De vloeibare biopsie heeft een revolutie teweeggebracht in onze benadering van oncologische translationele studies, waarbij monsterverzameling, kwaliteit en opslag cruciale stappen zijn voor de succesvolle klinische toepassing ervan. Hier beschrijven we een gestandaardiseerd en gevalideerd protocol voor downstream circulerende DNA-toepassingen die in de meeste translationele onderzoekslaboratoria kunnen worden toegepast.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een gestandaardiseerd preanalytisch protocol voor vloeibare biopsie voor downstream circulerende DNA-toepassingen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De term vloeibare biopsie (LB) verwijst naar moleculen zoals eiwitten, DNA, RNA, cellen of extracellulaire blaasjes in bloed en andere lichaamsvloeistoffen die afkomstig zijn van de primaire en / of gemetastaseerde tumor. LB is naar voren gekomen als een steunpilaar in translationeel onderzoek en is begonnen deel uit te maken van de klinische oncologiepraktijk, en biedt een minimaal invasief alternatief voor solide biopsie. De LB maakt real-time monitoring van een tumor mogelijk via een minimaal invasieve monsterextractie, zoals bloed. De toepassingen omvatten vroege detectie van kanker, follow-up van patiënten voor de detectie van ziekteprogressie, beoordeling van minimale restziekte en potentiële identificatie van moleculaire progressie en resistentiemechanisme. Om een betrouwbare analyse van deze monsters te bereiken die in de kliniek kan worden gerapporteerd, moeten de preanalytische procedures zorgvuldig worden overwogen en strikt worden gevolgd. Monsterverzameling, kwaliteit en opslag zijn cruciale stappen die hun nut in downstream-toepassingen bepalen. Hier presenteren we gestandaardiseerde protocollen van onze vloeibare biopsiewerkmodule voor het verzamelen, verwerken en opslaan van plasma- en serummonsters voor downstream vloeibare biopsieanalyse op basis van circulerend vrij DNA. De hier gepresenteerde protocollen vereisen standaardapparatuur en zijn voldoende flexibel om te worden toegepast in de meeste laboratoria die gericht zijn op biologische procedures.
Inleiding
De term "vloeibare biopsie" werd in 2010gedefinieerd 1 als de aanwezigheid van moleculen (bijv. Eiwit, desoxyribonucleïnezuur (DNA), ribonucleïnezuur (RNA)), cellen of extracellulaire blaasjes (bijv. Exosomen) in bloed en andere lichaamsvloeistoffen die afkomstig zijn van de primaire tumor. Het gebruik van vloeibare biopsiemonsters heeft een revolutie teweeggebracht in translationeel oncologisch onderzoek, omdat weefselbiopten, beperkt tot een bepaald gebied op een bepaald moment, relevante klonen kunnen missen vanwege tumorheterogeniteit. Bovendien speelt vloeibare biopsie een relevante rol bij tumortypen waar primair weefsel schaars of niet toegankelijk is, omdat het een invasieve biopsie kan vermijden, waardoor de kosten en het risico voor patiënten worden verminderd. Bovendien evolueren de moleculaire kenmerken van de tumor voortdurend, voornamelijk als gevolg van de therapiedruk, en vloeibare biopsiemonsters kunnen de tumorklonale dynamiek vastleggen omdat ze longitudinaal kunnen worden genomen, in verschillende klinische en therapeutische tijden van de ziekte, zoals baseline, op behandeling, beste respons en bij ziekteprogressie of zelfs eerder. Het concept van de "real-time vloeibare biopsie" betekent dat dynamische veranderingen in de tumor in realtime kunnen worden gevolgd, waardoor precisiegeneeskunde bij deze ziekte mogelijk is. De vloeibare biopsie heeft tal van potentiële toepassingen in de kliniek, waaronder screening en vroege detectie van kanker, real-time monitoring van de ziekte, detectie van minimale restziekte, het bestuderen van mechanismen voor behandelingsresistentie en stratificatie van patiënten op therapeutisch niveau1. De vroege detectie van ziekterecidief en progressie zijn een onvervulde klinische behoefte bij veel tumortypen en is een belangrijke factor in het verhogen van de overleving en kwaliteit van leven van kankerpatiënten. Routinematige beeldvormingsmodaliteiten en oplosbare tumormarkers kunnen de gevoeligheid en / of specificiteit missen die vereist is voor deze taak. Nieuwe voorspellende markers zijn dus dringend nodig in de kliniek, zoals die op basis van circulerende vrije nucleïnezuren.
De soorten monsters die worden gebruikt voor vloeibare biopsiestudies omvatten maar zijn niet beperkt tot bloed-, urine-, speeksel- en ontlastingsmonsters. Andere tumorspecifieke monsters kunnen celaspiraten, hersenvocht, pleuravocht, cyste- en ascitesvloeistof, sputum en pancreassapzijn 2. De voormalige vloeistoffen kunnen verschillende soorten van kanker afgeleide materialen, circulerende tumorcellen (CTC) of fragmenten zoals exosomen en celvrij circulerend tumor-DNA (ctDNA) bevatten. Nucleïnezuren kunnen worden ingekapseld in extracellulaire blaasjes (EV's) of vrijkomen in lichaamsvloeistoffen als gevolg van celdood en schade. Circulerend vrij DNA (cfDNA) wordt voornamelijk vrijgegeven in de bloedbaan vanuit apoptotische of necrotische cellen en is aanwezig in alle individuen, met verhoogde niveaus bij ontstekings- of oncologische ziekten3. Exosomen zijn kleine extracellulaire blaasjes (~ 30-150 nm) uitgescheiden door cellen die nucleïnezuren, eiwitten en lipiden bevatten. Deze blaasjes maken deel uit van het intercellulaire communicatienetwerk en worden vaak aangetroffen in vele soorten lichaamsvloeistoffen2. De nucleïnezuren in EV's worden beschermd tegen de ruwe omgeving in lichaamsvloeistoffen, waardoor een robuustere manier is om deze moleculen in de vloeibare biopsie-instelling te bestuderen.
Over het algemeen zijn de niveaus van circulerende nucleïnezuren in vloeibare biopsiemonsters erg laag en daarom zijn gevoelige methoden nodig voor detectie, zoals digitale PCR of next-generation sequencing (NGS). Preanalytisch beheer van het monster is cruciaal om bloedcellysis en afgifte van intact DNA te voorkomen, waardoor besmetting van het cfDNA met het genomische DNA ontstaat. Bovendien moet bij het extraheren van monsters voorzichtig worden om de aanwezigheid van remmers van op enzymen gebaseerde analysemethoden te voorkomen.
Hier presenteren we een gestandaardiseerde methode voor het verzamelen en opslaan van plasma- en serummonsters, wat een cruciale eerste stap is voor downstream-toepassingen op basis van vloeibare biopsie, inclusief circulerende nucleïnezuuranalyses.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Voorafgaande ethische goedkeuring werd verkregen van deelnemende centra vóór de extractie van bloedmonsters. De volgende protocollen voor serum- en plasma-isolatie werden uitgevoerd in overeenstemming met de ethische principes voor biomedisch onderzoek.
OPMERKING: Voorafgaande overwegingen voordat u met het protocol begint, vindt u hier. Voorafgaande ethische goedkeuring is vereist voor het gebruik van menselijke monsters in biomedisch onderzoek, met de bijbehorende geïnformeerde toestemming. Een klasse II bioveiligheidskast is vereist om bloedmonsters te verwerken. Een laboratoriumjas, beschermende handschoenen en een bril moeten tijdens de hele procedure worden gedragen om infectie door door bloed overgedragen ziekteverwekkers te voorkomen. Een minimum van 30 minuten is vereist voor de verwerking van serummonsters. Na bloedextractie in buizen zonder antistollingsmiddel, handhaven op kamertemperatuur (RT) gedurende 30-45 minuten om stolselvorming mogelijk te maken. Een minimum van 40 minuten is vereist voor plasmabereiding en monsters moeten binnen 4 uur na het moment van extractie worden verwerkt bij gebruik van ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) buizen of binnen 24-48 uur bij gebruik van celstabiliserende verzamelbuizen of specifieke celvrije DNA-verzamelbuizen. Volgens sommige fabrikanten zijn de monsters echter tot 2 weken stabiel in deze gespecialiseerde buizen. Het is belangrijk om te controleren op hemolyse, waardoor het plasma of de serumfractie een roodachtig uiterlijk krijgt. Zie de sectie probleemoplossing voor gehemolyseerde monsters in de discussie.
1. Serumpreparaat voor vloeibare biopsiestudies
OPMERKING: De totale tijd die nodig is om deze stap uit te voeren is 30 minuten (figuur 1).
- Extraheer 4-10 ml bloed in buizen die geen antistollingsmiddel bevatten (rode of rood/grijszwarte dop) en houd gedurende 30-45 minuten aan op RT. Verwerk deze monsters binnen 4 uur vanaf het moment van extractie.
- Noteer de tijd en datum van de monsterextractie en de identificatie van de proefpersoon (ID) in een goed ontworpen monsterdatabase.
- Draag een laboratoriumjas, beschermende handschoenen en een bril en centrifugeer de buis met vers bloed bij RT (15 °C-25 °C) gedurende 10 minuten bij 1.600 (± 150) x g, met de maximale pauze toegepast.
- Verwijder na centrifugatie voorzichtig de buis uit de centrifuge; de bovenste fase van serumsupernatant ziet er helder en geelachtig uit (figuur 2). Controleer of het monster tekenen van hemolyse vertoont (figuur 3) en noteer indien nodig de aanwezigheid van hemolyse.
- Breng het serum in een bioveiligheidskast van klasse II over naar verzamelbuizen als aliquots van 250 μL.
OPMERKING: Het volume van de aliquots moet worden aangepast aan de onderzoeksvereisten. - Vries het serum onmiddellijk rechtop in een bewaardoos bij -80 °C in en noteer het tijdstip van opslag van het monster.
- Controleer of de monsters binnen de vereiste periode van 4 uur zijn verwerkt.
2. Plasmapreparaat voor vloeibare biopsiestudies
OPMERKING: De totale tijd die nodig is om deze stap uit te voeren is 40 minuten (figuur 4).
- Extract 4-10 ml bloed in buizen die ethyleendiamine tetra-azijnzuur (EDTA) bevatten. Verwerk de monsters binnen 4 uur na het moment van extractie.
- Noteer de tijd en datum van de monsterextractie en de onderwerp-ID in een goed ontworpen monsterdatabase.
- Met een laboratoriumjas, beschermende handschoenen en een bril op, centrifugeert u de EDTA-buis bij RT (15 °C-25 °C) gedurende 10 minuten bij 1.600 (± 150) x g, met de maximale pauze toegepast.
OPMERKING: Raadpleeg de instructies van de fabrikant wanneer u andere opvangbuizen gebruikt. - Na centrifugatie zal het plasma-supernatant helder en geelachtig lijken. Controleer of het monster tekenen van hemolyse vertoont (figuur 3) en breng het plasma (supernatant) over naar een centrifugebuis van 15 ml zonder de cellaag te verstoren met behulp van een wegwerp serologische pipet (of wegwerpbolpipet of p1000 pipetten met filterpunt). Laat een klein restvolume plasma boven de cellaag (ongeveer 5 mm).
- Als hemolyse wordt waargenomen, gooit u het monster weg voor verdere analyses. (Figuur 5). Zie het gedeelte probleemoplossing in de discussie om hemolyse te beoordelen.
- Centrifugeer het plasma in een centrifugebuis van 15 ml bij RT (15 °C-25 °C) gedurende 10-20 minuten bij 3.000 (±150) x g. Voer deze stap uit om eventuele resterende intacte bloedcellen te verwijderen die zijn overgedragen van de eerste centrifugatiestap.
- Verwijder na centrifugatie voorzichtig de buis uit de centrifuge en breng 1-4 ml plasma over op 1-4 ml polypropyleen cryogene injectieflacons met behulp van een wegwerp serologische pipet (of wegwerpbolpipet of p1000-pipetten met filterpunt). Een restvolume plasma (ongeveer 0,3 ml of 7 mm hoog) moet aan de onderkant van de buis worden achtergelaten om besmetting van het plasma met bloedcellen te voorkomen (figuur 5).
- Vries het plasma onmiddellijk rechtop in de bewaardoos bij -80 °C en noteer het tijdstip van opslag van het monster. Controleer of de monsters binnen de vereiste periode van 4 uur zijn verwerkt.
- Verzamel de cellaag (buffy coat) met behulp van een P1000 en gefilterde tip en breng deze over naar een buis van 2 ml. Onmiddellijk invriezen en bewaren bij -80 °C.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Na centrifugering van de bloedbuizen zonder antistollingsmiddel lijkt de bovenste fase lichtgeel en komt overeen met de serumfractie (figuur 2). Deze fractie wordt zorgvuldig verwijderd en gealiquoteerd voor latere analyse.
Hemolyse kan aanwezig zijn in het plasma of de serumfractie en de bovenste fase zal een roodachtig uiterlijk hebben, wat wijst op de aanwezigheid en mate van hemolyse (figuur 3).
Na cent...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De vloeibare biopsie heeft tal van potentiële toepassingen op verschillende momenten tijdens de behandeling van kanker. Ten eerste, bij diagnose om tumormoleculaire markers te identificeren die de aanwezigheid van een potentiële tumorlaesie zouden suggereren die klinisch verder kan worden onderzocht. Ten tweede, tijdens de behandeling voor real-time monitoring van de ziekte, beoordeling van de moleculaire respons van de behandeling, klonale evolutie en vroege detectie van terugvallen van de ziekte of behandelingsresisten...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Beatriz Bellosillo (BB): BB ontving honoraria voor spreker, consultancy of adviserende rol van Amgen, Astra-Zeneca, Biocartis, Janssen, Merck-Serono, Novartis, Qiagen, Roche Diagnostics, Roche Pharma, ThermoFisher, Pfizer en BMS. Sara López-Tarruella (SL): SL ontving honoraria voor spreker, consultancy of adviserende rol van Astra-Zeneca / Daiichi-Sankyo, MSD, Novartis, Pfizer, Roche Pharma, Gilead, Lilly, Pierre Fabre, Seagen, GlaxoSmithKline en Veracyte. Noelia Tarazona (NT): NT ontving honoraria voor spreker, consultancy of adviserende rol van Amgen, Pfizer, Merck-Serono, Servier, SEOM en ESMO. Javier Hernandez-Losa (JHL): ontving honoraria voor spreker, consultancy of adviserende rol van Astra-Zeneca, Janssen, Novartis, Roche Diagnostics, Roche Pharma, ThermoFisher, Lilly en Diaceutics. Rodrigo Toledo (RT) meldt onderzoekssubsidies te ontvangen met betrekking tot deze studie van Novartis en onderzoeksbeurzen die geen verband houden met deze studie van AstraZeneca en Beigene. De overige auteurs hebben geen onthullingen met betrekking tot het manuscript.
Dankbetuigingen
We willen het Biomedical Research Network in Cancer (CIBERONC) bedanken voor hun steun en de volgende projectsubsidie: LB CIBERONC PLATFORM: CIBERONC-platform voor de standaardisatie en promotie van vloeibare biopsie. PI Rodrigo Toledo, (CIBERONC), 2019-2021.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 120.086 | Elke standaard buis/apparatuur kan worden gebruikt |
| 10 mL serologische wegwerppipetten | BIOFIL | GSP010010 | Elke standaard buis/apparatuur kan worden gebruikt |
| 10 mL Vacutainer K2 EDTA buis | Becton Dickinson | 367525 | Deze buizen kunnen worden gebruikt voor plasma-verzameling |
| 15 mL polypropyleen centrifugebuizen | BIOFIL | CFT411150 | Elke standaard buis/apparatuur kan worden gebruikt |
| 3.5 mL BD Vacutainer buis zonder anticoagulans | Becton Dickinson | 368965 | Zowel 8.5 of 3.5 mL buizen kunnen worden gebruikt voor serum-verzameling |
| 4 mL polypropyleen cryogeen flacon, ronde bodem, zelfstandig | Corning | 430662 | Elke standaard buis/apparatuur kan worden gebruikt |
| 4 mL Vacutainer K2 EDTA buis | Becton Dickinson | 367864 | Deze buizen kunnen worden gebruikt voor plasma-verzameling |
| 4200 TapeStation System | Agilent | G2991BA | Er zijn verschillende kwantificeringsmethoden beschikbaar met een specifieke toepassing voor cfDNA |
| 5 mL serologische wegwerppipetten | BIOFIL | GSP010005 | Elke standaard buis/apparatuur kan worden gebruikt |
| 8.5 mL BD Vacutainer buis zonder anticoagulans | Becton Dickinson | 366468 | Zowel 8.5 of 3.5 mL buizen kunnen worden gebruikt voor serum-verzameling |
| Centrifuge, in staat tot ~3000 x g met een swing bucket rotor | Thermo Fisher Scientific | Sorvall ST 16 10688725 | Elke standaard buis/apparatuur kan worden gebruikt |
| Vriesboxen voor 1–4 mLcryogene flacons | Corning | 431120 | Deze dozen zijn nodig bij het gebruik van 4 mL flacons voor opslag |
| p1000 pipette tips | CORNING | 4809 | Elke standaard buis/apparatuur kan worden gebruikt |
| QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit | Qiagen | 55114 | Elk commercieel verkrijgbaar kit dat specifiek is voor cfDNA isolatie kan worden gebruikt met dit bloedverwerkingsprotocol. |
| Streck Cell-Free DNA BCT CE buizen 10 mL | Streck | 218997 | Deze buizen kunnen worden gebruikt voor plasma-verzameling |
| Temperatuurvriezer (-80 °C) | ESCO | 2180104 | Elke standaard buis/apparatuur kan worden gebruikt |
Referenties
- Alix-Panabières, C., Pantel, K. Clinical applications of circulating tumor cells and circulating tumor DNA as liquid biopsy. Cancer Discovery. 6 (5), 479-491 (2016).
- Zhou, B., et al. Application of exosomes as liquid biopsy in clinical diagnosis. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 144(2020).
- Bettegowda, C., et al. Liquid biopsies: Genotyping circulating tumor DNA. Nature Medicine. 4 (6), (2014).
- Heitzer, E., et al. Recommendations for a practical implementation of circulating tumor DNA mutation testing in metastatic non-small-cell lung cancer. ESMO Open. 7 (2), 100399(2022).
- Gennari, A., et al. ESMO Clinical Practice Guideline for the diagnosis, staging and treatment of patients with metastatic breast cancer. Annals of Oncology: Official Journal of the European Society for Medical Oncology. 32 (12), 1475-1495 (2021).
- Van Buren, T., Arwatz, G., Smits, A. J. A simple method to monitor hemolysis in real time. Scientific Reports. 10 (1), 5101(2020).
- Ignatiadis, M., Sledge, G. W., Jeffrey, S. S. Liquid biopsy enters the clinic - implementation issues and future challenges. Nature Reviews. Clinical Oncology. 18 (5), 297-312 (2021).
- Sidstedt, M., et al. Inhibition mechanisms of hemoglobin, immunoglobulin G, and whole blood in digital and real-time PCR. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 410 (10), 2569-2583 (2018).
- Maass, K. K., et al. From sampling to sequencing: A liquid biopsy pre-analytic workflow to maximize multi-layer genomic information from a single tube. Cancers. 13 (12), 3002(2021).
- Greytak, S. R., et al. Harmonizing cell-free DNA collection and processing practices through evidence-based guidance. Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 26 (13), 3104-3109 (2020).
- Trigg, R. M., Martinson, L. J., Parpart-Li, S., Shaw, J. A. Factors that influence quality and yield of circulating-free DNA: A systematic review of the methodology literature. Heliyon. 4 (7), 00699(2018).
- Boissier, E., et al. The centrifuge brake impacts neither routine coagulation assays nor platelet count in platelet-poor plasma. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 58 (9), 185-188 (2020).
- Johansson, G., et al. Considerations and quality controls when analyzing cell-free tumor DNA. Biomolecular Detection and Quantification. 17, 100078(2019).
- Casas-Arozamena, C., et al. Genomic profiling of uterine aspirates and cfDNA as an integrative liquid biopsy strategy in endometrial cancer. Journal of Clinical Medicine. 9 (2), 585(2020).
- Alcoceba, M., et al. Liquid biopsy: a non-invasive approach for Hodgkin lymphoma genotyping. British Journal of Haematology. 195 (4), 542-551 (2021).
- Szpechcinski, A., et al. Cell-free DNA levels in plasma of patients with non-small-cell lung cancer and inflammatory lung disease. British Journal of Cancer. 113 (3), 476-483 (2015).
- Earl, J., et al. Somatic mutation profiling in the liquid biopsy and clinical analysis of hereditary and familial pancreatic cancer cases reveals kras negativity and a longer overall survival. Cancers. 13 (7), 1612(2021).
- Lampignano, R., et al. Multicenter evaluation of circulating cell-free DNA extraction and downstream analyses for the development of standardized (pre)analytical work flows. Clinical Chemistry. 66 (1), 149-160 (2020).
- Febbo, P. G., et al. Minimum technical data elements for liquid biopsy data submitted to public databases. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 107 (4), 730-734 (2020).
- De Mattos-Arruda, L., Siravegna, G. How to use liquid biopsies to treat patients with cancer. ESMO Open. 6 (2), 100060(2021).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
