Methodenartikel

Een gestandaardiseerd preanalytisch protocol voor vloeibare biopsie voor downstream circulerende DNA-toepassingen

DOI:

10.3791/64123

⸱

16 september 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The Liquid Biopsy and Biomarker Working Module, the Biomedical Research Network in Cancer (CIBERONC)

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De vloeibare biopsie heeft een revolutie teweeggebracht in onze benadering van oncologische translationele studies, waarbij monsterverzameling, kwaliteit en opslag cruciale stappen zijn voor de succesvolle klinische toepassing ervan. Hier beschrijven we een gestandaardiseerd en gevalideerd protocol voor downstream circulerende DNA-toepassingen die in de meeste translationele onderzoekslaboratoria kunnen worden toegepast.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De term vloeibare biopsie (LB) verwijst naar moleculen zoals eiwitten, DNA, RNA, cellen of extracellulaire blaasjes in bloed en andere lichaamsvloeistoffen die afkomstig zijn van de primaire en / of gemetastaseerde tumor. LB is naar voren gekomen als een steunpilaar in translationeel onderzoek en is begonnen deel uit te maken van de klinische oncologiepraktijk, en biedt een minimaal invasief alternatief voor solide biopsie. De LB maakt real-time monitoring van een tumor mogelijk via een minimaal invasieve monsterextractie, zoals bloed. De toepassingen omvatten vroege detectie van kanker, follow-up van patiënten voor de detectie van ziekteprogressie, beoordeling van minimale restziekte en potentiële identificatie van moleculaire progressie en resistentiemechanisme. Om een betrouwbare analyse van deze monsters te bereiken die in de kliniek kan worden gerapporteerd, moeten de preanalytische procedures zorgvuldig worden overwogen en strikt worden gevolgd. Monsterverzameling, kwaliteit en opslag zijn cruciale stappen die hun nut in downstream-toepassingen bepalen. Hier presenteren we gestandaardiseerde protocollen van onze vloeibare biopsiewerkmodule voor het verzamelen, verwerken en opslaan van plasma- en serummonsters voor downstream vloeibare biopsieanalyse op basis van circulerend vrij DNA. De hier gepresenteerde protocollen vereisen standaardapparatuur en zijn voldoende flexibel om te worden toegepast in de meeste laboratoria die gericht zijn op biologische procedures.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De term "vloeibare biopsie" werd in 2010gedefinieerd 1 als de aanwezigheid van moleculen (bijv. Eiwit, desoxyribonucleïnezuur (DNA), ribonucleïnezuur (RNA)), cellen of extracellulaire blaasjes (bijv. Exosomen) in bloed en andere lichaamsvloeistoffen die afkomstig zijn van de primaire tumor. Het gebruik van vloeibare biopsiemonsters heeft een revolutie teweeggebracht in translationeel oncologisch onderzoek, omdat weefselbiopten, beperkt tot een bepaald gebied op een bepaald moment, relevante klonen kunnen missen vanwege tumorheterogeniteit. Bovendien speelt vloeibare biopsie een relevante rol bij tumortypen waar primair weefsel schaars of niet t....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Voorafgaande ethische goedkeuring werd verkregen van deelnemende centra vóór de extractie van bloedmonsters. De volgende protocollen voor serum- en plasma-isolatie werden uitgevoerd in overeenstemming met de ethische principes voor biomedisch onderzoek.

OPMERKING: Voorafgaande overwegingen voordat u met het protocol begint, vindt u hier. Voorafgaande ethische goedkeuring is vereist voor het gebruik van menselijke monsters in biomedisch onderzoek, met de bijbehorende geïnformeerde toestemming. Een klasse II bioveiligheidskast is vereist om bloedmonsters te verwerken. Een laboratoriumjas, beschermende handschoenen en een bril moeten tijdens d....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Na centrifugering van de bloedbuizen zonder antistollingsmiddel lijkt de bovenste fase lichtgeel en komt overeen met de serumfractie (figuur 2). Deze fractie wordt zorgvuldig verwijderd en gealiquoteerd voor latere analyse.

Hemolyse kan aanwezig zijn in het plasma of de serumfractie en de bovenste fase zal een roodachtig uiterlijk hebben, wat wijst op de aanwezigheid en mate van hemolyse (figuur 3).

Na cent.......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De vloeibare biopsie heeft tal van potentiële toepassingen op verschillende momenten tijdens de behandeling van kanker. Ten eerste, bij diagnose om tumormoleculaire markers te identificeren die de aanwezigheid van een potentiële tumorlaesie zouden suggereren die klinisch verder kan worden onderzocht. Ten tweede, tijdens de behandeling voor real-time monitoring van de ziekte, beoordeling van de moleculaire respons van de behandeling, klonale evolutie en vroege detectie van terugvallen van de ziekte of behandelingsresisten.......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Beatriz Bellosillo (BB): BB ontving honoraria voor spreker, consultancy of adviserende rol van Amgen, Astra-Zeneca, Biocartis, Janssen, Merck-Serono, Novartis, Qiagen, Roche Diagnostics, Roche Pharma, ThermoFisher, Pfizer en BMS. Sara López-Tarruella (SL): SL ontving honoraria voor spreker, consultancy of adviserende rol van Astra-Zeneca / Daiichi-Sankyo, MSD, Novartis, Pfizer, Roche Pharma, Gilead, Lilly, Pierre Fabre, Seagen, GlaxoSmithKline en Veracyte. Noelia Tarazona (NT): NT ontving honoraria voor spreker, consultancy of adviserende rol van Amgen, Pfizer, Merck-Serono, Servier, SEOM en ESMO. Javier Hernandez-Losa (JHL): ontving honoraria voor spreker, consultancy of adviserende rol van Astra-Zeneca, Janssen, Novartis, Roche Diagnostics, Roche Pharma, ThermoFisher, Lilly en Diaceutics. Rodrigo Toledo (RT) meldt onderzoekssubsidies te ontvangen met betrekking tot deze studie van Novartis en onderzoeksbeurzen die geen verband houden met deze studie van AstraZeneca en Beigene. De overige auteurs hebben geen onthullingen met betrekking tot het manuscript.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We willen het Biomedical Research Network in Cancer (CIBERONC) bedanken voor hun steun en de volgende projectsubsidie: LB CIBERONC PLATFORM: CIBERONC-platform voor de standaardisatie en promotie van vloeibare biopsie. PI Rodrigo Toledo, (CIBERONC), 2019-2021.

....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1.5 mL Eppendorf tubesEppendorf0030 120.086Elke standaard buis/apparatuur kan worden gebruikt
10 mL serologische wegwerppipettenBIOFILGSP010010Elke standaard buis/apparatuur kan worden gebruikt
10 mL Vacutainer K2 EDTA buisBecton Dickinson367525Deze buizen kunnen worden gebruikt voor plasma-verzameling
15 mL polypropyleen centrifugebuizenBIOFILCFT411150Elke standaard buis/apparatuur kan worden gebruikt
3.5 mL BD Vacutainer buis zonder anticoagulansBecton Dickinson368965Zowel 8.5 of 3.5 mL buizen kunnen worden gebruikt voor serum-verzameling
4 mL polypropyleen cryogeen flacon, ronde bodem, zelfstandigCorning430662Elke standaard buis/apparatuur kan worden gebruikt
4 mL Vacutainer K2 EDTA buisBecton Dickinson367864Deze buizen kunnen worden gebruikt voor plasma-verzameling
4200 TapeStation SystemAgilentG2991BAEr zijn verschillende kwantificeringsmethoden beschikbaar met een specifieke toepassing voor cfDNA
5 mL serologische wegwerppipettenBIOFILGSP010005Elke standaard buis/apparatuur kan worden gebruikt
8.5 mL BD Vacutainer buis zonder anticoagulansBecton Dickinson366468Zowel 8.5 of 3.5 mL buizen kunnen worden gebruikt voor serum-verzameling
Centrifuge, in staat tot ~3000 x g met een swing bucket rotorThermo Fisher ScientificSorvall ST 16  10688725Elke standaard buis/apparatuur kan worden gebruikt
Vriesboxen voor 1–4 mLcryogene flaconsCorning431120Deze dozen zijn nodig bij het gebruik van 4 mL flacons voor opslag
p1000 pipette tipsCORNING4809Elke standaard buis/apparatuur kan worden gebruikt
QIAamp Circulating Nucleic Acid KitQiagen55114Elk commercieel verkrijgbaar kit dat specifiek is voor cfDNA isolatie kan worden gebruikt met dit bloedverwerkingsprotocol.
Streck Cell-Free DNA BCT CE buizen 10 mLStreck218997Deze buizen kunnen worden gebruikt voor plasma-verzameling
Temperatuurvriezer (-80 °C)ESCO2180104Elke standaard buis/apparatuur kan worden gebruikt

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alix-Panabières, C., Pantel, K. Clinical applications of circulating tumor cells and circulating tumor DNA as liquid biopsy. Cancer Discovery. 6 (5), 479-491 (2016).
  2. Zhou, B., et al. Application of exosomes as liquid biopsy....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Verwerking van bloedmonstersplasma isolatieserumverzamelingdetectie van hemolysemonsterbewaringcentrifugatieprotocoloncologisch onderzoek

Gerelateerde artikelen