Methodenartikel

Een eenvoudige benchtop-filtratiemethode om kleine extracellulaire blaasjes te isoleren van menselijke mesenchymale stamcellen

DOI:

10.3791/64106

⸱

23 juni 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Universiti Kebangsaan Malaysia Medical Centre, 2My CytoHealth Sdn. Bhd., 3School of Biosciences, Faculty of Health and Medical Sciences, Taylor's University, 4School of Pharmacy, Monash University Malaysia, 5Haematology Unit, Cancer Research Centre, Institute for Medical Research (IMR), National Institutes of Health (NIH), Ministry of Health Malaysia, 6School of Pharmacy, Faculty of Health & Medical Sciences, Taylor's University, 7Centre for Drug Discovery and Molecular Pharmacology (CDDMP), Faculty of Health and Medical Sciences, Taylor's University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol laat zien hoe de kleine extracellulaire blaasjes (hUC-MSC-sEV's) van menselijke navelstreng-afgeleide mesenchymale stamcellen kunnen worden geïsoleerd met een eenvoudige benchtop-instelling op laboratoriumschaal. De grootteverdeling, eiwitconcentratie, sEV-markers en morfologie van geïsoleerde hUC-MSC-sEV's worden gekenmerkt door respectievelijk nanodeeltjestrackinganalyse, BCA-eiwittest, western blot en transmissie-elektronenmicroscoop.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het op ultracentrifugatie gebaseerde proces wordt beschouwd als de gebruikelijke methode voor isolatie van kleine extracellulaire blaasjes (sEV's). De opbrengst van deze isolatiemethode is echter relatief lager en deze methoden zijn inefficiënt in het scheiden van sEV-subtypen. Deze studie demonstreert een eenvoudige benchtopfiltratiemethode om van menselijke navelstreng afgeleide MSC kleine extracellulaire blaasjes (hUC-MSC-sEV's) te isoleren, met succes gescheiden door ultrafiltratie van het geconditioneerde medium van hUC-MSCs. De grootteverdeling, eiwitconcentratie, exosomale markers (CD9, CD81, TSG101) en morfologie van de geïsoleerde hUC-MSC-sEV's werden gekarakteriseerd met respectievelijk nanodeeltjestraceringsanalyse, BCA-eiwittest, western blot en transmissie-elektronenmicroscoop. De grootte van de geïsoleerde hUC-MSC-sEV's was 30-200 nm, met een deeltjesconcentratie van 7,75 × 10 10 deeltjes / ml en een eiwitconcentratie van80 μg / ml. Positieve banden voor exosomale markers CD9, CD81 en TSG101 werden waargenomen. Deze studie toonde aan dat hUC-MSC-sEV's met succes werden geïsoleerd uit hUC-MSCs geconditioneerd medium, en karakterisering toonde aan dat het geïsoleerde product voldeed aan de criteria vermeld in Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 (MISEV 2018).

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Volgens MISEV 2018 zijn sEV's niet-replicerende lipide dubbellaagse deeltjes zonder functionele kern, met een grootte van 30-200 nm1. MSC-afgeleide sEV's bevatten belangrijke signaalmoleculen die een belangrijke rol spelen bij weefselregeneratie, zoals microRNA, cytokines of eiwitten. Ze zijn in toenemende mate een "hotspot" voor onderzoek geworden in regeneratieve geneeskunde en celvrije therapie. Veel studies hebben aangetoond dat MSC-afgeleide sEV's net zo effectief zijn als MSC's bij de behandeling van verschillende aandoeningen, zoals immunomodulatie 2,3,4,5, het verbeteren van osteogenese 6, diabetes mellitus7,8 of vasculaire regeneratie 9,10. Naarmate de vroege fase van de proeven vordert, zijn drie belangrijke belangrijke kwesties met betrekking tot de klinische vertaling van MSC's-EV's benadrukt: de opbrengst van de EV's, de zuiverheid van de EV's (vrij van celresten en andere biologische verontreinigingen zoals eiwitten en cytokines) en de integriteit van het fosfolipide dubbellaagse membraan van de EV's na isolatie.

Er zijn verschillende methoden ontwikkeld om sEV's te isoleren, waarbij gebruik wordt gemaakt van de dichtheid, vorm, grootte en oppervlakte-eiwit van de sEV's11. De twee meest voorkomende methoden in sEV-isolaties zijn op ultracentrifugatie gebaseerde en op ultrafiltratie gebaseerde technieken.

Op ultracentrifugatie gebaseerde methoden worden beschouwd als gouden standaardmethoden in sEV-isolatie. Twee soorten ultracentrifugatietechnieken die meestal worden gebruikt, zijn differentiële ultracentrifugatie en dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie. Ultracentrifugatiemethoden resulteren echter vaak in een lage opbrengst en vereisen dure apparatuur voor ultracentrifuge met hoge snelheid (100.000-200.000 × g)11. Bovendien zijn ultracentrifugatietechnieken alleen inefficiënt in het scheiden van EV-subtypen (sEV's en grote EV's), wat resulteert in een onzuivere sedimentlaag11. Ten slotte kan ultracentrifugatie van dichtheidsgradiënt ook tijdrovend zijn en aanvullende voorzorgsmaatregelen vereisen, zoals toevoeging van sucrosebuffer om de gradiëntschade tijdens versnellings- en vertragingsstappente remmen 12. Daarom leidt ultracentrifugatie meestal tot een relatief lage opbrengst en is het niet in staat om onderscheid te maken tussen verschillende populaties EV's13, wat de toepassing ervan voor grootschalige EV-preparatenbeperkt 11.

De tweede methode van EV-isolatie is via ultrafiltratie, die is gebaseerd op groottefiltratie. Ultrafiltratie is relatief tijd- en kosteneffectief in vergelijking met ultracentrifugatie, omdat het geen dure apparatuur of lange verwerkingstijden met zich meebrengt14. Ultrafiltratie lijkt dus een effectievere isolatietechniek dan beide bovengenoemde ultracentrifugatiemethoden. De geïsoleerde producten kunnen specifieker zijn op basis van poriegroottes en hogere opbrengst15. De extra kracht die tijdens het filtratieproces wordt opgelopen, kan echter leiden tot de vervorming of uitbarsting van de EV's16.

De huidige paper stelde een kosten- en tijdseffectief benchtop-protocol voor het isoleren van MSC-afgeleide sEV's voor downstream-analyse en therapeutische doeleinden. De methode die in dit artikel wordt beschreven, combineerde een eenvoudige filtratiemethode met bench-top centrifugatie om hoogrenderende en kwalitatief goede EV's te isoleren van hUC-MSCs voor downstream-analyse, inclusief deeltjesgrootteanalyse, biomarkertest en elektronenmicroscopische beeldvorming.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OPMERKING: Zie de materiaaltabel voor meer informatie over alle materialen, apparatuur en software die in dit protocol worden gebruikt.

1. Menselijke navelstreng mesenchymale stamcellen en cultuur

  1. Kweek de hUC-MSCs met een zaaidichtheid van 5 × 103/cm2 in DMEM, aangevuld met 8% Human Platelet Lysate en 1% Pen-Strep. Incubeer de cellen bij 37 °C in 5% CO2. Vervang het celkweekmedium om de 3 dagen om een goede celgroei te garanderen.
  2. Breid de cellen uit tot doorgang 5 in T175-kolven voor sEV-isolatie.
    OPMERKING: Er zijn veel kolven nodig om een hoge opbrengst aan sEV's te oogsten (de opbrengst neemt toe met het aantal cellen).

2. Kleine extracellulaire vesikelisolatie van hUC - MSCs

  1. Vervang het kweekmedium door verse fenolrode vrije DMEM aangevuld met 1% Pen-Strep [Geconditioneerd medium (CM)] wanneer de cultuur 70%-80% confluentie bereikt bij passage 5.
    LET OP: Gebruik alleen basale media; vermijd FBS en humaan bloedplaatjeslysaatsupplement om besmetting door externe sEV's te voorkomen.
  2. Centrifugeer na 24 uur de CM bij 200 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C om celresten te verwijderen. Verzamel en filter het supernatant door een filter van 0,22 μm om deeltjes groter dan 220 nm te verwijderen.
  3. Vul de centrifugaalfiltereenheid met 30 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) gefilterd door een filter van 0,2 μm. Centrifugeer de centrifugaalfiltereenheid bij 3.500 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
  4. Vul de gefilterde CM in de centrifugaalfiltereenheid (het maximale volume van elke eenheid is 70 ml). Centrifugeer de CM bij 3.500 × g bij 4 °C.
    OPMERKING: De duur van de centrifugatie moet van tijd tot tijd worden gecontroleerd totdat de oplossing het oppervlak van het filter heeft bereikt.
  5. Gooi de oplossing weg in de beker met filtraatoplossing. Omgekeerd centrifugeren van de monsterfilterbeker met concentraatopvangbeker bij 1.000 x g bij 4 °C gedurende 2 minuten.
  6. Breng het geconcentreerde CM terug naar de centrifugaalfiltereenheid. Voeg 30 ml gefilterd PBS toe aan de centrifugaalfiltereenheid en centrifugeer de eenheid bij 3.500 × g bij 4 °C.
  7. Gooi de oplossing weg in de beker met filtraatoplossing. Installeer een concentraatopvangbeker op de filterunit en omgekeerd centrifugeren bij 1.000 × g gedurende 2 minuten bij 4 °C om de gezuiverde sEV's te verkrijgen.
  8. Filtreer de sEV's door een spuitfilter van 0,22 μm.
  9. Breng de monsters over in nieuwe buizen en bewaar ze bij -80 °C voor verdere analyse.

3. Karakterisering van hUC-MSC-sEV's

  1. Analyse van het volgen van nanodeeltjes
    1. Verdun de geïsoleerde hUC-MSC-sEV's in gefilterde PBS tot 20-100 deeltjes/frame.
    2. Breng 1 ml van het verdunde monster in de NTA-kamer met behulp van 1 ml wegwerpspuiten.
    3. Stel de meetinstellingen dienovereenkomstig in: stel het cameraniveau in op niveau 14, bepaal de detectiedrempel om zoveel mogelijk deeltjes op te nemen met de beperking dat 10-100 rode kruizen worden geteld, en het aantal blauwe kruisen is beperkt tot vijf.
    4. Neem voor elke meting vijf video's van 1 minuut op en analyseer ze met behulp van de NanoSight-software met een detectiedrempel van vijf.
    5. Voer metingen in drievoud uit voor elk monster.
  2. Western blotting analyse
    1. Lyseer de hUC-MSC-sEV's met ijskoude radioimmunoprecipitatietest (RIPA) lysisbuffer, incubeer gedurende 30 minuten bij 4 °C en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 4 °C bij 200 × g . Verzamel het supernatant.
    2. Kwantificeer het eiwit met behulp van een Bicinchoninic Acid (BCA) Protein Assay Kit. Stel de gelelektroforeseset dienovereenkomstig samen en voer gelelektroforese uit bij 90 V totdat het eiwit het uiteinde van de stapelgel bereikt. Verander de spanning naar 200 V om de eiwitten te scheiden tot het einde van de oplossende gel.
    3. Voer semidry-overdracht uit om de eiwitten van de gel over te brengen naar een polyvinylideendifluoride (PVDF) membraan bij 15 V gedurende 1 uur.
    4. Blokkeer het PVDF-membraan met 3% runderserumalbumine (BSA)/Tris-gebufferde zoutoplossing-0,1% v/v Tween 20 (TBS-T) gedurende 1 uur op een shaker bij kamertemperatuur. Incubeer het PVDF-membraan als volgt met primaire antilichamen: muis anti-CD 9 monoklonaal antilichaam (1:500), muis anti-CD 81 monoklonaal antilichaam (1:500), muis anti-GRP 94 monoklonaal muis anti-TSG 101 monoklonaal antilichaam (1:500) bij 4 °C 's nachts met constant schudden.
    5. Was de volgende dag het PVDF-membraan 5 x 5 minuten met TBS-T en incubeer verder met een secundair antilichaam: mierikswortelperoxidase-geconjugeerde muis IgG kappa bindend eiwit (m-IgGκ BP-HRP) (1:5.000) gedurende 1 uur met roeren bij kamertemperatuur.
    6. Nogmaals, was het PVDF-membraan vijf keer met TBS-T en visualiseer het membraan in een charge-coupled (CCD) imager met behulp van een chemiluminescentiedetectiereagens. Analyseer het expressieniveau van de eiwitten met behulp van ImageJ-software. Open eerst het afbeeldingsbestand in ImageJ (Bestand | Open...). Verbeter de kwaliteit van de afbeelding door de helderheid en het contrast aan te passen (Afbeelding | Aanpassen | Helderheid/contrast). Pas de afbeelding aan totdat de vlekken duidelijk zichtbaar zijn, klik op de knop Toepassen en sla de afbeeldingen op in TIFF-indeling (Bestand | Opslaan als | TIFF...).
  3. Transmissie elektronenmicroscoop
    1. Verdun een deel van het hUC-MSC-sEV-monster met vier delen gefilterd PBS tot een totaal volume van 10 μL en incubeer gedurende 15 minuten op een met koolstof bekleed koperen rooster.
    2. Verwijder overtollig monster met een laboratoriumdoekje en laat het 3 minuten aan de lucht drogen.
    3. Incubeer 10 μL 1% fosfotungstic acid (PTA) oplossing om het monster gedurende 3 minuten te kleuren.
    4. Verwijder overtollige 1% PTA-oplossing met een laboratoriumdoekje en laat het 3 minuten aan de lucht drogen.
    5. Gebruik het monster voor beeldvorming van transmissie-elektronenmicroscoop.
      OPMERKING: Raadpleeg afbeelding 1 voor de samengevatte schematische experimentstappen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Figuur 2 laat zien dat hUC-MSC-sEV's een deeltjesgroottemodus hebben bij 53 nm, terwijl andere significante pieken van deeltjesgrootte 96 en 115 nm waren. De concentratie hUC-MSC-sEV's gemeten door NTA was 7,75 × 1010 deeltjes / ml. De eiwitconcentratie van hUC-MSC-sEV's gemeten met de BCA-test was ongeveer 80 μg/ml.

In western blotting-analyse toonden hUC-MSC-sEV's positieve banden voor exosomale markers CD9, CD81 en TSG101, maar waren negatief voor GR...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

EV's zijn een van de belangrijke subsets van het secretoom in MSC's die een cruciale rol spelen tijdens normale en pathologische processen. Echter, sEV's, met een groottebereik tussen 30 en 200 nm, zijn het afgelopen decennium gestegen als een potentieel hulpmiddel voor celvrije therapie. Er werden verschillende technieken ontwikkeld om sEV's te isoleren van MSC's. Differentiële ultracentrifugatie, ultrafiltratie, precipitatie op basis van polymeren, immunoaffiniteitsafvang en op microfluïdica gebaseerde precipitatie heb...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling te hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De publicatie van deze video werd ondersteund door My CytoHealth Sdn. Bhd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
40% acrylamideNacalai Tesque06121-95Western blot
95% ethanolNacalai Tesque14710-25Desinfecteermiddelen
Absolute MethanolChemiz45081Om PVDF-membraan te activeren (Western blot)
AccutaseSTEMCELL Technologies7920Celdissociatie-enzym
ammoniumpersulfaatChemiz14475katalyseert de gelpolymerisatie (Gelelektroforese
anti-CD 81 (B-11)Santa Cruz Biotechnologysc-166029Antilichaam voor sEVs marker
anti-TSG 101 (C-2)Santa Cruz Biotechnologysc-7964Antilichaam voor sEVs marker
Runder serum albumineNacalai Tesque00653-31PVDF-membraan blokkeren
bromofenolblauwNacalai Tesque05808-61elektroforetische kleurmarkering
Centricon Plus-70 (100 kDa NMWL)MilliporeUFC710008sEVs isolatie
ChemiLumi One LNacalai Tesque7880chemiluminescentie detectie reagens
CryoStor Freezing MediaSigma-AldrichC3124-100MLCel cryopreserveren
Dulbecco’s gemodificeerd Eagle’s mediumNacalai Tesque08458-45Celcultuur media
ExcelBand Enhanced 3-kleurige High Range Protein MarkerSMOBIOPM2610Eiwit molecuulgewicht markers
Extra dik blottingpapierATTObuffer reservoir (Western blot)
GlycerolMerckG5516Chemicaliën voor western blot
Glycine1st BaseBIO-2085-500gChemicaliën voor buffer (Western Blot)
paardenradijs peroxidase-geconjugeerd muis IgG kappa binding eiwit (m-IgGκBP-HRP)Santa Cruz Biotechnologysc-516102Secundair antilichaam (Western Blot)
Human Wharton’s Jelly-afgeleide mesenchymale stamcellen (MSC's)Centre for Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Faculty of Medicine, The National University Malaysia
muis antilichamen anti-CD 9 (C-4)Santa Cruz Biotechnology sc-13118Antilichaam voor sEVs marker
Nanosight NS300 uitgerust met een CMOS-camera, een 20 × objectieflens, een blauwe lasermodule (488 nm), en NTA-software v3.2Malvern Panalytical, UK
paraformaldehydeNacalai Tesque02890-45Steekproeffixatie tijdens TEM
penicilline-streptomycineNacalai Tesque26253-84Antibioticum voor media
fenylmethylsulfonylfluorideNacalai Tesque27327-81Remt proteasen in de sEVs-monsters na toevoeging van lysisbuffer
fosfaatgebufferde zoutoplossingGibco10010023Wassen, monsterverdunning
polyvinylideenfluoride (PVDF) membraan met
0,45 mm poriegrootte		ATTOOm eiwit vast te houden tijdens eiwitoverdracht (Western blot)
protease inhibitor cocktailNacalai Tesque25955-11Remt proteasen in de sEVs-monsters na toevoeging van lysisbuffer
Protein Assay Bicinchoninaat KitNacalai Tesque06385-00Eiwitmeting
monsterbufferoplossing met 2-MENacalai Tesque30566-22Reductiemiddel voor western blot
natriumchlorideNacalai Tesque15266-64Chemicaliën voor western blot
natriumdodecylsulfaatNacalai Tesque31606-62ionogene oppervlakteactieve stof tijdens gelelektroforese
Tecnai G2 F20 S-TWIN transmissie-elektronenmicroscoopFEI, USA
tetramethylethyleendiamineNacalai Tesque33401-72chemie om gel te bereiden
tris-base1st BaseBIO-1400-500gChemische stoffen voor buffer (Western Blot)
 Tween 20GeneTexGTX30962Chemische stoffen voor western blot
UVP (Ultra Vision Product) CCD-imagerCCD-imager voor western blot signaaldetectie

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  2. Jayabalan, N., et al. Cross talk between adipose tissue and placenta in obese and gestational diabetes mellitus pregnancies via exosomes. Frontiers in Endocrinology. 8, 239(2017).
  3. Li, T., et al. Exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells alleviate liver fibrosis. Stem Cells and Development. 22 (6), 845-854 (2013).
  4. Wang, C., et al. Mesenchymal stromal cell-derived small extracellular vesicles induce ischemic neuroprotection by modulating leukocytes and specifically neutrophils. Stroke. 51 (6), 1825-1834 (2020).
  5. Wei, Y., et al. MSC-derived sEVs enhance patency and inhibit calcification of synthetic vascular grafts by immunomodulation in a rat model of hyperlipidemia. Biomaterials. 204, 13-24 (2019).
  6. Liu, W., et al. MSC-derived small extracellular vesicles overexpressing miR-20a promoted the osteointegration of porous titanium alloy by enhancing osteogenesis via targeting BAMBI. Stem Cell Research and Therapy. 12 (1), 1-16 (2021).
  7. Li, F. X. Z., et al. The role of mesenchymal stromal cells-derived small extracellular vesicles in diabetes and its chronic complications. Frontiers in Endocrinology. 12, 1741(2021).
  8. Jayabalan, N., et al. Frontiers in Endocrinology. 8, Front Endocrinol. Lausanne. (2017).
  9. Wei, Y., et al. Biomaterials. 204, Biomaterials. 13-24 (2019).
  10. Du, W., et al. Enhanced proangiogenic potential of mesenchymal stem cell-derived exosomes stimulated by a nitric oxide releasing polymer. Biomaterials. 133, 70-81 (2017).
  11. Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in exosome isolation techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).
  12. Nicolas, R. H., Goodwin, G. H. Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis. Cells. 8 (7), 727(2019).
  13. Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), 968-977 (2016).
  14. Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V. Strategies for isolation of exosomes. Cold Spring Harbor Protocol. 2015 (4), 319-323 (2015).
  15. Kırbaş, O. K., et al. Optimized isolation of extracellular vesicles from various organic sources using aqueous two-phase system. Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).
  16. Ev, B., Ms, K. Using exosomes, naturally-equipped nanocarriers, for drug delivery. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 219, 396-405 (2015).
  17. Dragovic, R. A., et al. Isolation of syncytiotrophoblast microvesicles and exosomes and their characterisation by multicolour flow cytometry and fluorescence Nanoparticle Tracking Analysis. Methods. 87, San Diego, Calif. 64-74 (2015).
  18. Tan, K. L., et al. Benchtop isolation and characterisation of small extracellular vesicles from human mesenchymal stem cells. Molecular Biotechnology. 63 (9), 780-791 (2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Ultrafiltratiemethodegeconditioneerd mediumnanopartikeltrackingBCA prote neassayWestern blottransmissie elektronenmicroscoopexosomale markers

Gerelateerde artikelen