Method Article

Combinatie van 3D Magnetic Force Actuator en multifunctionele fluorescentie beeldvorming om Nucleus Mechanobiology te bestuderen

DOI:

10.3791/64098

⸱

July 5th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Mechanical and Aerospace Engineering, Herbert Wertheim College of Engineering, University of Florida, 2Department of Materials Science and Engineering, University of Florida, 3Department of Biostatistics, University of Florida, 4Department of Biomedical Engineering, College of Engineering (COE), University of Delaware (UD), 5UF Health Cancer Center, University of Florida, 6Department of Physics, College of Liberal Arts and Sciences, University of Florida, 7Department of Anatomy and Cell Biology, College of Medicine, University of Florida, 8J. Crayton Pruitt Family Department of Biomedical Engineering, University of Florida, 9Department of Physiology and Functional Genomics, University of Florida

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie presenteert een nieuw protocol om direct mechanische kracht uit te oefenen op de celkern door middel van magnetische microbeads die in het cytoplasma worden afgeleverd en om gelijktijdige live-cell fluorescerende beeldvorming uit te voeren.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een fundamentele vraag in de mechanobiologie is hoe levende cellen extracellulaire mechanische stimuli waarnemen in de context van celfysiologie en pathologie. De cellulaire mechano-sensatie van extracellulaire mechanische stimuli wordt verondersteld zich te bevinden via de membraanreceptoren, het bijbehorende eiwitcomplex en het cytoskelet. Recente ontwikkelingen in de mechanobiologie tonen aan dat de celkern in het cytoplasma zelf onafhankelijk mechanische stimuli tegelijkertijd kan waarnemen. Een mechanistisch begrip van hoe de celkern mechanische stimuli detecteert, transduceert en erop reageert, ontbreekt echter, voornamelijk vanwege de technische uitdagingen bij het openen en kwantificeren van de kernmechanica met conventionele hulpmiddelen. Dit artikel beschrijft het ontwerp, de fabricage en de implementatie van een nieuwe magnetische krachtactuator die nauwkeurige en niet-invasieve 3D-mechanische stimuli toepast om de celkern direct te vervormen. Met behulp van CRISPR/Cas9-engineered cellen toont deze studie aan dat deze tool, in combinatie met hoge resolutie confocale fluorescerende beeldvorming, de onthulling mogelijk maakt van de real-time dynamiek van een mechano-gevoelig yes-associated protein (YAP) in enkele cellen als functie van kernvervorming. Deze eenvoudige methode heeft het potentieel om de huidige technologische kloof in de mechanobiologiegemeenschap te overbruggen en antwoorden te bieden op de kenniskloof die bestaat in de relatie tussen nucleusmechanotransductie en celfunctie.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie heeft tot doel een nieuwe techniek te ontwikkelen en toe te passen om kernmechanobiologie op te helderen door de magnetische actuatoren die mechanische kracht rechtstreeks op de celkern uitoefenen te combineren met de confocale fluorescentiemicroscopie die tegelijkertijd de structurele en functionele subcellulaire veranderingen in beeld brengt. Cellen detecteren extracellulaire biofysische signalen, waaronder weefselstijfheid 1,2,3,4, interstitiële vloeistofdruk en schuifspanning 5,6,7

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Onderhoud van CRISPR/Cas9-engineered B2B cellen

  1. Kweek B2B-cellen in een T25-kolf met RPMI-1640 aangevuld met 10% foetaal runderserum en 1% penicilline-streptomycine.
  2. Bewaar de B2B-cellen in een bevochtigde incubator op 37 °C met 5% CO2.
  3. Subcultuur de B2B-cellen wanneer de samenvloeiing 70% tot 80% bereikt.
  4. Bewaar de B2B cellijn in RPMI-1640 kweekmedium met 10% (v/v) DMSO in een -80 °C vriezer.
  5. Gebruik de B2B-cellen met een passagegetal van minder dan 10 in de experimenten.

2. Celkweek

  1. Zaai de cellen op een petrischaaltje met gla....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ontwerp van een magneetbewegend apparaat en toepassing van magnetische kracht
Om kracht uit te oefenen op de kern door de magnetische microbeads, werd een magneetbewegend apparaat ontworpen en gebouwd om de ruimtelijke positie van de magneet te regelen. Het magneetbewegende apparaat bevat een centraal frame, drie knoppen en rails om de aangesloten magneet onafhankelijk van elkaar in x-, y- en z-richting te bewegen met een ruimtelijke resolutie van 1,59 mm per cyclus (figuur 1A

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Internalisatie van magnetische microbeads (sectie 2.2) is van cruciaal belang omdat extracellulaire microbeads niet rechtstreeks kracht kunnen uitoefenen op de kern. Krachttoepassing en beeldvorming (paragraaf 5.3) zijn kritieke stappen in dit experiment en de kracht die nodig is om de kern te vervormen en zinvolle biologische gevolgen te veroorzaken, kan steekproefafhankelijk zijn. De krachtmagnitude in dit experiment (0,8 nN en 1,4 nN) kan verder worden verhoogd om nucleaire mechano-detectie in minder gevoelige cellen .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er zijn geen belangenconflicten aan te kondigen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit project wordt gefinancierd door UF Gatorade Award Start-up Package (X. T.), de UFHCC Pilot Award (X. T. en Dr. Dietmar Siemann), UF Opportunity Seed Fund (X. T.) en UFHCC University Scholars Program (H. Y. Wang). We waarderen oprecht de intellectuele discussies met en de technische ondersteuning van Dr. Jonathan Licht (UFHCC), Dr. Rolf Renne (UFHCC), Dr. Christopher Vulpe (UFHCC), Dr. Blanka Sharma (BME), Dr. Mark Sheplak (MAE &ECE), Dr. Daniel Ferris (BME), Dr. Malisa Sarntinoranont (MAE), Dr. Ashok Kumar (MAE), Dr. Benjamin Keselowsky (BME), Dr. Brent Gila (RSC), Dr. Philip Feng (ECE), Dr. Gregory A. Hudalla (BME), Dr. Steven Ghivizzani (OSSM), Dr. Yenisel Cruz....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,05 % TrypsinCorning25-051-CI
25 cm2 flaconCorning156340
7-µm gemiddelde diameter carbonyl ijzer microbeadsN/AN/A
A1R confocal systeemNikon
Carbonyl IJzer Poeder CMBASF30042253Magnetische microbead
Kweekmedium (RPMI-1640)Gibco11875093
BureaucomputerDellmet Windows 10 besturingssysteem
Omgevingskamer TIZBTokai HitTIZB
Fetaal bovien serum (FBS)Gibco26140
Fiji ImageJNational Institutes of Health en het Laboratory for Optical and Computational Instrumentation
Petrischaal met glazen bodemMatTekP35G-1.5-14-C
MagneetK&J Magnetics, Inc.D99-N52
Monochrome CameraFLIRBFS-U3-70S7M-C
NIS-Elements software platformNikonsoftware platform
Nucleus masker ImageJ macrohttps://github.com/KOLIUG/Nuclear mask
NucSpot Live 650Biotium#40082Nucleaire kleuring
Penicilline-streptomycineGibco15140122
Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)Gibco10010023
Ti2-E omgekeerde microscoopNikon
XYZ mover (CAD bestanden)https://github.com/KOLIUG/XYZ-mover

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
  2. Janmey, P. A., Fletcher, D. A., Reinhart-King, C. A. Stiffness sensing by cells. Physiological Reviews. 100 (2), 695-724 (2020).
  3. Bajaj, P., ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Nucleus MechanobiologyMagnetic Force ActuatorFluorescence ImagingConfocal MicroscopyNuclear MechanosensingYAP TranslocationMagnetic MicrobeadsNucleus DeformationCytoskeleton MechanicsLive Cell Imaging

Related Articles