kortere golflengten. Zo moet de 780 nm worden vastgelegd met een hoog laservermogen (70% - 75%) en een lage belichting (50 ms), terwijl het 647 nm-kanaal een gemiddeld laservermogen (40% - 45%) en een lage belichting (50 ms) vereist.
    5. Pas de light-sheetbreedte aan op ~50% om ervoor te zorgen dat het plaatvermogen optimaal wordt verdeeld in de y-dimensie voor deze steekproefgrootte.
      OPMERKING: In combinatie met de horizontale dynamische scherpstelling zorgt een velbreedte van 50% voor een gemiddelde verdeling van het vermogen over het beeld met een verminderd risico op fotobleaching25.
    6. Stel aantal tegels in met betrekking tot de grootte van het monster met een aanbevolen overlap van 15% tussen tegels en leg afbeeldingen voor elk kanaal sequentieel vast voor elke stapel op een bepaalde tegelpositie.

6. Beeldverwerking met NuMorph

OPMERKING: De NuMorph-pijplijn bestaat uit drie hoofdonderdelen voor 3D-beeldanalyse: voorverwerking, analyse en evaluatie. Deze onderdelen zijn georganiseerd in respectievelijk NMp_template.00, NMa_template en NMe_template.00 uur, die hieronder worden besproken. Bovendien wordt NM_setup.m toegevoegd om softwarepakketten te downloaden en te installeren die nodig zijn om NuMorph soepel te laten werken. NM_samples.m biedt ook een sjabloon voor het invoeren van informatie over het verkrijgen van afbeeldingen.

  1. NuMorph instellen
    1. Download en installeer de conda environment manager voor Linux26. Download en installeer NuMorph 19-beeldverwerkingstools.
    2. Voer matlab uit op de opdrachtregel . Voer NM_setup.m van NuMorph uit om softwarepakketten voor beeldanalyses te downloaden en te installeren die nodig zijn voor analyses.
      OPMERKING: Deze stap zorgt ervoor dat de conda-omgeving correct is ingesteld en zorgt ervoor dat alle tools en add-ons die Matlab nodig heeft om elk van de drie pijplijnen uit te voeren, correct worden gedownload en geïnstalleerd. De meest opvallende hier zijn Elastix voor het uitvoeren van registratie en 3D-Unet voor celdetectie en -telling.
  2. Geef voorbeeldnamen, invoer- en uitvoermappen, kanaalinformatie en light-sheet imaging-parameters op door het bestand NM_samples.m. te bewerken.
    OPMERKING: Hier wordt aanbevolen om dubbel te controleren of de juiste informatie, met name de map met afbeeldingsinvoer, correct is opgegeven. Fouten worden hier meestal niet aangeroepen totdat de volgende stappen worden uitgevoerd.
  3. Voorbewerking van afbeeldingen
    1. Intensiteit aanpassing
      1. Stel in de NMp_template intensiteitsaanpassing = true in.
        OPMERKING: Stel in op true als aanpassing van de intensiteit vereist is. Zo niet, stel dan intensiteitsaanpassing in = false. Er is ook een optie om 'update' te gebruiken om eerdere aanpassingsparameters te overschrijven.
      2. Gebruik verwerkte afbeeldingen = false instellen bij het werken met een nieuwe set afbeeldingen. Geef anders alle eerder opgeslagen afbeeldingsgegevenssets in de uitvoermap aan (bijvoorbeeld "uitgelijnd", "gestikt") om te gebruiken voor volgende verwerkingsstappen.
        OPMERKING: Deze optie is beschikbaar in het geval dat invoerafbeeldingen al zijn voorbewerkt. In dit geval worden voorbewerkte afbeeldingen gebruikt als invoerafbeeldingen en wordt de optie ingesteld op de naam van de submap in de uitvoermap.
      3. Stel afbeeldingen opslaan = true in.
        OPMERKING: Als u deze optie gebruikt, zorgt u ervoor dat verwerkte afbeeldingen worden opgeslagen in de uitvoermap; anders worden alleen parameters berekend en opgeslagen.
      4. Stel opgeslagen voorbeelden in = true.
        OPMERKING: Deze optie zorgt ervoor dat voorbeeldresultaten worden opgeslagen voor elke belangrijke stap.
      5. Stel tegelschaduwen aanpassen = basis in om schaduwcorrectie toe te passen met behulp van het BaSiC-algoritme27 of handmatig om tegelschaduwcorrectie toe te passen met behulp van metingen van de lichtplaatmicroscoop bij specifieke breedtes van lichtplaten.
        OPMERKING: Deze optie corrigeert voor de ongelijke verlichting langs de y-dimensie veroorzaakt door de vorm van de taille van het vel.
    2. Uitlijning van afbeeldingskanalen
      1. Stel in NMp_template kanaaluitlijning = true in. Stel deze optie in op true als kanaaluitlijning vereist is. Zo niet, stel dan in op false. Stel de kanaaluitlijningsmethode in op translatie (rigide) of elastix (nonrigid).
        OPMERKING: De vertaalmethode maakt gebruik van rigide 2D-registratiebenaderingen bij het uitlijnen van meerdere kanalen, terwijl de elastix-methode niet-rigide B-splines28 gebruikt om te corrigeren voor rotatiedrift, die kan optreden tijdens lange beeldacquisitie19.
    3. Iteratieve beeldstiksels
      1. Stel in NMp_template steekafbeeldingen in = waar.
        OPMERKING: Stel deze optie in op true als stiksels vereist zijn.
      2. Zeefijning instellen = waar.
        OPMERKING: Deze optie wordt gebruikt om de vertaling in xy verder te verfijnen met behulp van de Scale Invariant Feature Transform29.
      3. Stel belastinguitlijningsparams = true in.
        OPMERKING: Deze optie maakt gebruik van de kanaaluitlijningsvertalingen tijdens het naaien. Deze optie wordt aanbevolen voor meerkanaals beeldvorming. Anders ingesteld op false.
      4. Stel overlap = 0,15 in om tegeloverlappingen tijdens de afbeelding overeen te laten komen.
    4. Als u een van deze voorverwerkingsstappen wilt uitvoeren, voert u het volgende uit in Matlab buiten NMp_template omgeving:
      1. Geef de voorbeeldnaam op. Stel config = NM_config(process,sample) in.
      2. Voer een van de voorverwerkingsstappen uit door NM_process (configuratie, fase) op te geven en de fase op te geven met behulp van intensiteit, uitlijning of steek voor een van de processen. Controleer de uitvoermap op uitvoerbestanden voor elk van de fasen (figuur 3 en figuur 4).
  4. Beeldanalyse
    1. Vóór NuMorph
      1. Begin met een 3D-atlasafbeelding en een bijbehorende annotatieafbeelding die elke voxel aan een bepaalde structuur toewijst.
        OPMERKING: De P4 Allen Developmental Mouse Brain Atlas gegenereerd uit de MagellanMapper30 wordt hier gebruikt.
      2. Lijn zowel de atlasafbeelding als het annotatiebestand uit om ervoor te zorgen dat ze correct overeenkomen in de juiste richting.
    2. Binnen NuMorph
      OPMERKING: Nu de atlas en de annotaties correct zijn uitgelijnd, moeten de bestanden worden "geminungeerd" of verwerkt binnen NuMorph, zodat ze kunnen worden opgeslagen voor later gebruik. Gebruik hiervoor de functie munge_atlas om ingangen op te geven zoals hieronder wordt weergegeven.
      1. Geef Atlas_file op: (tekenreeks). Geef het volledige pad naar het atlasbestand op.
      2. Geef Annotation_file op: (tekenreeks). Geef het volledige pad naar de bijbehorende annotaties op.
      3. Resolutie opgeven: (1x3 numeriek). Geef de atlas y,x,z-resolutie op als micron per pixel.
      4. Richting opgeven: (1 x 3 tekens). Geef de atlasoriëntatie op en zorg ervoor dat deze overeenkomt met de opstelling van het monster in de houder (voorste (a) / achterste (p), superieur (s) / inferieur (i), links (l) / rechts (r)).
      5. Hemisfeer opgeven: Geef op welke hersenhelft is afgebeeld ("links", "rechts", "beide", "geen").
      6. Geef out_resolution:(int) op. Geef de isotrope resolutie van atlasuitvoer in micron op. (standaard: 25).
      7. Voer het commando "munge_atlas(atlas_file, annotation_file, resolution, orientation, hemisphere)" uit om geminkte annotaties te genereren in /data/annotation_data en een kopie van de atlasafbeelding in /data/atlas.
      8. Lees de Matlab-structuur en het atlasbestand om te controleren of beide bestanden correct in de juiste richting zijn gemungeerd.
        OPMERKING: Een extra celclassificatiestap kan worden uitgevoerd om celtypen te kwantificeren op basis van colokalisatie van immunogelabelde eiwitmarkers.
    3. Resampling
      1. Stel in NMa_template resample images = true in als u een afbeeldingsregistratie uitvoert om naar de atlas te verwijzen of om gedownsampelde volumes van datasets met hoge resolutie te genereren.
        OPMERKING: De NMa_template.m. wordt gebruikt om de parameters in te stellen voor resampling, registratie, kerndetectie en celtelling.
      2. Stel de resample-resolutie in zodat deze overeenkomt met de atlas.
        OPMERKING: Hier wordt 25 μm3/voxel isotrope resolutie gebruikt omdat de referentieatlas deze resolutie heeft.
      3. Geef het kanaalnummer op dat opnieuw moet worden bemonsterd met behulp van resample-kanalen = [ ].
        OPMERKING: Hier wordt het kanaalnummer ingesteld om overeen te komen met het nucleaire kanaal. Als deze optie leeg is, wordt alleen het registratiekanaal opnieuw bemonsterd.
    4. Registratie
      1. Stel in NMa_template registerafbeeldingen in = true. Stel in op true als registratie vereist is. Zo niet, stel dan registratie = false in.
      2. Geef het atlasbestand op dat overeenkomt met het bestand in de atlasmap.
      3. Stel registratieparameters in = standaard.
        OPMERKING: Deze optie maakt gebruik van een affiene gevolgd door B-splinetransformatie om ruimtelijke correspondentie te schatten. Definieer anders een nieuwe set registratieparameters via Elastix in /data/elastix_parameter_files/atlas_registration.
      4. Stel geregistreerde afbeeldingen opslaan in = true.
        OPMERKING: Uitvoerbestanden van registratie en resampling kunnen worden gedownload en visueel worden geïnspecteerd in Matlab of andere visualisatietools zoals FIJI31.
    5. Kernen detectie, celtelling en classificatie
      OPMERKING: Fouten die hier optreden, kunnen te wijten zijn aan het niet correct opgeven van het annotatiesbestand of het niet overeenkomen met de leeftijd van het voorbeeld met de juiste annotatie.
      1. Stel in NMa_template beide telkernen in en classificeer cellen = waar.
      2. Stel de telmethode in = 3dunet.
        OPMERKING: Met deze optie kunt u het getrainde 3D-Unet-model19 gebruiken. Selecteer anders Hessian die de Hessische blobdetectiemethode gebruikt.
      3. Stel min_intensity in om een minimale intensiteitsdrempel voor gedetecteerde objecten te definiëren.
        OPMERKING: Een geschikte drempel wordt empirisch bepaald op basis van de signaal-ruisverhouding van nucleaire etikettering.
      4. Stel classify_method in op een van beide drempels, die is gebaseerd op een niet-gecontroleerde fluorescentie-intensiteit op centroïde posities of svm, die een supervised linear Support Vector Machine (SVM) classificator modelleert.
        OPMERKING: Deze stap classificeert alle gedetecteerde cellen in vier hoofdklassen met 3-kanaals beeldvorming. Met dit protocol worden Ctip2+/Brn2-, Ctip2-/Brn2+, Ctip2-/Brn2- en Outliers gegenereerd.
    6. Analysestappen
      1. Geef de voorbeeldnaam op. Stel config =NM_config(analyze,sample).
      2. Voer een van de analysestappen uit door NM_analyze(config,stage) op te geven en de fase op te geven met behulp van resample, register, count of classify. Controleer de uitvoermap op uitvoerbestanden voor elk van de fasen (figuur 5).
    7. Celtypeclassificatie en groepsanalyse
      1. Stel in NMe_template update = true in en overschrijf alle eerdere statistieken die zijn berekend.
        OPMERKING: De NMe_template.m biedt de mogelijkheid om celtype groepsanalyse uit te voeren in hersengebieden van dezelfde hersenen die worden geanalyseerd.
      2. Stel compare_structures_by in op index om te vergelijken op basis van alle unieke annotaties of tabel om structuren te vergelijken volgens de tabel.
      3. Stel de template_file in, die alle mogelijke structuurindexen specificeert en moet bestaan in /annotaties.
      4. Stel structure_table in en geef structuren op die moeten worden geëvalueerd.
      5. Geef celtelling en celtypeclassificatie op zoals beschreven in NMa_template.m.
      6. Stel compare_groups in om groepen op te geven die moeten worden vergeleken.
      7. Stel gekoppeld in op true of false om een gekoppelde t-test of een t-test met twee samples uit te voeren.
    8. Voer de analyse uit.
      OPMERKING: Als u deze stap wilt uitvoeren, voert u het volgende uit in Matlab buiten NMe_template omgeving.
      1. Geef de voorbeeldnaam op. Stel config =NM_config(evaluate,sample) in.
      2. Voer de analysestap uit door NM_evaluate(config,stage) op te geven en de fase op te geven. Controleer de uitvoermap op uitvoerbestanden voor de groepsanalyse.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Omdat het iDISCO+ protocol aanzienlijke weefselkrimp introduceert, die gemakkelijk merkbaar is door het oog (figuur 2B), hebben we een MRI-stap aan deze pijplijn toegevoegd voorafgaand aan het opruimen van weefsel om de krimp te kwantificeren die wordt veroorzaakt door weefselopruiming. De workflow begint met het verwijderen van het niet-hersenweefsel uit het MR-beeld (figuur 2C). Vervolgens wordt een rigide transformatie (3 translatie- en 3 rotatiehoeken) toege...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Weefselopruimingsmethoden zijn nuttige technieken voor het meten van 3D cellulaire organisatie van de hersenen. Er zijn een groot aantal weefselzuiveringsmethoden beschreven in de literatuur, elk met zijn voordelen en beperkingen 6,7,8,9. De opties voor computationele hulpmiddelen om de celtypen in de weefsel-gewiste beelden te analyseren zijn relatief beperkt. Andere beschikbare hulpmiddelen z...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de NIH (R01MH121433, R01MH118349 en R01MH120125 voor JLS en R01NS110791 voor GW) en de Foundation of Hope. We bedanken Pablo Ariel van het Microscopy Services Laboratory voor zijn hulp bij het afbeelden van monsters. Het Microscopy Services Laboratory in de afdeling Pathologie en Laboratoriumgeneeskunde wordt gedeeltelijk ondersteund door Cancer Center Core Support Grant P30 CA016086 aan het Lineberger Comprehensive Cancer Center van de University of North Carolina (UNC). De Neuroscience Microscopy Core wordt ondersteund door subsidie P30 NS045892. Onderzoek dat in deze publicatie wordt gerapporteerd, werd gedeeltelijk ondersteund door de North Carolina Biotech Center Institutional Support Grant 2016-IDG-1016.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Bruker 9.4T/30 cm MRI ScannerBruker BiospecHorizontaal boring dier MRI systeem
Dibenzyl etherSigma-Aldrich108014-1KG
Dichloromethane (DCM)Sigma-Aldrich270997-1L
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Fisher-ScientificICN19605590
Donkey serumSigma-AldrichS30-100ML
EVO 860 4TB externe SSD
Fomblin YSpeciality Fluids CompanyYL-VAC-25-6perfluoropolyether smeermiddel
gadolinium contrastmiddel (ProHance)Bracco DiagnosticsA9576
gadolinium contrastmiddel(ProHance)Bracco Diagnostics0270-1111-03
GeForce GTX 1080 Ti 11GB GPUEVGA08G-P4-6286-KR
GlycineSigma-AldrichG7126-500G
Heparine natriumzoutSigma-AldrichH3393-10KUOpgelost in H2O tot 10 mg/mL
Waterstofperoxide oplossing, 30%Sigma-AldrichH1009-100ML
ImSpector ProLaVision BioTecMicroscoop beeldopname software
ITK Snapsegmentatiesoftware
MethanolFisher-ScientificA412SK-4
MVPLAPO 2x/0.5 NA ObjectiefOlympus
Paraformaldehyde, poeder, 95% (PFA)Sigma-Aldrich30525-89-4Opgelost in 1x PBS tot 4%
Fosfaat Gebufferde Saline 10x (PBS)Corning46-013-CMVerdund tot 1x in H2O
NatriumazideSigma-AldrichS2002-100GOpgelost in H2O tot 10%
Natrium deoxycholaatSigma-AldrichD6750-10G
Tergitol type NP-40Sigma-AldrichNP40S-100ML
TritonX-100Sigma-AldrichT8787-50ML
Tween-20Fisher-ScientificBP337 500
Ultramicroscope II Light Sheet MicroscopeLaVision BioTec
Xeon Processor E5-2690 v4IntelE5-2690
Zyla sCMOS CameraAndorComplementaire metaaloxide halfgeleider camera
AntilichaamWerkconcentratie
Alexa Fluor Goat 790 Anti-RabbitThermofisher ScientificA11369(1:50)
Alexa Fluor Goat 568 Anti-RatThermofisher ScientificA11077(1:200)
Rat anti-Ctip2Abcamab18465(1:400)
Rabbit anti-Brn2Cell Signaling Technology12137(1:100)
To-Pro 3 (TP3)Thermofisher ScientificT3605(1:400)

Referenties

  1. Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: Three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
  2. Hägerling, R., et al. A novel multistep mechanism for initial lymphangiogenesis in mouse embryos based on ultramicroscopy. The EMBO Journal. 32 (5), 629-644 (2013).
  3. Tomer, R., Khairy, K., Keller, P. J. Shedding light on the system: studying embryonic development with light sheet microscopy. Current Opinion in Genetics & Development. 21 (5), 558-565 (2011).
  4. Li, A., et al. Micro-optical sectioning tomography to obtain a high-resolution atlas of the mouse brain. Science. 330 (6009), 1404-1408 (2010).
  5. Stoner, R., et al. Patches of disorganization in the neocortex of children with autism. The New England Journal of Medicine. 370 (13), 1209-1219 (2014).
  6. Renier, N., et al. IDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  7. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  8. Richardson, D. S., et al. Tissue clearing. Nature Reviews. Methods Primers. 1 (1), 84(2021).
  9. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  10. Renier, N., et al. Mapping of brain activity by automated volume analysis of immediate early genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
  11. Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 59 (2), 129-138 (2011).
  12. Girkin, J. M., Carvalho, M. T. The light-sheet microscopy revolution. Journal of Optics. 20 (5), 053002(2018).
  13. Budday, S., et al. Mechanical properties of gray and white matter brain tissue by indentation. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 46, 318-330 (2015).
  14. Johnson, G. A., et al. High-throughput morphologic phenotyping of the mouse brain with magnetic resonance histology. NeuroImage. 37 (1), 82-89 (2007).
  15. Herculano-Houzel, S., Mota, B., Lent, R. Cellular scaling rules for rodent brains. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (32), 12138-12143 (2006).
  16. Matsumoto, K., et al. Advanced CUBIC tissue clearing for whole-organ cell profiling. Nature Protocols. 14 (12), 3506-3537 (2019).
  17. Fürth, D., et al. An interactive framework for whole-brain maps at cellular resolution. Nature Neuroscience. 21 (1), 139-149 (2018).
  18. Chandrashekhar, V., et al. CloudReg: automatic terabyte-scale cross-modal brain volume registration. Nature Methods. 18 (8), 845-846 (2021).
  19. Krupa, O., et al. NuMorph: Tools for cortical cellular phenotyping in tissue-cleared whole-brain images. Cell Reports. 37 (2), 109802(2021).
  20. Petiet, A., Delatour, B., Dhenain, M. Models of neurodegenerative disease - Alzheimer's anatomical and amyloid plaque imaging. Methods in Molecular Biology. 771, 293-308 (2011).
  21. Jenkinson, M., Beckmann, C. F., Behrens, T. E. J., Woolrich, M. W., Smith, S. M. FSL. NeuroImage. 62, 782-790 (2012).
  22. Jenkinson, M., Bannister, P., Brady, M., Smith, S. Improved optimization for the robust and accurate linear registration and motion correction of brain images. NeuroImage. 17 (2), 825-841 (2002).
  23. Avants, B. B., Epstein, C. L., Grossman, M., Gee, J. C. Symmetric diffeomorphic image registration with cross-correlation: evaluating automated labeling of elderly and neurodegenerative brain. Medical Image Analysis. 12 (1), 26-41 (2008).
  24. iDISCO method. , Available from: https://idisco.info/ (2022).
  25. Ariel, P. UltraMicroscope II - A User Guide. University of North Carolina at Chapel Hill. , UniversityLibraries. Chapel Hill (NC). (2019).
  26. Anaconda Distribution - Anaconda documentation. , Available from: https://docs.anaconda.com/anaconda/ (2022).
  27. Peng, T., et al. A BaSiC tool for background and shading correction of optical microscopy images. Nature Communications. 8, 14836(2017).
  28. Klein, S., Staring, M., Murphy, K., Viergever, M. A., Pluim, J. P. W. elastix: a toolbox for intensity-based medical image registration. IEEE Transactions on Medical Imaging. 29, 196-205 (2010).
  29. Lowe, G. Sift-the scale invariant feature transform. International Journal. 2 (91-110), 2(2004).
  30. Young, D. M., et al. Whole-brain image analysis and anatomical atlas 3D generation using MagellanMapper. Current Protocols in Neuroscience. 94 (1), Editorial Board, Jacqueline N. Crawley ... [et al] 104(2020).
  31. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  32. Velíšek, L. Under the (Light) sheet after the iDISCO. Epilepsy Currents / American Epilepsy Society. 16 (6), 405-407 (2016).
  33. ITK-SNAP home. , Available from: http://www.itksnap/org/pmwiki/pmwiki.php (2022).
  34. Young, D. M., et al. Constructing and optimizing 3D atlases from 2D data with application to the developing mouse brain. eLife. 10, (2021).
  35. Yun, D. H., et al. Ultrafast immunostaining of organ-scale tissues for scalable proteomic phenotyping. bioRxiv. , (2019).
  36. Silvestri, L., et al. Universal autofocus for quantitative volumetric microscopy of whole mouse brains. Nature Methods. 18 (8), 953-958 (2021).
  37. Frasconi, P., et al. Large-scale automated identification of mouse brain cells in confocal light sheet microscopy images. Bioinformatics. 30 (17), 587(2014).
  38. Kruskal, J. B. On the shortest spanning subtree of a graph and the traveling salesman problem. Proceedings of the American Mathematical Society. American Mathematical Society. 7 (1), 48-50 (1956).
  39. Wang, Q., et al. The allen mouse brain common coordinate framework: A 3D reference atlas. Cell. 181, 936-953 (2020).
  40. Borland, D., et al. Segmentor: a tool for manual refinement of 3D microscopy annotations. BMC Bioinformatics. 22 (1), 260(2021).
  41. Kumar, A., et al. Dual-view plane illumination microscopy for rapid and spatially isotropic imaging. Nature Protocols. 9 (11), 2555-2573 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Whole brain imaginganalyse op enkelcelniveauneonataal muizenbreinMRI hersenscankwantificering van nuclei3D hersenenatlasclassificatie van celtypenimage stitching

Gerelateerde artikelen