Methodenartikel

Testen van epitheliale permeabiliteit bij foetale weefsel-afgeleide enteroïden

DOI:

10.3791/64108

⸱

16 juni 2022

 ,  ,  ,  , 
1Morsani College of Medicine, University of South Florida, 2Department of Pediatrics, Morsani College of Medicine, University of South Florida, 3Department of Molecular Pharmacology and Physiology, Morsani College of Medicine, University of South Florida

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft de oprichting van enteroïden, een driedimensionaal darmmodel, uit foetaal darmweefsel. Immunofluorescente beeldvorming van epitheliale biomarkers werd gebruikt voor modelkarakterisering. Apicale blootstelling van lipopolysacchariden, een bacterieel endotoxine, met behulp van micro-injectietechniek geïnduceerde epitheliale permeabiliteit op een dosisafhankelijke manier gemeten door de lekkage van fluorescerende dextran.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Van menselijk foetaal weefsel afgeleide enteroïden zijn in opkomst als een veelbelovend in vitro model om darmletsels bij te vroeg geboren baby's te bestuderen. Enteroïden vertonen polariteit, bestaande uit een lumen met een apicale rand, tight junctions en een basolaterale buitenlaag blootgesteld aan groeimedia. De gevolgen van darmletsels zijn onder meer slijmvliesontsteking en verhoogde permeabiliteit. Het testen van de darmdoorlaatbaarheid bij kwetsbare premature menselijke proefpersonen is vaak niet haalbaar. Er is dus een in vitro foetaal weefsel-afgeleid darmmodel nodig om darmletsels bij te vroeg geboren baby's te bestuderen. Enteroïden kunnen worden gebruikt om veranderingen in epitheliale permeabiliteit te testen, gereguleerd door tight junction-eiwitten. In enteroïden differentiëren darmstamcellen in alle epitheelceltypen en vormen ze een driedimensionale structuur op een keldermembraanmatrix die wordt uitgescheiden door muizensarcoomcellen. In dit artikel beschrijven we de methoden die worden gebruikt voor het vaststellen van enteroïden uit foetaal darmweefsel, het karakteriseren van de enteroïde tight junction-eiwitten met immunofluorescente beeldvorming en het testen van epitheliale permeabiliteit. Omdat gramnegatieve dominante bacteriële dysbiose een bekende risicofactor is voor darmletsel, gebruikten we lipopolysaccharide (LPS), een endotoxine geproduceerd door gramnegatieve bacteriën, om permeabiliteit in de enteroïden te induceren. Fluoresceïne-gelabelde dextran werd micro geïnjecteerd in het enteroïde lumen, en seriële dextran concentraties gelekt in de kweekmedia werden gemeten om de veranderingen in paracellulaire permeabiliteit te kwantificeren. Het experiment toonde aan dat apicale blootstelling aan LPS epitheliale permeabiliteit induceert op een concentratieafhankelijke manier. Deze bevindingen ondersteunen de hypothese dat gramnegatieve dominante dysbiose bijdraagt aan het mechanisme van darmletsel bij te vroeg geboren baby's.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Te vroeg geboren baby's worden blootgesteld aan frequente en langdurige ontstekingen waardoor ze een verhoogd risico lopen op darmletsel, wat resulteert in langdurige invaliditeit of overlijden1. Onderzoek op dit gebied wordt uitgedaagd door het beperkte vermogen om experimenten uit te voeren op kwetsbare te vroeg geboren baby's. Bovendien heeft een gebrek aan geschikte modellen de uitgebreide studie van het voortijdige darmmilieubelemmerd 2. Bestaande in vitro en in vivo modellen zijn er niet in geslaagd om de voortijdige menselijke darmomgeving volledig weer te geven. In het bijzonder vormen enkele epitheliale foetale cellijnen mogelijk geen tight junctions en diermodellen vertonen andere inflammatoire en immunologische reacties dan menselijke premature baby's. Met de ontdekking van Wnt-signalering als primaire route in de proliferatie en differentiatie van intestinale crypte stamcellen en de nieuwe Lgr5+ weefselstamcellen, werden van darmweefsel afgeleide organoïden zoals enteroïden en colonoïden vastgesteld als in vitro modellen 3,4,5. Met behulp van deze technologie is het mogelijk om driedimensionale (3D) enteroïde modellen te maken en te gebruiken die zijn ontwikkeld uit heel weefsel of biopsie van een darm om epitheliale reacties op de darmomgeving te bestuderen 6,7.

In tegenstelling tot typische darmcellijnen die in cultuur zijn gekweekt, vertonen enteroïden polariteit met een lumen verbonden door tight junction-eiwitten8. Dit maakt blootstelling aan de basolaterale rand in de groeimedia mogelijk, evenals luminale micro-injectie om de apicale rand te beoordelen. Verder vertonen enteroïden vergelijkbare genetische, fysiologische en immunologische kenmerken als het menselijke epitheel 9,10. Foetale weefsel-afgeleide enteroïden maken het mogelijk om de rol van prematuriteit op de epitheliale functie te onderzoeken. De unieke eigenschappen van enteroïden kunnen meer lijken op het premature darmmilieu9. Van weefsel afgeleide enteroïden kunnen worden gebruikt om te testen op tight junction-integriteit als een monolaagvorm of als 3D-structuren ingebed in een gestolde keldermembraaneiwitmengsel. Voor de laatste vorm is een micro-injectietechniek vereist als een apicale belichting gewenst is. De meting van epitheliale responsen in enteroïde modellen omvat genexpressie door RNA-sequencing, biomarkers door enzyme-linked immunoassay (ELISA) of geavanceerde beeldvormingstechnieken. De hier gepresenteerde techniek biedt een andere haalbare optie voor het meten van de bruto permeabiliteit met fluorometrie.

Darmletsel bij te vroeg geboren baby's heeft een multifactoriële pathogenese die de onbalans van de darmmicrobiële gemeenschap omvat. Enteroïden kunnen uitstekende modellen bieden om bepaalde aspecten van premature darmziekten te bestuderen, zoals necrotiserende enterocolitis waarbij epitheliale functies betrokken zijn11. Enteroïden vertonen vergelijkbare kenmerken als de menselijke foetale darm10. Het blootstellen van enteroïden aan lipopolysaccharide (LPS), een endotoxine geproduceerd door gramnegatieve bacteriën, in de kweekmedia als een basolaterale blootstelling induceert genexpressie die kan leiden tot verhoogde ontsteking en intestinale permeabiliteit7. Deze studie heeft tot doel de veranderingen in de bruto epitheliale permeabiliteit na apicale blootstelling aan bacteriële producten zoals LPS te evalueren. De resultaten kunnen inzicht geven in de microbe-epitheliale interacties die betrokken zijn bij de pathogenese van darmletsel. De methode die is ontworpen om de bruto-permeabiliteit te testen, vereist micro-injectie-instelling en vaardigheid.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De collectie menselijk weefsel werd goedgekeurd door de University of Washington Institutional Review Board (studie-ID: STUDY380 en CR ID: CR3603) en uitgevoerd door het Birth Defects Research Laboratory. Het Birth Defects Research Laboratory werd ondersteund door NIH-prijsnummer 5R24HD000836 van het Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development. De monsters werden verzameld van instemmende deelnemers en verzonden als gedeïdentificeerd en zonder enige gezondheidsinformatie. De dunne darmmonsters werden opgeslagen in ijskoude Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing (DPBS) en 's nachts naar het ontvangende laboratorium gestuurd.

1. Reagensbereiding

OPMERKING: Zie de tabel met materialen voor een lijst met reagentia en catalogusnummers; de aanbevolen volumes zijn voor een 6-wells plaat, tenzij anders vermeld.

  1. Bereid 0,1% runderserumalbumine (BSA) door 50 mg BSA-poeder op te lossen in 50 ml fosfaatbuffered zoutoplossing (PBS) met 100 μg / ml van een breedspectrumantibiotische primocine om al het plasticgoed en de tips die in contact komen met weefsels of enteroïden te coaten.
    1. Om te coaten met BSA, plaatst u niet-gefilterde pipetpunten in een conische buis van 50 ml met voldoende BSA om de uiteinden te bedekken, voegt u 1-2 ml BSA toe om het oppervlak van de petrischaal te bedekken of vult u 15 ml conische buizen met BSA gedurende ten minste 20-30 minuten bij kamertemperatuur voorafgaand aan gebruik.
  2. Bereid DPBS-media door 50 ml DPBS te mengen met 100 μg/ml primocine en 50 μg/ml gentamicine. Bereid deze media met en zonder 2,5 μg/ml amfotericine.
  3. Bereid enteroïde groeimedia door 2 ml organoïde groeimedium, 100 μg/ml primocine, 10 μM Y27632 en 2,5 μM CHIR99021 te mengen. Maak dagelijks verse media en verwarm deze in een celkweekincubator bij 37 °C.
    OPMERKING: De verdunningsfactor voor Y27632 is 1:250. Verdun voor CHIR99021 de CHIR-stamoplossing tot 1:100 in warme media en vervolgens tot 1:40 in enteroïde groeimedia om een verdunning van 1:4000 te bereiken.
  4. Bereid keldermembraanmatrixmix voor door aan de voorraad keldermembraanmatrix 10 μM Y27632 en 2,5 μM CHIR99021 toe te voegen. Maak in totaal 285 μL van de uiteindelijke keldermembraanmatrixmix bij een eiwitconcentratie van 8 mg / ml voor één put van een 6-wellsplaat.
    OPMERKING: Keldermembraanmatrix moet ijskoud zijn om in vloeibare vorm te blijven en zal stollen bij warmere temperaturen. De eiwitconcentratie van de voorraadkeldermembraanmatrix bepaalt het volume dat nodig is om een uiteindelijke eiwitconcentratie van 8 mg / ml te maken met behulp van de vergelijking:
    Volume 1 × Concentratie 1 = Volume 2 × Concentratie 2
  5. Bereid 4% paraformaldehyde (PFA) door de 32% voorraad PFA in PBS met 1:8 te verdunnen en bij kamertemperatuur te bewaren. Maak 0,5 ml voor elke put van enteroïden die moet worden gefixeerd.
  6. Bereid de blokkerende buffer voor door 5% geitenserum en 0,5% Triton X-100 in PBS toe te voegen. Bereid 1 ml voor het eerste antilichaam per put en 0,5 ml voor het extra antilichaam per put.
    OPMERKING: Gebruik serum van dezelfde soort als de gastheer van de secundaire antilichamen
  7. Bereid primaire en secundaire antilichamen, verdund in blokkerende buffer in de door de fabrikant aanbevolen concentratie voor elk antilichaam.
  8. Bereid 5 μg/ml Dmidino-2-fenylindool (DAPI) door verdunning tot 1:200 van 1 mg/ml stamoplossing in PBS. Maak 0,5 ml per putje gekleurde enteroïden.
  9. Bereid 70% glycerol in PBS en maak 0,5 ml voor het monteren van de enteroïden op microscoopglaasjes.
  10. Bereid 5 mg/ml dextran-FITC (fluoresceïne-isothiocyanaat) door de 25 mg/ml stamoplossing in PBS te verdunnen met een verhouding van 1:5. Maak 20 μL voor micro-injectie.
  11. Bereid lipopolysacchariden (LPS) en dextran-FITC door het LPS-poeder in PBS te reconstitueren tot een 5 mg/ml stockoplossing. Verdunde stamoplossingen van LPS en dextran in PBS tot 0,1 mg/ml en 0,5 mg/ml LPS en 5 mg/ml dextran-FITC. Maak 20 μL voor micro-injectie.
  12. Bereid ethyleenglycol-bis (β-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetra-azijnzuur (EGTA) door een stamoplossing van 0,2 M te maken door EGTA-poeder op te lossen in gedestilleerd water en de pH aan te passen aan ongeveer 8 met behulp van zoutzuur (HCl). Bereid een testconcentratie van 2 mM in kweekmedia voor door een verdunning van 1:100 uit te voeren.

2. Verzameling van specimens

  1. Zodra de monsters zijn ontvangen, voert u epitheelcelisolatie en -beplating uit binnen 24 uur na de monsterverzameling.

3. Intestinale epitheelcelplating in keldermembraanmatrix van hele monsters

OPMERKING: Deze procedure volgt op gewijzigde protocollen van het Translational Tissue Modeling Laboratory aan de Universiteit van Michigan 12,13,14. Het gebruik van groeimedia met een hoge Wnt-factor levert consistente resultaten op voor enteroïde vestiging. Zodra de enteroïden zijn vastgesteld, gebruikt u dezelfde media met een hoge Wnt-factor om de enteroïden naar bolvormige vormen te drijven voor micro-injectie.

  1. Breng de darmsegmenten over in een petrischaaltje van 60 mm x 15 mm met ijskoude DPBS met amfotericine en laat 20 minuten weken op ijs. Terwijl het weefsel doorweekt, identificeert u de regio's (twaalfvingerige darm, jejunum of ileum) van de dunne darm en verwijdert u het bindweefsel en de bloedvaten met een tang en een schaar. Was het lumengehalte indien nodig uit met een kleine naald van 23-25 G en een spuit van 3 ml zonder het epitheel te verstoren.
  2. Snijd de darmsegmenten in stukken van 3-5 mm met behulp van een scalpel en plaats 1-2 stukjes (voor beplating in een putje van een 6-well plaat) in een petrischaal van 35 mm x 15 mm die 0,5-1 ml organoïde groeimedium op ijs bevat.
  3. Met behulp van een ontleedmicroschaar en tang knipt u de darmbuis in de lengterichting door. Gebruik de tip van de tang om de epitheelcellen van de fascia te schrapen onder een 10x stereomicroscoop. Verwijder de fascia en draai de schaal om de klonten cellen te breken.
  4. Gebruik een 20 μL pipet gesneden tip om de cellen en media in stappen van 5-10 μL over te brengen naar de keldermembraanmatrixmix om een 285 μL-oplossing te maken bij een matrixeiwitconcentratie van 8 mg / ml. Pipetteer langzaam op en neer 20x om cellen in keldermembraanmatrix op ijs te mengen met behulp van een 200 μL gesneden punt.
  5. Plaats vijf stroken van 50 μL van het celkeldermembraanmatrixmengsel in één putje van een voorverwarmde 6-well plaat op een warme schuimsteen. Incubeer de plaat in de celkweekincubator bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 10 minuten om de keldermembraanmatrix te laten polymeriseren en uitharden.
  6. Voeg 2 ml van de enteroïde groeimedia toe aan de put van de gestolde keldermembraanmatrixstrips en plaats terug in de celkweekincubator. Verander de media dagelijks om de enteroïde groei te stimuleren. Controleer dagelijks op intestinale stamceldifferentiatie onder een 10x omgekeerde microscoop.
  7. Na 10-14 dagen, passeer de enteroïden in een put van een 12-well of 6-well plaat, afhankelijk van de enteroïde dichtheid. Begin om de dag met het veranderen van de media en passeer in een verhouding van 1: 2 om de 5-7 dagen als de enteroïden beginnen te gedijen.
    1. Verwijder de cellen die niet differentiëren in enteroïden met de keldermembraanmatrixlaag tijdens passages. Maak een bevroren voorraad enteroïden met een lage doorgang door ze in te vriezen in 80% groeimedia, 10% foetaal runderserum (FBS) en 10% dimethylsulfoxide (DMSO), indien nodig.

4. Immunofluorescente kleuring van enteroïden

OPMERKING: Het proces van fixeren en beitsen duurt 3 dagen. In dit protocol hebben we gefixeerd en gekleurd voor kernen (DAPI), epitheliale markers (villine, CDX2), lysozym, mucine en tight junction-eiwitten (claudine 2, claudine 3, occludin, zonula occluden-1) met behulp van een gewijzigd protocol15. Fluorescerende beelden werden gemaakt door een confocale microscoop.

  1. Vaststelling
    OPMERKING: Dit proces wordt meestal tegelijkertijd met de enteroïde passage of bevriezingsprocedure uitgevoerd.
    1. Leg de enteroïde plaat op ijs. Verwijder de groeimedia en was 2x voorzichtig met koude DPBS.
    2. Identificeer de enteroïden die moeten worden gefixeerd en gekleurd. Breng ze over op een 12-wells plaat door ze voorzichtig te pipetteren met een 200 μL gesneden punt of met behulp van een 1 μL inenterende lus. Plaats enteroïden in afzonderlijke putjes als kleuring met verschillende antilichamen moet worden gedaan.
    3. Verwijder zoveel mogelijk vloeistof met een tip van 200 μL zonder de enteroïden te verstoren. Voeg 0,5 ml 4% PFA toe en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Draai de plaat af en toe om het losmaken van de enteroïden uit de keldermembraanmatrix te vergemakkelijken.
    4. Onderzoek grof om het loslating van de enteroïden van de keldermembraanmatrix te bepalen. Zuig de vloeibare PFA voorzichtig op en gooi deze weg zonder de enteroïden te verstoren. Wassen met PBS 3x om PFA en eventuele resterende keldermembraanmatrix te verwijderen
      OPMERKING: Het opzuigen van de vloeistof onder een stereomicroscoop kan nuttig zijn om de enteroïden te vermijden. Vaste enteroïden kunnen maximaal 1 maand in PBS bij 4 °C worden bewaard.
  2. Blokkeren
    1. Verwijder de resterende PBS voorzichtig met een pipet van 200 μL, zonder de enteroïden te verstoren. Voeg 0,5 ml blokkeerbuffer toe en incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
    2. Verwijder en gooi de blokkerende buffer weg met een pipet van 200 μL, waarbij u voorzichtig bent om te voorkomen dat de enteroïden worden verstoord.
  3. Antilichaamkleuring
    1. Voeg 500 μL primair antilichaam in blokkerende buffer toe aan elke put met enteroïden. Voor primaire antilichamen en voor lysozym is de verdunningsfactor 1:100, voor CDX2 is de verdunningsfactor 1:100 en voor villine is de verdunningsfactor 1:50. Incubeer bij 4 °C 's nachts.
    2. Verwijder de volgende dag de antilichaamoplossing en was 3x met PBS. Laat 10-15 minuten incubatietijd voor elke wasbeurt.
    3. Herhaal stap 4.3.1.-4.3.2. voor het secundaire antilichaam met een verdunningsfactor van 1:400.
    4. Voeg 500 μL DAPI toe bij 5 μg/ml in PBS en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Na incubatie, was 3x met PBS en laat 10-15 minuten incubatietijd voor elke wasbeurt
  4. Montage
    1. Verwijder zoveel mogelijk PBS. Was de gekleurde enteroïden met 70% glycerol 1x.
    2. Til de enteroïden uit de plaat met behulp van een inentingslus van 1 μL of een gesneden tip van 200 μL en monteer met 70% glycerol op een glazen microscoopglaasje.
    3. Om de 3D-structuur van de enteroïden te behouden, zorgt u voor een ruimte van 0,5-1 mm tussen de onderste glasplaat en de afdekplaat. Gebruik uitsparingen van dunne siliconenrubberen plaat of glazen afdekplaat om een ruimte te creëren tussen de glasplaat en de afdekplaat. De enteroïden kunnen nu worden afgebeeld met een confocale microscoop.

5. Voorbereiding voor micro-injectie van enteroïden

OPMERKING: Het micro-injectieprotocol is een aangepast protocol van Hill et al.16 om aan te sluiten bij de bronnen en instellingen. Sommige voorbereidingsstappen moeten een paar dagen van tevoren worden voltooid.

  1. De instelling van de micro-injectie instellen
    1. Plaats het microinjectorapparaat in een bioveiligheidskast of op een schone toonbank, afhankelijk van het doel van de experimenten, als volgt: een stereomicroscoop om te bekijken, een micromanipulator met X-, Y- en Z-asbesturingsknollen gemonteerd op een zware standaard naast de microscoop, een micropipettehouder gemonteerd op de micromanipulatorarm, een micro-injectorbuis die de micropipettehouder verbindt en een spuit met een driewegstop, vervolgens naar een pneumatische pomp en een wandluchtbron die op de pomp is aangesloten (figuur 1).
    2. Desinfecteer het microinjectieapparaat met 70% ethanol voorafgaand aan experimenteel gebruik en daarna. Test de positionering van de microscoop en micromanipulator om aan de gewenste fysieke specificaties te voldoen, inclusief het verplaatsen van de asknoppen om ervoor te zorgen dat de micropipette het beoogde monster kan bereiken.
  2. Bereiding van de micropipette
    OPMERKING: Voer deze stappen van tevoren uit.
    1. Gebruik een micropipettetrekker om de glazen capillaire buisjes in de micropipettes te trekken.
    2. Plaats onder de stereomicroscoop de micropipette op een horizontale micropipettehouder (figuur 2), concentreer je op de uiteinden en knip de uiteinden met een microschaar terwijl je door de microscoop oculairs kijkt. Bereid ongeveer 10-15 micropipettes voor op een vergelijkbare tipgrootte voor elk experiment.
    3. Test de tipgrootte door 0,5-1 μL vloeistof op te trekken en tel hoeveel pompen nodig zijn om het volume te legen. Test verschillende tipgroottes om de juiste grootte voor het experiment te vinden. Een geschikte tipgrootte werpt ongeveer 10-30 nL volume per pomp uit.
    4. Bewaar de geslepen glazen micropipettes in een schone doos of buis zonder de uiteinden te beschadigen.
      OPMERKING: Voorgesneden micropipettes zijn in de handel verkrijgbaar.
  3. Enteroïde voorbereiding
    1. Plaats een plaat van meestal grote en bolvormige enteroïden op ijs. Vervang het oude groeimedium door vers medium.
    2. Dissociëer de matrixpunten van het keldermembraan voorzichtig van de plaat met een celheffer. Draai de gelpunten van links naar rechts op ijs om de keldermembraanmatrix te breken zonder de enteroïden te storen.
    3. Selecteer ongeveer 10-15 bolvormige enteroïden met een gesneden pipetpunt van 20 μL onder een stereomicroscoop en voeg toe aan de keldermembraanmatrix om 285 μL eiwitconcentratiemengsel van 8 mg / ml te maken.
    4. Pipetteer voorzichtig op en neer met een gesneden punt van 200 μL om de enteroïden te mengen zonder ze te breken. Plaat vijf 50 μL gel stippen in het midden van een ronde 35 mm x 10 mm celkweek petrischaal of een met vergelijkbare afmetingen.
    5. Incubeer de enteroïde gelpunten bij 37 °C gedurende 10 minuten om te stollen. Voeg vervolgens 1 ml vers groeimedium toe aan het gerecht. Incubeer de enteroïden gedurende ten minste 2-3 dagen voor stabilisatie en totdat de enteroïden een geschikte grootte van 0,5-1 μL bereiken.
      OPMERKING: Het is belangrijk om een schaal te hebben met een lage wand voor gemakkelijkere toegang tot de enteroïden en een kleine diameter voor minder volume groeimedium.
  4. Micro-injectie van dextran-FITC en getest materiaal
    1. Schakel de driewegstopkraan uit naar de pneumatische pomp. Vul de micropipette met het geïnjecteerde materiaal, in dit geval dextran-FITC met of zonder LPS.
    2. Maak een petrischaaltje bedekt met een strook transparante film. Plaats twee tot vier stippen van 1 μL geïnjecteerd materiaal op de film.
    3. Gebruik de micromanipulator om de punt van de micropipette naar net binnen de vloeistof te brengen, maar boven de film onder de visualisatie van een stereomicroscoop. Trek voorzichtig aan de spuit om het geïnjecteerde materiaal in de micropipette op te zuigen.
    4. Vul de micropipette met 2-4 μL geïnjecteerd materiaal en druk op de spuit om eventuele lucht aan de punt van de micropipette te verwijderen. Inspecteer de geïnjecteerde materiaalkolom in de micropipette om er zeker van te zijn dat er geen luchtzak is. Noteer het volume geïnjecteerd materiaal dat zich in de micropipette heeft teruggetrokken.
      OPMERKING: De vloeistof is zichtbaar in een groenachtige kleur als gevolg van dextran-FITC.
    5. Schakel de luchtbron in die is aangesloten op de pneumatische pomp, die een luchtdruk van ongeveer 60 psi levert. Schakel de pomp in en stel de pompduur in op 10-15 ms. Draai de stopkraan op de spuit om de lijn van de pomp naar de micropipette te openen.
      LET OP: Door de langere pompduur kan er meer materiaal per pomp vrijkomen. Het wordt aanbevolen om dezelfde pompduur en micropipettes met vergelijkbare tipgroottes te gebruiken voor het hele experiment voor schatting van het geïnjecteerde volume.
    6. Verwijder de enteroïden uit de celkweekincubator en plaats de schotels op een warmschuimsteen in een afgedekte container om de blootstelling aan licht na micro-injectie te beperken.
    7. Plaats de petrischaal met enteroïden onder de stereomicroscoop en beweeg de micromanipulatorknoppen om de punt van de micropipette in een hoek van ongeveer 35°-45° ten opzichte van het horizontale oppervlak te plaatsen (figuur 3). Dit vergt enige oefening vooraf.
    8. Visualiseer en breng de enteroïden in elke petrischaal onder de microscoop in kaart om een plan te maken voor het injecteren van ongeveer 3-5 bolvormige enteroïden per gerecht.
    9. Zodra de punt van de micropipette zich dicht bij het vloeibare oppervlak bevindt, kijkt u in de microscoop-oculairs om de punt naar de beoogde enteroïde te brengen.
    10. Prik de enteroid door met de micropipettepunt door de z-asknop te bewegen met een nauwkeurige langzame beweging. De enteroïde wand zal indrukken en terugspringen zodra de punt door het enteroïde oppervlak gaat, op welk moment de vooruitgang zou moeten stoppen.
    11. Tik met één voet op het pomppedaal en vul de enteroid met de groenachtige dextran-FITC-oplossing totdat deze iets is uitgerekt. Noteer het aantal pompen om het verpompte volume en de dextranconcentratie te berekenen.
    12. Trek de punt van de micropipette terug na het voltooien van de microinjectie en ga naar de volgende enteroïde. Met oefening kan het proces soepel verlopen.
      1. Als de punt breekt, vervang deze dan door een andere micropipette met een vergelijkbare tipgrootte. Trek voldoende volume geïnjecteerd materiaal voor alle enteroïden in dezelfde blootstellingsgroep en vervang de micropipette tussen geïnjecteerde materialen om kruisbesmetting te voorkomen.
    13. Plaats de geïnjecteerde enteroïde schaal onder afdekking om blootstelling aan licht te voorkomen.
  5. Dextran-FITC inzameling en meting
    1. Verwijder na de micro-injectieprocedure onmiddellijk de kweekmedia. Wassen met verse groeimedia 2x om eventuele resterende dextran-FITC te verwijderen. Voeg nieuwe media toe en noteer de tijd als tijd 0 na micro-injectie.
      OPMERKING: Mogelijk hebt u een tweede persoon nodig om deze stap uit te voeren zonder het micro-injectieproces te verstoren.
    2. Verzamel 200 μL kweekmedia in een ondoorzichtige microfugebuis van 0,5 ml en vervang vervolgens de verwijderde kweekmedia door hetzelfde volume verse groeimedia op 1 uur, 2 uur, 4 uur, 6 uur, 8 uur, 10 uur en 12 uur na micro-injecties.
      OPMERKING: Het tijdsinterval kan variëren afhankelijk van het experiment. Bij een basolaterale blootstelling moeten de vervangende media de blootstelling in dezelfde concentratie bevatten.
    3. Bewaar de verzamelde kweekmedia bij 4 °C en meet de dextranconcentratie binnen 24 uur. Bewaar overgebleven media bij −80 °C voor andere analyses. Aan het einde van de kweekmediaverzameling oogst u de enteroïden voor RNA-extractie of beeldvorming, indien nodig.
    4. Meet dextran-FITC-concentraties met een fluorescentiemicroplaatlezer. Construeer een standaardcurve voor elke plaat met behulp van seriële verdunningen en door een lineaire regressielijn aan te brengen zoals weergegeven in figuur 4.
    5. Corrigeer de absorptie voor het verwijderde volume van kweekmedia met dextran die werd vervangen door verse groeimedia zonder dextran als volgt: verwijdering van 200 μL uit 2 ml kweekmedia is 10 volumeprocent.
      Gecorrigeerde absorptie bij 2 h = (absorptie bij 1 h x 10%) + gemeten absorptie bij 2 h
      Absorptie van het eerste gecorrigeerde medium hoeft niet te worden gecorrigeerd. Bereken vervolgens de dextranconcentratie op basis van de gecorrigeerde absorptiewaarde met behulp van de standaardcurvevergelijking.
    6. Deel voor normalisatie de dextranconcentratie door het totale aantal pompen voor elke petrischaal en vermenigvuldig vervolgens met het grootste totale aantal pompen per schotel.
      OPMERKING: Alle blootstellingen worden uitgevoerd in drievoud (drie petrischalen per blootstelling met 3-5 micro geïnjecteerde enteroïden per gerecht). De gemiddelde waarden van de drielicaten worden vergeleken tussen blootstellingen met behulp van de t-test van een student.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We hebben een enteroïde cellijn vastgesteld van gedoneerd foetaal ileumweefsel volgens aangepaste protocollen van onze medewerkers van het Translational Tissue Modeling Laboratory12 van de Universiteit van Michigan. De enteroïde cellijn testte negatief op Mycoplasma-infectie . De enteroïden kleurden positief voor villine, CDX2, lysozym, mucine, claudine, occludin en zonula-occluden 1 (figuur 5), wat hun epitheliale oorsprong van de dunne darm bevestigt. De enteroïden werden micro geïnjecteerd met 4 kDa dextran-FITC bij 5 mg/ml in PBS (figuur 6). De testblootstellingen waren LPS in verschillende concentraties, 0,1 mg/ml en 0,5 mg/ml, gemengd met dextran-FITC voor apicale blootstelling. Als positieve controle gebruikten we 2 mM EGTA en voegden deze toe aan de kweekmedia op 4 uur na micro-injectie van dextran. EGTA is een calciumchelator die de doorlaatbaarheid van tight junctions verhoogt. De negatieve controles werden micro-geïnjecteerd met dextran-FITC in PBS alleen. Voor basolaterale blootstelling hadden de vervangende media voor seriële kweekmediaverzameling dezelfde concentratie van de blootstelling (d.w.z. 2 mM EGTA). De resultaten tonen een duidelijke toename van de dextranconcentratie in kweekmedia na de toevoeging van EGTA in vergelijking met de negatieve controle, PBS. Apicale blootstelling aan LPS veroorzaakte een hogere permeabiliteit van dextran vanaf ongeveer 8 uur na blootstelling op een concentratieafhankelijke manier (figuur 7).

figure-results-1
Figuur 1: Micro-injector instellen. De opstelling omvat een stereomicroscoop, micromanipulator gemonteerd op een magnetische standaard op een zware stalen basisplaat, een micropipettehouder verbonden met een spuit met een driewegstopkraan en een pneumatische pomp. De wandluchttoevoer zorgt voor de luchtdruk, die door de pomp wordt geregeld om een consistent pompvolume te genereren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Horizontale micropipettehouder. Dit plastic platform is ontworpen om de micropipette vast te houden na het trekken van de glazen capillaire buis voor het snijden van de punt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Micropipette positionering. Een hoek van 35°-45° is ideaal voor het injecteren van enteroïden in het midden van de petrischaal. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Dextran standaardcurve. De curve werd geconstrueerd met fluorescerende absorptie van 10 seriële verdunningen van dextran in duplicaten. Een lineaire regressielijn werd aangebracht om een regressievergelijking te genereren. De foutbalken zijn SEM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Fluorescerende biomarkers van enteroïden. DAPI voor kernvlek is blauw. De volgende biomarkers worden getoond: (A) villin, (B) CDX2, (C) lysozyme, (D) mucine, (E) claudin, (F) occluding en (G) zonula-occluden 1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-6
Figuur 6: Enteroïden in verschillende stadia. (A) Een enteroïde van 7-10 dagen oud is klein en met een dikke wand. (B) Een enteroïde die klaar is voor micro-injectie met een groot formaat, een lumen en een denkwand, en (C) fluorescerende dextran-FITC in een enteroïde 2 dagen na micro-injectie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-7
Figuur 7: Permeabiliteit van dextran-FITC na micro-injectie. (A) De gemeten dextranspiegels in de media waren hoger na de toevoeging van EGTA in vergelijking met PBS. (B) Micro geïnjecteerde 0,5 mg/ml LPS veroorzaakte een grotere lekkage van dextran uit het enteroïde lumen in de media dan micro geïnjecteerde 0,1 mg/ml LPS vanaf 8 uur na injectie. *p-waarde < 0,05, foutbalken zijn SEM, n = 3, de t-toets van een student werd gebruikt om significantie te berekenen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft de vaststelling van enteroïden uit foetaal darmweefsel, evenals modelkarakterisering met immunofluorescente kleuring en epitheliale permeabiliteitstests. De permeabiliteit van de enteroïden werd getest met behulp van een micro-injectietechniek en seriële tijdsmetingen van gelekte dextran-FITC-concentratie in de kweekmedia. De nieuwigheid van dit protocol is de apicale blootstelling die meer lijkt op de menselijke darmfysiologie in vergelijking met basolaterale blootstelling in de kweekmedia7. In eerdere studies gebruikten Hill et al. seriële beeldvorming en berekening van de fluorescentie-intensiteit in de loop van de tijd16. Ares et al. stelden het basolaterale membraan van een epitheelmodel bloot aan LPS en vergeleken vervolgens het cellulaire genexpressiepatroon7. Ter vergelijking: we gebruiken apicale blootstelling van de geteste reagentia en onderzoeken vervolgens mogelijke veranderingen in de bruto permeabiliteit door seriële concentraties van gelekte dextran in de kweekmedia te meten. Onze methode maakt ook seriële vergelijkende analyse mogelijk van cytokines geproduceerd door epitheelcellen in kweekmedia en genexpressie door cellulair mRNA te verzamelen. LPS is vaak gebruikt om darmletsel in dier- en in vitro modellen te bestuderen vanwege het vermogen om permeabiliteit en ontsteking te induceren 7,17. Toen LPS in dit model werd getest, werd de epitheliale permeabiliteit gedifferentieerd door de blootstellingsconcentratie. Dit protocol kan worden uitgebreid om andere ziektepathologieën te bestuderen met behulp van verschillende micro-geïnjecteerde materialen en uitkomstmetingen.

Kritieke stappen in dit protocol omvatten het vaststellen van enteroïden uit foetale darmweefsels, enteroïde karakterisering en de micro-injectietechniek. De integriteit van dit onderzoek hangt af van nauwkeurige celbemonstering. Het gebruik van anatomische oriëntatiepunten en bloedvaten is nuttig om de selectie van dunne darmcellen te garanderen. Vanwege de robuuste groei en differentiatie van foetale darmstamcellen is een uitgebreide procedure om de stamcellen te isoleren van andere epitheelcellen niet nodig. Nadat de enteroïden zijn vastgesteld, is het belangrijk om de kenmerken van het model te bevestigen door kleuring voor eiwitten en celmarkers. In dit protocol werden de enteroïden gekleurd voor enterocyten met villine en CDX2, Paneth-cellen met lysozym en bokaalcellen met mucine, alle cellen die worden aangetroffen in het epitheel van de dunne darm 18,19,20. In tegenstelling tot traditionele eencellige lijnen die één celtype weergeven, stellen enteroïden alle celtypen vast uit de intestinale voorloperstamcellen8. Het kleuringsgedeelte van dit protocol kan worden aangepast voor de specifieke cellulaire markers van belang. Cruciaal voor de betrouwbaarheid van dit protocol is de micro-injectietechniek. De consistentie van de micropipettetips kan worden geverifieerd door het volume per pomp te meten met behulp van dextran-FITC-oplossing en de diameter van de tips onder de microscoop te visualiseren. Vanwege het risico op besmetting kan dezelfde micropipette niet voor meer dan één blootstelling worden gebruikt. Bovendien kan de vorm en groei van de enteroïden worden beïnvloed door de inhoud van hun groeimedia. We ontdekten dat de bolvormige in plaats van bloemkoolvormige enteroïden betere modellen voor micro-injectie leverden. De bolvorm kan worden geïnduceerd door een grotere Wnt-factor in de media21.

Dit protocol hangt grotendeels af van de vaardigheid van de performer in micro-injectie om variaties te verminderen, vooral in tijdgevoelige metingen. Variaties kunnen worden geminimaliseerd door dezelfde ervaren performer te hebben met consistente technieken, dezelfde celoorsprong te gebruiken om genetische variatie te voorkomen, op dezelfde passage te testen om volwassenheidsbias te verwijderen en de cellen in hetzelfde type media te laten groeien voor vergelijkbare celdifferentiatie. De componenten van de groeimedia kunnen in vitro een wisselende differentiatie van stamcellen induceren in plaats van in een in vivo omgeving. In vivo wordt lysozym bijvoorbeeld pas tot expressie gebracht in week 22-24 van de zwangerschapsontwikkeling wanneer Paneth-cellen zich vormen en functioneel worden22. We waren echter in staat om lysozym te detecteren in onze enteroïden die zijn vastgesteld uit foetale darmen van 10 weken. Deze methode kan het aantal geteste blootstellingen in één keer beperken vanwege de hoge technische vaardigheid die vereist is voor micro-injectie. De dextranlekkage uit het microinjectiepunctiegat kan de beoordeling van de permeabiliteit beïnvloeden. Om dit effect te elimineren, worden drievoudige wasbeurten onmiddellijk na de micro-injectie aanbevolen om resterende dextran uit de procedure te verwijderen. De dextranconcentratie in de media moet per uur worden gemeten gedurende 4-6 uur na microinjectie. Experimenten met een significante stijging van de dextranconcentratie binnen 2-4 uur na injectie moeten van de eindanalyse worden uitgesloten.

Deze methode heeft verschillende voordelen. Het vereist lagere kosten en minder middelen in vergelijking met enteroïde-afgeleide monolagen op transwell. Bovendien kan het worden uitgebreid naar andere blootstellingen zoals levende bacteriën of virussen om de initiële interactie tussen darmmicroben en het epitheel te bestuderen. Het ingesloten lumen van de enteroïde kan een stabiele groei van micro-geïnjecteerde levende bacteriën handhaven zonder besmetting van de groeimedia13. In tegenstelling tot de monolaag die wordt blootgesteld aan groeimedia en incubatiezuurstof, is het ingesloten lumen een krappe, geïsoleerde ruimte. Een gesloten lumen zorgt voor geen communicatie met de groeimedia en een luminaal zuurstofgehalte dat in de loop van de tijd lager is met levende bacteriegroei13.

Het gebruik van foetaal darmweefsel geeft het darmepitheel van te vroeg geboren baby's nauwkeuriger weer in vergelijking met volwassen darmstamcellen of diermodellen7. Verder maakt de polariteit van enteroïden zowel apicale als basolaterale blootstellingen en metingen mogelijk23. De enteroïden vormen een ingesloten lumen met een lagere oxygenatieconcentratie, die de oxygenatieconcentratie van de darmen beter nabootst24. In tegenstelling tot meer technologisch geavanceerde protocollen16, zorgt het gebruik van bruto mediametingen voor een grotere toegankelijkheid van deze techniek. Het experiment toonde aan dat epitheliale lekkage kan worden geïnduceerd door apicale blootstelling aan LPS en concentratieafhankelijk is. Omdat deze methode de veranderingen in de gelekte concentratie van dextran onderzoekt, is het nuttig voor het detecteren van grove functionele veranderingen in tight junctions. Messenger RNA-verzameling en sequencing van de blootgestelde enteroïden en western blot-analyse kunnen de analyse van de bruto functionele veranderingen aanvullen. Dit model bestudeert de integriteit van het darmepitheel in een systeem dat sterk lijkt op de premature omgeving en dus kan worden gebruikt om een beter begrip te krijgen van te vroeg geboren darmletsels en andere ziektepathologieën.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle auteurs verklaren dat ze geen belangenconflicten hebben om bekend te maken.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We bedanken Dr. Ian Glass en het personeel van het Birth Defects Research Laboratory aan de Universiteit van Washington voor het delen van de foetale weefsels. We bedanken ook Dr. Michael Dame en Dr. Jason Spence van het Translational Tissue Modeling Laboratory aan de Universiteit van Michigan voor hun eindeloze ondersteuning en begeleiding tijdens het hele proces.

Materialen

```html

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Amphotericin 250 uL/mLGibco15-290-026
Anti-CDX-2 [CDX2-88] 0.5mL geconcentreerd Muis, IgG, monoklonaalBiogenexMU392A-5UC
Anti-Claudin 2 antilichaam (ab53032)abcamab53032
Anti-Claudin 3 antilichaam (ab15102)abcamab15102
Anti-LYZ antilichaam geproduceerd in konijnMillipore SigmaHPA066182-100UL
Anti-Mucin 2/MUC2 Antilichaam (F-2): sc-515032Santa Cruzsc-515032
Anti-Villin, Clone VIL1/4107R 0.5mL geconcentreerd Konijn, IgG, monoklonaalBiogenexNUA42-5UC
Bovien Serum Albumine (BSA)Millipore SigmaA8806
Celcultuur platen, CytoOne 12-well niet-behandelde platenUSA Scientific Inc50-754-1395
Celcultuur platen, CytoOne 6-well niet-behandelde platenUSA Scientific Inc50-754-1560
Centrifuge met 15 mL buisjesEppendorf05-413-110
CHIR 99021Tocris Bioscience4423
Confocale microscoopOlympus FV1200N/AOf een soortgelijke microscoop
Kegelvormige centrifugeerbuisjes, 15 mlFalcon05-527-90
Dekglas voor microscoopglazenFisher Scientific12-544-DP
WeggeefscalpelsMopec22-444-272
Dmidino-2-fenylindool (DAPI) Oplossing (1 mg/mL)Fisher Scientific62248
Dulbecco's Fosfaat-gebufferde Saline (DPBS, 1X)Fisher ScientificAAJ67802K2
Ethyleenglycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraazijnzuur tetranatriumzout (EGTA)Millipore SigmaE8145-10G
Fluoresceïne isothiocyanate dextran (Dextran-FITC) 4 kDaMillipore Sigma46944
Fluorescentie microplaat lezerAgilent BioTekSynergy HTX
Gentamicine 50 mg/mLGibco15-750-060
Glas capillaire buisjes, enkelvat borosilicaat, 1x0.5mm, 6" (gesneden in helft voordat geplooid)A-M systems626500
Geit anti-Muis IgG (H+L) Hoog-geadsorbeerde secundaire Antilichaam, Alexa Fluor Plus 594Fisher ScientificA32742
Geit anti-Konijn IgG (H+L) Hoog-geadsorbeerde secundaire Antilichaam, Alexa Fluor Plus 488Fisher ScientificA32731
GeitenserumFisher Scientific16210064
ImageJ softwareNIHN/Ahttps://imagej.nih.gov/ij/download.html
IntestiCult Organoïde Groei Medium (Huis)Stem Cell Technologies06010
Lipopolysacchariden van Escherichia coli O111:B4Millipore SigmaL4391-1MG
MagneetstandaardWorld Precision InstrumentsM10
Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-vrij, 10 mLCorning354234Proteïne concentratie > 9 mg/mL bij voorkeur
Micro tangFisher Scientific13-820-078
Micro schaarFisher Scientific08-953-1B
MicromanipulatorWorld Precision InstrumentsM3301
Micropipet pullerWorld Precision InstrumentsSU-P1000Of een soortgelijk apparaat
MicroscoopglazenFisher Scientific22-034486
Occludin Polyklonaal AntilichaamFisher Scientific71-1500
Paraformaldehyde 32% waterige oplossingELECTRON MICROSCOPY SCIENCESRT 15714
Petrischalen, 35x10 mmFisher Scientific150318
Petrischalen, 60x15 mmFisher Scientific12-565-94
Fosfaat Buffered Saline (PBS)Fisher Scientific10010031
PicoPump voetschakelaarWorld Precision Instruments3260
Pipetpunten, niet-gefilterd, 1000 uLFisher Scientific21-402-47
Pipetpunten, niet-gefilterd, 20 uLFisher Scientific21-402-41
Pipetpunten, niet-gefilterd, 200 uLFisher Scientific21-236-54
Pneumatisch PicoPump systeemWorld Precision InstrumentsSYS-PV820of een soortgelijk picopump systeem
Primocin 50 mg/mL, 10x1 ml flesjeInvivoGenant-pm-1
Stalen basisplaatWorld Precision Instruments5052
Stereo microscoopZeiss stemi 350Of een soortgelijke microscoop
ThermoSafe PolarPack Foam BlokkenSonoco03-531-53
Triton X-100Millipore SigmaT8787
MuurluchtvoorzieningN/AN/A
Y-27632 dihydrochlorideTocris Bioscience1254
ZO-1 Polyklonaal AntilichaamFisher Scientific61-7300
```

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Humberg, A., et al. Preterm birth and sustained inflammation: Consequences for the neonate. Seminars in Immunopathology. 42 (4), 451-468 (2020).
  2. Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: Model systems for human biology and medicine. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).
  3. Pinto, D., Gregorieff, A., Begthel, H., Clevers, H. Canonical Wnt signals are essential for homeostasis of the intestinal epithelium. Genes & Development. 17 (14), 1709-1713 (2003).
  4. Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).
  5. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  6. Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy. Journal of Visualized Experiments. (97), e52483(2015).
  7. Ares, G. J., Buonpane, C., Yuan, C., Wood, D., Hunter, C. J. A novel human epithelial enteroid model of necrotizing enterocolitis. Journal of Visualized Experiments. (146), e59194(2019).
  8. Stewart, C. J., Estes, M. K., Ramani, S. Establishing human intestinal enteroid/organoid lines from preterm infant and adult tissue. Methods in Molecular Biology. 2121, 185-198 (2020).
  9. Finkbeiner, S. R., et al. Transcriptome-wide analysis reveals hallmarks of human intestine development and maturation in vitro and in vivo. Stem Cell Reports. 4 (6), 1140-1155 (2015).
  10. Senger, S., et al. Human fetal-derived enterospheres provide insights on intestinal development and a novel model to study necrotizing enterocolitis (NEC). Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 549-568 (2018).
  11. Alganabi, M., Lee, C., Bindi, E., Li, B., Pierro, A. Recent advances in understanding necrotizing enterocolitis. F1000 Research. 8, (2019).
  12. Dame, M. K., et al. Human colonic crypts in culture: Segregation of immunochemical markers in normal versus adenoma-derived. Laboratory Investigation. 94 (2), 222-234 (2014).
  13. Hill, D. R., et al. Bacterial colonization stimulates a complex physiological response in the immature human intestinal epithelium. eLife. 6, 29132(2017).
  14. Tsai, Y. H., et al. A method for cryogenic preservation of human biopsy specimens and subsequent organoid culture. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 6 (2), 218-222 (2018).
  15. Su, K., Asbrock, N., Chu, V., Hoffmann, S., Hewitt, P. In Vitro Differentiation of Human iPS Cells Into Colon Organoids in Serum-Free Cell Culture Conditions. Technology Networks. , https://www.technologynetworks.com/cell-science/white-papers/in-vitro-differentiation-of-human-ips-cells-into-colon-organoids-in-serum-free-cell-culture-328450 (2019).
  16. Hill, D. R., Huang, S., Tsai, Y. H., Spence, J. R., Young, V. B. Real-time measurement of epithelial barrier permeability in human intestinal organoids. Journal of Visualized Experiments. (130), e56960(2017).
  17. Schoultz, I., Keita, A. V. The Intestinal Barrier and Current Techniques for the Assessment of Gut Permeability. Cells. 9 (8), 1909(2020).
  18. Kumar, N., et al. The lineage-specific transcription factor CDX2 navigates dynamic chromatin to control distinct stages of intestine development. Development. 146 (5), (2019).
  19. Walker, R. W., Clemente, J. C., Peter, I., Loos, R. J. F. The prenatal gut microbiome: Are we colonized with bacteria in utero. Pediatric Obesity. 12, Suppl 1 3-17 (2017).
  20. Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).
  21. Shin, W., et al. Spatiotemporal gradient and instability of Wnt induce heterogeneous growth and differentiation of human intestinal organoids. iScience. 23 (8), 101372(2020).
  22. Lueschow, S. R., McElroy, S. J. The Paneth cell: The curator and defender of the immature small intestine. Frontiers in Immunology. 11, 587(2020).
  23. In, J. G., Foulke-Abel, J., Clarke, E., Kovbasnjuk, O. Human colonoid monolayers to study interactions between pathogens, commensals, and host intestinal epithelium. Journal of Visualized Experiments. (146), e59357(2019).
  24. Dheer, R., Young, V. B. Stem-cell-derived models: Tools for studying role of microbiota in intestinal homeostasis and disease. Current Opinion in Gastroenterology. 37 (1), 15-22 (2021).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Foetale entero denintestinale beschadigingtight junctionsimmunofluorescentie imagingdextraan micro injectieparacellulaire permeabiliteitkeldermembraanmatrixLPS inductiepreterm darmmodel

Gerelateerde artikelen