Gelijktijdige beeldvorming van microgliale dynamica en neuronale activiteit bij wakkere muizen

Summary

Hier beschrijven we een protocol dat adeno-geassocieerde virusinjectie combineert met craniale raamimplantatie voor gelijktijdige beeldvorming van microgliale dynamiek en neuronale activiteit bij wakkere muizen.

Abstract

Omdat hersenfuncties onder de voortdurende invloed staan van de signalen die zijn afgeleid van perifere weefsels, is het van cruciaal belang om op te helderen hoe gliacellen in de hersenen verschillende biologische omstandigheden in de periferie waarnemen en de signalen doorgeven aan neuronen. Microglia, immuuncellen in de hersenen, zijn betrokken bij synaptische ontwikkeling en plasticiteit. Daarom moet de bijdrage van microglia aan de constructie van neurale circuits als reactie op de interne toestand van het lichaam kritisch worden getest door intravitale beeldvorming van de relatie tussen microgliale dynamiek en neuronale activiteit.

Hier beschrijven we een techniek voor de gelijktijdige beeldvorming van microgliale dynamiek en neuronale activiteit bij wakkere muizen. Adeno-geassocieerd virus dat codeert voor R-CaMP, een gen-gecodeerde calciumindicator van rood fluorescentie-eiwit, werd geïnjecteerd in laag 2/3 van de primaire visuele cortex in CX3CR1-EGFP transgene muizen die EGFP tot expressie brengen in microglia. Na virale injectie werd een schedelvenster geïnstalleerd op het hersenoppervlak van het geïnjecteerde gebied. In vivo beeldvorming van twee fotonen bij wakkere muizen 4 weken na de operatie toonde aan dat neurale activiteit en microgliale dynamiek tegelijkertijd konden worden geregistreerd bij de temporele resolutie van minder dan een seconde. Deze techniek kan de coördinatie tussen microgliale dynamiek en neuronale activiteit blootleggen, waarbij de eerste reageert op perifere immunologische toestanden en de laatste codeert voor de interne hersentoestanden.

Introduction

Er is steeds meer bewijs dat de interne toestand van het lichaam voortdurend de hersenfuncties bij dieren beïnvloedt 1,2,3,4,5. Om een beter inzicht te krijgen in hersenfuncties, is het daarom cruciaal om op te helderen hoe gliacellen in de hersenen de biologische omstandigheden in de periferie bewaken en de informatie doorgeven aan neuronen.

Microglia, immuuncellen in de hersenen, zijn betrokken bij synaptische ontwikkeling en plasticiteit, die kenmerken van neurale circuits in de hersenen vormen 6,7,8,9. Het pionierswerk van Wake et al. toonde bijvoorbeeld aan dat microgliale processen contact maken met synapsen op een neuronale activiteitsafhankelijke manier in de neocortex van de muis en dat kunstmatige ischemie synapsverlies induceert na langdurig contact met microglia¹⁰. Tremblay et al. vonden dat verandering van visuele ervaring de modaliteit van microgliale interactie met synapsen verandert. Tijdens de kritieke periode waarin de dendritische wervelkolomomzet in de primaire visuele cortex (V1) wordt verhoogd door binoculaire deprivatie, vermindert donkere aanpassing de beweeglijkheid van microgliale processen en verhoogt zowel hun contactfrequentie met synaptische spleten als het aantal cellulaire insluitsels in microglia¹¹. Deze resultaten suggereren dat microgliale processen neurale activiteit en hun omgeving detecteren om neurale circuits te hermodelleren. Bovendien meldde een recente studie dat microgliale surveillance verschilt tussen wakkere en verdoofde omstandigheden, wat het belang suggereert van experimenten met wakkere muizen voor het onderzoeken van neuron-microglia-communicatie onder fysiologische omstandigheden¹².

In vivo twee-foton calciumbeeldvorming is een krachtig hulpmiddel voor de registratie van calciumdynamiek, die voortdurende neuronale vuren weerspiegelt, in honderden neuronen tegelijkertijd in een levend dier^13,14,15. Calciumbeeldvorming in neuronen vereist over het algemeen een temporele resolutie van meer dan een paar Hz om snelle neuronale reacties te volgen^16,17. Daarentegen hebben eerdere studies die de microgliale dynamiek volgden, microgliale structuren bemonsterd met een relatief lage temporele resolutie van minder dan 0,1 Hz^18,19,20. Een recente studie paste gelijktijdige beeldvorming van twee fotonen toe om de communicatie tussen neuronen en microglia^{te begrijpen 21}. Het is echter nog steeds onduidelijk hoe dynamische microgliale processen reageren op de omringende neurale activiteit met een temporele resolutie van meer dan een paar Hz bij wakkere muizen. Om dit probleem aan te pakken, beschrijven we een gelijktijdige in vivo twee-foton beeldvormingsmethode van neurale activiteit en microgliale dynamica met een temporele resolutie hoger dan 1 Hz bij wakkere muizen. Deze methode stelt ons in staat om stabiele beeldvorming te bereiken bij wakkere muizen met een hogere framesnelheid (maximaal 30 Hz met de pixelframegrootte van 512 x 512 pixels) en biedt een gunstigere manier om het surveillancegedrag van microglia of hun interactie met neuronale activiteit bij wakkere muizen te onderzoeken.

Protocol

Alle experimenten werden goedgekeurd door de Animal Ethics Committee en de Genetic Recombinant Experiment Safety Committee van Graduate School of Medicine en Faculty of Medicine, de Universiteit van Tokio, en uitgevoerd volgens hun richtlijnen.

1. Voorbereiding

1. Steriliseer alle instrumenten en apparaten die nodig zijn voor de operatie met behulp van autoclaaf of 70% ethanol.
2. Voorbereiding van de glazen pipet.
   1. Bevestig een gekalibreerd capillair van 75 μL stevig aan de houder van de micropipettrekker. Stel de trekker in op het programma met de aanbevolen parameters als P (druk) = 500, WARMTE = 680, PULL = 30, VEL = 60, TIJD = 180.
   2. Na het voltooien van het programma (meestal 4,5 tot 5 s), wordt het capillair verdeeld in twee glazen pipetten met taps toelopende staarten. Breek vervolgens het distale deel van de staarten met een pincet om de tipdiameter binnen 30-50 μm te houden. Breek hiervoor de staarten 1 cm distaal tot het einde van het afgeschuinde deel.
3. Bereid voor craniotomie een schedelvenster voor door een grotere buitenste glazen schijf met een diameter van 4 mm, een dikte van 0,15 ± 0,02 mm te lijmen op een kleinere binnenste glazen schijf, een diameter van 2 mm, een dikte van 0,525 ± 0,075 mm, met behulp van een UV-lichtuithardingsreagens (figuur 2A).

2. AAV-injectie

1. Voorbereiding van injectieapparatuur
   1. Plaats een glazen pipet die via een buis is aangesloten op een Hamilton-spuit van 26 G op een pipethouder van een stereotaxisch instrument en kantel de pipethouder vervolgens 60° anterieur vanaf de verticale as (figuur 1A,B).
   2. Vul de glazen pipet, de spuit en de verbindingsbuis met vloeibare paraffine. Plaats de spuit op een micro-injector.
2. Chirurgische ingreep
   OPMERKING: De volgende operatie werd uitgevoerd in een gesteriliseerde cabine. Voor de operatie werd indien nodig een stereomicroscoop gebruikt.
   1. Verdoof een mannelijke CX3CR1-EGFP-muis (gedetailleerde informatie in de materiaaltabel) van 7 tot 8 weken oud (lichaamsgewicht 22-26 g) met 3% isofluraan in een gasdichte kamer. Haal na 3 minuten de muis uit de kamer wanneer deze de vrijwillige beweging verliest, behalve de ademhaling, en schakel dan over op continue anesthesie door een neussonde met 2% isofluraan.
      OPMERKING: Van isofluraan is bekend dat het microglia activeert. Omdat beeldvorming echter 4 weken na de operatie wordt uitgevoerd, is er geen effect van isofluraan op de muizen tijdens de beeldvorming. Hoewel isofluraananesthesie gedurende enkele minuten wordt gebruikt wanneer muizen in het stereotaxische instrument worden geplaatst voordat ze in beeld worden gebracht (stap 4.2.1), vonden we dat het effect van deze korte anesthesie verwaarloosbaar is.
   2. Houd de muis tijdens de operatie warm met een verwarmingskussen op 37 °C om onderkoeling te voorkomen. Breng oogzalf aan op beide ogen om uitdroging van het hoornvlies te voorkomen en dien een meloxicam-injectie toe, subcutaan (5 mg / kg). Bevestig de muis aan een hulpoorbalk en bevestig de muis vervolgens op het stereotaxische instrument met de dorsale kant naar boven.
   3. Pas de isofluraanconcentratie tijdens de operatie aan tot een geschikt percentage (1%-2%) terwijl u de ademhaling en hartslag controleert. Verwijder het haar met ontharingscrème en desinfecteer het hoofd meerdere keren in een cirkelvormige beweging met zowel een scrub op basis van jodium of chloorhexidine als alcohol. Injecteer vervolgens 0,1 ml 1% lidocaïne subcutaan en breng steriele gordijnen aan om de operatieplaats te beveiligen.
   4. Snijd de hoofdhuid open langs de middellijn met een schaar en maak de incisie ongeveer 2 cm lang, om een goede belichting van de schedel boven de rechter primaire visuele cortex te garanderen. Na de incisie van de hoofdhuid, irrigeer het hoofd met zoutoplossing gedurende de hele procedure om te voorkomen dat de blootgestelde schedel en hersenen uitdrogen.
   5. Verwijder het botysteum op de blootgestelde schedel met een tang. Boor de schedel op de stereotaxische coördinaten: 3 mm lateraal naar de middellijn, 0,5 mm voorzijde naar de lambdalijn, om een klein gat met ongeveer 0,5 mm diameter te creëren. Spoel indien nodig bloed en weefselresten van de boor af.
   6. Vul de glazen pipet met 1 μL rAAV2/1-hSyn-R-CaMP1.07 volgens de volgende procedure bij een titer van 8,3 x 10¹² vectorgenomen/ml²².
      1. Laat de spuit 1 μl vloeibare paraffine uit de glazen pipet werpen. Plaats een stuk transparante film, ongeveer 2 cm x 2 cm, op de blootgestelde schedel van de muis en verdrijf een druppel van 1 μL AAV-oplossing op de film met behulp van een pipettor.
      2. Plaats de punt van de glazen pipet in de druppel AAV-oplossing op de film en trek voorzichtig aan de spuit om de AAV-oplossing op te zuigen. Draai na het uitwerpen aan de T-vormige stopkraan om de druk in de buis en de glazen pipet los te laten.
   7. Steek de glazen pipet tot een diepte van 500 μm van het hersenoppervlak door het gat dat in stap 2.2.5 is gemaakt en injecteer vervolgens 0,5 μl AAV-oplossing met behulp van de micro-injector (figuur 1C). Gebruik het injectievolumedebiet van 2,0 μL/h; een injectie van 0,5 μL duurt 15 minuten en wacht vervolgens 5 minuten.
   8. Trek na de injectie voorzichtig de glazen pipet terug en spoel het hersenoppervlak af met een zoutoplossing.

3. Craniale raamimplantatie

OPMERKING: Craniale raamimplantatie volgt op de AAV-injectie op dezelfde dag.

1. Markeer een cirkel met een diameter van 2,5 mm op de schedel, gecentreerd op 3 mm zijdelings van de lambda. Maak een cirkelvormige groef langs de markering op de schedel door te boren. Reinig het puin omdat dit de zichtbaarheid van de schedel nadelig kan beïnvloeden en breng zoutoplossing aan tijdens het boorproces om opwarming te voorkomen.
2. Om te controleren of de boordiepte in de cirkelvormige groef voldoende is om het centrale schedelfragment te verwijderen, drukt u voorzichtig met een tang op de centrale schedel. Als het verticaal beweegt met weinig weerstand, is de boordiepte voldoende.
3. Wanneer de groef voldoende diep is, steekt u de punt van de tang in de onderkant van het centrale schedelfragment en tilt u deze voorzichtig op en verwijdert u deze om het hersenoppervlak bloot te leggen (figuur 1D).
4. Gebruik een naald van 27 G om de dura aan de rand van het blootgestelde hersenoppervlak te prikken en te scheuren. Steek de punt van de tang door het gat aan de rand van de dura. Houd de dura vast en pel deze af om het hersenoppervlak bloot te leggen.
   OPMERKING: Als er een bloeding optreedt, spoel dan het hersenoppervlak met een zoutoplossing totdat het bloeden stopt.
5. Dispergeer met behulp van een tang hemostatische vezels één voor één in zoutoplossing in een schaal van 3,5 mm en plaats vervolgens de hemostatische vezels langs de randen van het gat waarin de doorgesneden dura aanwezig is.
6. Plaats een schedelvenster dat is voorbereid in stap 1.3 op het blootgestelde hersenoppervlak en hecht het vervolgens aan de schedel met onmiddellijke lijm terwijl u zachtjes op het venster drukt zodat het venster in nauw contact staat met de schedel.
7. Breng daarna direct lijm aan op de hele blootgestelde schedel en bevestig vervolgens voorzichtig een hoofdplaat op de schedel, zodat het venster zich in het midden van het vierkante gat van de hoofdplaat bevindt (figuur 2C). Zorg ervoor dat het oppervlak van de kopplaat evenwijdig is aan het oppervlak van het glazen raam.
8. Nadat de lijm voldoende is uitgehard, brengt u tandcement aan op de blootgestelde schedel om de aanhechting tussen het hoofd en de hoofdplaat te versterken (figuur 2).
   OPMERKING: Als de experimenten de presentatie van visuele stimuli aan muizen omvatten, moet strooilicht naar het beeldvormingsgebied worden vermeden. Het is raadzaam om het cement zwart te maken door het te mengen met de actieve kool voor de vermindering van lichtreflectie.
9. Trek de muis uit de anesthesie nadat het cement voldoende is uitgehard (ongeveer 20 minuten). Plaats de muis vervolgens in een nieuwe kooi om alleen te herstellen.
10. Na bevestiging van zijn bewustzijn en vrijwillige beweging, wat wijst op volledig herstel, plaats je de muis terug in de thuiskooi. Dien tijdens het herstel een tweede, of meer indien nodig, meloxicam-dosis toe (eenmaal per 24 uur gedurende 1-3 dagen) als duidelijk pijnaangevend gedrag optreedt.

4. In vivo beeldvorming van twee fotonen van microglia en neuronale calciumdynamica

1. Gewenning van muizen aan het microscoopapparaat
   1. Drie weken na de operatie induceert u anesthesie bij de muis met 3% isofluraan en plaatst u de muis onder de 25x objectieve lens van een microscoop met twee fotonen met behulp van een op maat gemaakt stereotaxisch instrument (figuur 3C). Voor de opstelling hier wordt de muis op de bovenkant van een loopband geplaatst en mag hij vrij lopen.
   2. Verwijder ongeveer 10 minuten later de muis uit het microscoopstadium en breng deze terug naar de thuiskooi. Herhaal de gewenning minstens 3 keer om de andere dag voordat u twee fotonen beeldacquisitie.
2. Beeldacquisitie met twee fotonen
   OPMERKING: We raden aan om de beeldacquisitie meer dan 4 weken na de operatie uit te voeren, omdat microgliale activering geleidelijk terugkeert naar het basale niveau.
   1. Induceer net als in stap 4.1 anesthesie in de muis met 3% isofluraan en plaats de muis onder de objectieflens van de tweefotonenmicroscoop met behulp van een op maat gemaakt stereotaxisch instrument.
   2. Installeer het op maat gemaakte zonweringsapparaat en een LCD-monitor voor visuele stimulatie zoals hieronder beschreven (figuur 3D).
      1. Plaats de lens om scherp te stellen op het hersenoppervlak en stel deze lenspositie vervolgens in als de oorspronkelijke Z-positie. Houd de x-y-coördinaten constant en verhef de objectieflens; Verwijder de muis en het stereotaxische instrument uit de objectieflens en loopband.
      2. Bevestig een schaduwapparaat aan de bovenkant van de kopplaat met siliconen, dat zwart wordt gemaakt door te mengen met houtskoolpoeder, en zorg ervoor dat de ruimte tussen de kopplaat en het schaduwapparaat goed is afgesloten.
      3. Vul het schaduwapparaat met gedestilleerd water en bevestig vervolgens de muis en het stereotaxische frame opnieuw onder het objectief en op de loopband. Reset zorgvuldig het brandpuntsvlak aan het hersenoppervlak en controleer de diepte van de objectieflens.
         OPMERKING: Om het risico van beschadiging van de objectieflens te voorkomen, stelt u eerst de xyz-coördinaten in en past u vervolgens de schaduwinrichting van de objectieflens toe. Het is ook redelijk om eerst de afdekking te installeren en vervolgens de coördinaten aan te passen, maar voorzichtige behandeling is noodzakelijk voor deze optie.
      4. Bedek de objectieflens met zwarte aluminiumfolie om lichtvervuiling te voorkomen van de LCD-monitor die wordt gebruikt voor visuele stimulatie door de objectieflens (figuur 3D). Stel een 10-inch LCD-monitor in op 12,5 cm voor de ogen van de muis om visuele stimuli te presenteren (figuur 3D).
   3. Configureer de fluorescentie-emissieopvangfilters naar EGFP-fluorescentie (525/50 nm-emissiefilter) en R-CaMP-fluorescentie (593/46 nm-emissiefilter) en de excitatiegolflengte tot 1.000 nm. Verkrijg beelden met een ruimtelijke resolutie van 0,25 μm/pixel met behulp van een 25x 1,1 NA-objectief en GaAsP PMT's.
   4. Zoek het beeldvormingsgebied waarin R-CaMP(+)-neuronen en EGFP(+)-microglia gelijktijdig kunnen worden afgebeeld in laag 2/3. Voor deze opstelling bevonden de gegevens verkregen in figuur 4 en video 1 zich op een diepte van 100 μm van het piale oppervlak, met behulp van een live beeldvoorbeeld. Houd het vermogen van de excitatielaser zo laag mogelijk om fotobleken en schade veroorzaakt door verhoogde lokale temperatuur in het beeldgebied te voorkomen.
   5. Verkrijg beelden met een framesnelheid van 30 Hz. Presenteer gelijktijdig met de beeldacquisitie een drijvend-roosterende visuele stimuli bij 100% contrast, 1,5 Hz, 0,04 cycli per graad in 12 richtingen in 6 oriëntaties van 0 ° tot 150 ° in stappen van 30 ° naar de muis¹⁷.
   6. Verwijder na de beeldacquisitie de muis uit het microscoopstadium, maak het schaduwapparaat en het stereotaxische instrument los van de muis en breng de muis terug naar zijn thuiskooi.
3. Gegevensregistratie
   1. Converteer en sla de verkregen beeldgegevens (nd2-formaat in dit geval) op als een reeks tiff-afbeeldingsbestanden voor elk kleurkanaal, met behulp van Fiji of de software die bij de microscoop wordt geleverd.
   2. Pas Turboreg toe, een plug-in van Fiji, om registratie uit te voeren met mode = vertaling. Gebruik de gemiddelde afbeelding als referentieafbeelding met de tiff-afbeeldingsbestanden van het EGFP-kanaal.
   3. Voer de volgende verwerking uit voor elk frame met MATLAB.
      OPMERKING: Hoewel MATLAB wordt gebruikt in de volgende verwerking, richt de beschrijving zich voornamelijk op de intentie van elke stap, zodat gegevens kunnen worden geanalyseerd door andere programmeersoftware zoals Python.
      1. Gebruik de imread-functie om respectievelijk twee EGFP tiff-afbeeldingen voor en na registratie van hetzelfde frame te lezen. Gebruik de imread-functie om de R-CaMP tiff-afbeelding van hetzelfde frame te lezen.
      2. Gebruik de functie normcorr2 om de correlatiefunctie te berekenen tussen de gevectoriseerde variabelen van de twee GFP-afbeeldingen die in stap 4.3.3.1 zijn gelezen.
      3. Gebruik de functie max om de lineaire index met de hoogste kruiscorrelatie van de correlatiefunctie te detecteren en gebruik vervolgens de functie ind2sub om de bewegingspositie van de geregistreerde afbeelding te berekenen op basis van de oorspronkelijke afbeelding.
      4. Gebruik de imwarp-functie om de R-CaMP-afbeelding te vertalen naar de positie die is berekend in stap 4.3.3.3 en gebruik vervolgens de imwrite-functie om de geregistreerde afbeelding van R-CaMP op te slaan.
4. Aanmaak van calciumsporen
   1. Voer de volgende verwerking uit met MATLAB. Gebruik de imread-functie om alle geregistreerde R-CaMP tiff-afbeeldingen te lezen die in stap 4.3.3.4 zijn gegenereerd. Als de geregistreerde afbeeldingen al als variabele in de werkruimte zijn geladen, laat u deze stap weg.
   2. Gebruik de functie gemiddelde om een tijdprojectiebeeld te genereren. Gebruik de imshow-functie om de gemiddelde afbeelding als een figuur weer te geven; gebruik de Roipoly-functie om een binair ROI-masker van de doelstructuur te genereren (dendritische wervelkolom in deze gegevens).
   3. Gebruik de gemiddelde functie met de afbeeldingen die worden verkregen door het binaire masker te vermenigvuldigen met afbeeldingen van elk frame als invoervariabelen, en bereken de gemiddelde fluorescentie-intensiteit binnen de ROI voor elk frame.
   4. Zoals eerder beschreven¹⁷, past u op de in stap 4.4.3 verkregen variabele het boterfrequentiefilter toe bij afsnijding = 1,6 s voor het snijden van hoogfrequent geluid en past u vervolgens het glijdende middenfilter toe op het tijdvenster = 200 s, voor het snijden van laagfrequent geluid.

Results

We voerden de AAV-injectie en craniale raamimplantatie uit in V1 van een 8 weken oude CX3XR1-EGFP transgene muis zoals beschreven in dit protocol. Vier weken na de operatie voerden we gelijktijdige in vivo twee-foton beeldvorming uit van R-CaMP-gebaseerde neurale activiteit en microgliale dynamica in laag 2/3 van V1 (figuur 4 en video 1). Tijdens de beeldvorming werd de muis op een loopband geplaatst en vrij laten lopen. Beelden werden verkregen met een framesnelheid van 30 Hz met een ruimtelijke resolutie van 0,25 μm/pixel met behulp van een 25x, 1,1 NA-objectief en GaAsP PMT's. Zowel EGFP als R-CaMP werden geëxciteerd bij een golflengte van 1.000 nm, en EGFP-fluorescentie (525/50 nm-emissiefilter) en R-CaMP-fluorescentie (593/46 nm-emissiefilter) werden tegelijkertijd verzameld. Na de registratie van de verkregen gegevens om bewegingsartefacten te minimaliseren, werden alle vier frames gemiddeld in één frame om achtergrondruis te verminderen. Raspende visuele stimuli werden aan de muis gepresenteerd en de visuele reacties van neuronen en individuele dendritische stekels werden geanalyseerd (figuur 4D). Microgliale processen vertoonden een snelle dynamiek en veranderden hun morfologie binnen 10 s (figuur 4E en video 1). Zoals beschreven in de sectie Discussie, kon de expressie van R-CaMP niet worden gedetecteerd toen de AAV-injectie mislukte. Als de operatie niet succesvol was, konden de signalen van EGFP en R-CaMP niet worden waargenomen.

Figuur 1: AAV-injectie . (A) Een glazen pipet werd met behulp van een siliconenbuis verbonden met een Hamilton-spuit van 26 G. (B) De opstelling voor AAV-injectie. (C) AAV-oplossing werd geïnjecteerd via de glazen pipet die 60° anterieur van de verticale as was gekanteld. (D) Schematisch schema van de procedure van open schedel (beschreven in stap 3.3). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Schedelraam en hoofdplaat . (A) Schematisch diagram van craniale raamimplantatie. (B) Er werden op maat gemaakte kopplaten gebruikt. Voor beeldvorming in de rechterhersenhelft moet de kortere arm aan de rechterkant worden gebruikt. (C) Dorsale weergave van een muis met een schedelvenster en een geïmplanteerde hoofdplaat. (D) Hoge vergrotingsweergave van het schedelvenster weergegeven in figuur 2C. (E) Dorsale weergave van een muis die is bevestigd met het op maat gemaakte stereotaxische instrument. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: De opstelling voor in vivo beeldvorming met twee fotonen. (A) Dorsale weergave van de zonwering. (B) Zijaanzicht van de zonwering. (C) Weergave van een muis met de arceringsinrichting op de kopplaat onder de objectieflens. De muis wordt op de loopband geplaatst. (D) Bekijken onder de twee-foton excitatie microscoop. Een monitor met visuele prikkels is aan de rechterkant van de figuur geplaatst. De objectieflens is bedekt met het schaduwapparaat en zwarte aluminiumfolie om licht van de monitor naar de objectieflens te voorkomen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Microgliale dynamica en visuele responsen in een dendritische wervelkolom. (A-C) Tijdgemiddelde beelden van EGFP(+) microglia en R-CaMP(+) neuronen in laag 2/3 van V1 in een 12 weken oude CX3XR1-EGFP transgene muis. De signaalintensiteit in elk kanaal werd onafhankelijk genormaliseerd. (D) Visuele reacties in een dendritische wervelkolom. Streepdiagrammen met zwarte pijlen geven de richting van de roosterprikkels aan die worden gepresenteerd in de timing die wordt aangegeven door grijze kolommen. In calciumsporen geven grijze lijnen individuele reacties aan en een zwarte lijn geeft hun gemiddelde aan. In de rechter inzet geeft een gele pijlpunt de dendritische wervelkolom aan waarin het interessegebied (ROI) werd gegenereerd om de calciumsporen te verkrijgen. (E) Microgliale processus (cyaan pijlpunt) vertoonde snelle terugtrekking in 10 s. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Video 1: Twee-foton beeldvorming van neuronale activiteit en microgliale dynamiek. Beeldvormingsgegevens van EGFP(+) microglia en R-CaMP(+) neuronen in laag 2/3 van V1 in een 12 weken oude CX3XR1-EGFP transgene muis. Aan de linkerkant van de film geeft magenta R-CaMP aan in neuronen en groen geeft EGFP aan in microglia. Het midden van de film komt overeen met het EGFP-signaal en de rechterkant komt overeen met het R-CaMP-signaal. De signaalintensiteit in elk kanaal werd onafhankelijk genormaliseerd. De framesnelheid van de film is 40 keer sneller dan de werkelijke snelheid. Schaalbalk = 10 μm Klik hier om deze video te downloaden.

Discussion

We beschrijven het protocol van AAV-injectie en craniotomie voor gelijktijdige beeldvorming van microgliale dynamiek en neuronale activiteit bij wakkere muizen, evenals gegevensverwerking. Deze techniek kan de coördinatie blootleggen tussen microgliale dynamiek en neuronale activiteit op tijdschalen variërend van minder dan een seconde tot tientallen seconden.

Het operatieprotocol omvat verschillende technisch veeleisende stappen. AAV-injectie is een van de kritieke stappen. Mislukte AAV-injectie kan een significante vermindering van de expressie van R-CaMP veroorzaken. Er zijn twee belangrijke redenen: verstopte glazen pipetten en weefselschade. De verstopping van glazen pipetten vermindert of blokkeert de uitwerping van AAV-oplossing volledig. Deze situatie kan worden vermeden door de AAV-oplossing te kleuren met een kleurstof zoals snel groen en het succes van de injectie visueel te bevestigen. Weefselschade veroorzaakt door AAV-injectie voorkomt exogene genexpressie in de buurt van het midden van de injectieplaats. De schade veroorzaakt door AAV-injectie wordt waarschijnlijk veroorzaakt door een plotselinge toename van de efflux van de punt van de glazen pipet na de accumulatie van de druk in de pipet. Daarom moet de uitstroom van AAV-oplossing uit de glazen pipet constant zijn tijdens de injectie. Het selecteren van glazen pipetten met een iets bredere diameter aan hun uiteinden zou dit probleem oplossen. Bij craniale raamimplantatie is de snelheid van de operatie van cruciaal belang. Als de operatie te lang duurt, kan het hersenweefsel ernstig beschadigd raken. Dienovereenkomstig is herhaalde oefening noodzakelijk om de snelheid en soepelheid van de operatie te garanderen. Bovendien kan gedurende de 4 weken tussen operatie en beeldvorming de kwaliteit van de beeldvorming worden verminderd door weefselregeneratie tussen het schedelvenster en het hersenweefsel volgens de conventionele methode¹⁷. De methode hier overwint dit probleem door een dikke bril aan te brengen voor de binnenste glazen schijf van de schedelvensters om weefselregeneratie te remmen en het venster vrij te houden. In het hier beschreven systeem was dit effect duidelijk door gebruik te maken van een binnenste glazen schijf met een dikte van 0,525 ± 0,075 μm.

De methode kan met succes worden toegepast op muizen ouder dan 4 weken, maar de toepassing op jongere muizen kan problematisch zijn. Bij jonge muizen vertoont de schedel een snelle en prominente groei, wat een mismatch veroorzaakt tussen het schedelbot en het glazen venster.

In sommige geavanceerde studies werd in vivo beeldvorming van twee fotonen gebruikt om microglia-neuroninteracties te bestuderen 12,21,23. Vooral in het pionierswerk van Merlini et al. voerden ze gelijktijdige in vivo beeldvorming uit van microgliale dynamiek en neurale activiteit in de cellichamen²¹. In deze methode, door dikkere binnenglazen te gebruiken voor schedelvensters, konden we bewegingsartefacten in de diepteoriëntatie onderdrukken en de stabiele meting van neuronale activiteit in microstructuren, zoals dendritische stekels, bereiken. Deze methode zou helpen bij het onderzoeken van synaps-microgliale procesinteracties bij wakkere muizen.

Onlangs toonde in vitro onderzoek aan dat dunne filopodia-achtige microgliale processen een snellere beweeglijkheid hebben dan dikke processen, wat het belang van hun snellere beweeglijkheid in surveillance^{suggereert 19}. Het systeem hier kan de beweeglijkheid van dunne microgliale processen volgen met een temporele resolutie van een subseconde tot enkele tientallen seconden. Deze eigenschap helpt de functionele betekenis van hun beweeglijkheid voor surveillance in vivo te verduidelijken.

In de toekomst zou de combinatie van deze beeldvormingstechniek met interventies, zoals optogenetica²⁴ of chemogenetica²⁵, toegepast op lokale neurale circuits of interregionale neurale verbindingen licht werpen op nieuwe microgliale functies in synaptische ontwikkeling en plasticiteit die kenmerken van neurale circuits vormen. Ook zou verdere integratie van beeldvorming, interventie en gedragstaken bijdragen aan het onthullen van de coördinatie van microglia en neuronen die ten grondslag liggen aan specifiek gedrag.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10-inch LCD-monitor	EIZO	DuraVision FDX1003	Voor het presenteren van rastervisuele stimuli
26G Hamilton-sering	Hamilton	701N
27G-naald	Terumo	NN-2719S
AAV-hSyn-R-CAMP1.07	N/A	N/A	Vriendelijk geschonken door het laboratorium van Prof. Matsuzaki
Geactiveerde houtskoolpoeder	Nacalai tesque	07909-65
Zwarte aluminiumfolie	THORLABS	BKF12
CX3CR1-EGFP-muis	Jackson laboratory	IMSR_JAX: 005582	CX3CR-1EGFP/+ knock-in/knock-out muizen die EGFP in microglia in de hersenen tot expressie brengen onder controle van het endogene Cx3cr1 -locus.
DENT SILICONE-V	Shofu Inc	N/A	Voor het bevestigen van een schaduwapparaat aan een hoofdplaat
Tandcement (snelle hars, vloeistof)	Shofu Inc	N/A	AB
Tandcement (snelle hars, poeder)	Shofu Inc	N/A	B Kleur 3
Boor	Toyo Associates	HP-200
Glazen capillaire pipette	Drummond Scientific Company	2-000-075
Glazen schijf (groot)	Matsunami	N/A	4 mm in diameter, 0,15±0,02 mm dik
Glazen schijf (klein)	Matsunami	N/A	2 mm in diameter, 0,525±0,075 mm dik
Hoofdplaat	Aangepast	N/A	Materiaal: SUS304, dikte: 0,5 mm, zie Figuur 2B voor de vorm
Hemostatische vezel	Davol Inc	1010090
ImageJ Fiji-software		Gratis software	Voor gegevensregistratie
Onmiddellijke lijm (Aron alpha)	Daiichi Sankyo	N/A
Isofluraan	Pfizer	N/A
Lidocaine	Astrazeneca	N/A
MATLAB 2017b	MathWorks	N/A	Voor gegevensregistratie en -verwerking
Meloxicam	Tokyo Chemical Industry	M1959
Micro-injector	KD Scientific	KDS-100
Micropipetpuller	Sutter Instrument Company	P-97
Multi-foton excitatiemicroscoop	NIKON	N/A	De commerciële naam is "A1MP+".
Objectieflens	NIKON	N/A	De commerciële naam is "CFI75 apochromat 25xC W".
Paraffine vloeistof	Nacalai tesque	26132-35
Psychtoolbox		Gratis software	Voor het presenteren van rastervisuele stimuli
Schaduwapparaat	Aangepast	N/A
Stereomicroscoop	Leica	M165 FC
Stereotactisch instrument	Narishige Scientific Instrument	SR-611	Voor de operatie
Stereotactisch instrument	Aangepast	N/A	Voor het fixeren van muizen onder de tweefoton-microscoop
Stopcock	ISIS	VXB1079
Chirurgisch zijde	Ethicon	K881H
Loopband	Aangepast	N/A
UV-licht uitharder	Norland Products Inc	NOA 65
Verdamper	Penlon	Sigma Delta	Anesthesietoestel