Methodenartikel

In vitro selectie van aptameren om infectieuze van niet-infectieuze virussen te onderscheiden

1.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/64127

⸱

7 september 2022

 ,  ,  , 
1INQUIMAE (CONICET), Departamento de Química Inorgánica, Analítica y Química Física, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires, 2Department of Chemistry, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Department of Chemistry, University of Texas at Austin

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

We bieden een protocol dat algemeen kan worden toegepast op het selecteren van aptameren die alleen binden aan infectieuze virussen en niet aan virussen die niet-infectieus zijn gemaakt door een desinfectiemethode of aan andere soortgelijke virussen. Dit opent de mogelijkheid om de infectiviteitsstatus te bepalen in draagbare en snelle tests.

Samenvatting

Virusinfecties hebben een grote impact op de samenleving; De meeste detectiemethoden hebben moeite om te bepalen of een gedetecteerd virus besmettelijk is, wat vertragingen in de behandeling en verdere verspreiding van het virus veroorzaakt. Het ontwikkelen van nieuwe sensoren die kunnen informeren over de infecteerbaarheid van klinische of omgevingsmonsters zal deze onvervulde uitdaging aangaan. Er zijn echter maar weinig methoden die detectiemoleculen kunnen verkrijgen die een intact infectieus virus kunnen herkennen en het kunnen onderscheiden van hetzelfde virus dat niet-infectieus is gemaakt door desinfectiemethoden. Hier beschrijven we een protocol om aptameren te selecteren die infectieuze virussen kunnen onderscheiden van niet-infectieuze virussen met behulp van systematische evolutie van liganden door exponentiële verrijking (SELEX). We maken gebruik van twee functies van SELEX. Ten eerste kan SELEX op maat worden gemaakt om concurrerende doelwitten, zoals niet-infectieuze virussen of andere soortgelijke virussen, te verwijderen met behulp van tegenselectie. Bovendien kan het hele virus worden gebruikt als doelwit voor SELEX, in plaats van bijvoorbeeld een viraal oppervlakte-eiwit. Hele virus SELEX maakt de selectie van aptameren mogelijk die specifiek binden aan de inheemse toestand van het virus, zonder de noodzaak om het virus te verstoren. Met deze methode kunnen dus herkenningsmiddelen worden verkregen op basis van functionele verschillen in het oppervlak van pathogenen, die niet van tevoren bekend hoeven te zijn.

Inleiding

Virusinfecties hebben enorme economische en maatschappelijke gevolgen over de hele wereld, zoals steeds duidelijker werd uit de recente COVID-19-pandemie. Tijdige en nauwkeurige diagnose is van het grootste belang bij de behandeling van virale infecties en voorkomt de verspreiding van virussen naar gezonde mensen. Hoewel er veel virusdetectiemethoden zijn ontwikkeld, zoals PCR-tests1,2 en inmunoassays3, zijn de meeste van de momenteel gebruikte methoden niet in staat om te bepalen of het gedetecteerde virus daadwerkelijk besmettelijk is of niet. Dit komt omdat de aanwezigheid van componenten van het virus alleen, zoals viraal nucleïnezuur of eiwitten, niet aangeeft dat het intacte, infectieuze virus aanwezig is, en niveaus van deze biomarkers hebben een slechte correlatie met infectiviteitaangetoond 4,5,6. Viraal RNA, dat vaak wordt gebruikt voor de huidige PCR-gebaseerde COVID-19-tests, heeft bijvoorbeeld zeer lage niveaus in de vroege stadia van infectie wanneer de patiënt besmettelijk is, terwijl het RNA-niveau vaak nog steeds erg hoog is wanneer patiënten zijn hersteld van de infectie en niet langer besmettelijk zijn 7,8. De virale eiwit- of antigeenbiomarkers volgen een vergelijkbare trend, maar verschijnen meestal zelfs later dan het virale RNA en zijn dus nog minder voorspellend voor de infecteerbaarheid 6,9. Om deze beperking aan te pakken, zijn enkele methoden ontwikkeld die kunnen informeren over de infectiviteitsstatus van het virus, maar zijn gebaseerd op celkweekmicrobiologische technieken die veel tijd (dagen of weken) nodig hebben om resultaten te verkrijgen 4,10. Zo kan het ontwikkelen van nieuwe sensoren die kunnen informeren over de infecteerbaarheid van klinische of omgevingsmonsters vertragingen in de behandeling en verdere verspreiding van het virus voorkomen. Er zijn echter maar weinig methoden die detectiemoleculen kunnen verkrijgen die een intact infectieus virion kunnen herkennen en onderscheiden van hetzelfde virus dat niet-infectieus is gemaakt.

In deze context zijn aptameren bijzonder geschikt als een uniek biomoleculair hulpmiddel11,12,13,14. Aptameren zijn korte, enkelstrengs DNA- of RNA-moleculen met een specifieke nucleotidesequentie waarmee ze een specifieke 3D-conformatie kunnen vormen om een doelwit met hoge affiniteit en selectiviteit te herkennen15,16. Ze worden verkregen door een combinatorisch selectieproces dat systematische evolutie van liganden door exponentiële verrijking (SELEX) wordt genoemd, ook bekend als in vitro selectie, dat wordt uitgevoerd in reageerbuizen met een grote willekeurige DNA-bemonsteringsbibliotheek van 10 14-1015 sequenties17,18,19. In elke ronde van dit iteratieve proces wordt de DNA-pool eerst onderworpen aan een selectiedruk door incubatie met het doelwit onder de gewenste omstandigheden. Alle sequenties die niet aan het doel zijn gebonden, worden vervolgens verwijderd, waardoor alleen die paar sequenties overblijven die onder de gegeven omstandigheden kunnen binden. Ten slotte worden de sequenties die in de vorige stap zijn geselecteerd, versterkt door PCR, waardoor de populatie van de pool wordt verrijkt met de gewenste functionele sequenties voor de volgende selectieronde en wordt het proces herhaald. Wanneer de activiteit van de selectiepool een plateau bereikt (meestal na 8-15 rondes), wordt de bibliotheek geanalyseerd door DNA-sequencing om de winnende sequenties te identificeren die de hoogste affiniteit vertonen.

SELEX heeft unieke voordelen die kunnen worden benut om verhoogde selectiviteit te verkrijgen ten opzichte van andere vergelijkbare doelen20,21, zoals voor de infectieiviteitsstatus van het virus22. Ten eerste kan een breed scala aan verschillende soorten doelen worden gebruikt voor de selectie, van kleine moleculen en eiwitten tot hele pathogenen en cellen16. Om dus een aptamer te verkrijgen die zich bindt aan een infectieus virus, kan een intact virus als doelwit worden gebruikt, in plaats van een viraal oppervlakte-eiwit19. Hele virus SELEX maakt de selectie van aptameren mogelijk die specifiek binden aan de oorspronkelijke toestand van het virus, zonder de noodzaak van verstoring van het virus. Ten tweede kan SELEX op maat worden gemaakt om concurrerende doelen 21,23, zoals andere soortgelijke virussen of niet-infectieuze geïnactiveerde virussen, te verwijderen met behulp van tegenselectiestappen in elke selectieronde22. Tijdens de tegenselectiestappen wordt de DNA-pool blootgesteld aan doelen waarvoor binding niet gewenst is en worden eventuele sequenties die binden weggegooid.

In dit werk bieden we een protocol dat algemeen kan worden toegepast voor het selecteren van aptameren die binden aan een infectieus virus, maar niet aan hetzelfde virus dat niet-infectieus is gemaakt door een bepaalde desinfectiemethode of aan een ander verwant virus. Deze methode maakt het mogelijk om herkenningsmiddelen te verkrijgen op basis van functionele verschillen van het virusoppervlak, die niet van tevoren bekend hoeven te zijn, en biedt dus een extra voordeel voor de detectie van nieuw opgedoken pathogenen of voor onderbelichte ziekten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Bereiding van reagentia en buffers

  1. Bereid 10x Tris-boraat EDTA (10x TBE) door 0,9 M Tris-base, 0,9 M boorzuur, 20 mM EDTA (dinatriumzout) en gedeïoniseerd water toe te voegen tot een eindvolume van 1 L. Meng tot alle componenten zijn opgelost.
  2. Bereid als volgt een 10% denaturerende polyacrylamide-stockoplossing. Voeg in een glazen fles van 250 ml 120 g ureum (8 M), 25 ml 10x TBE, 62,5 ml 40% acrylamide/bisacrylamide (29:1) oplossing en voldoende gedestilleerd water toe om het uiteindelijke volume van 250 ml te bereiken. Meng tot alle componenten zijn opgelost.
  3. Bereid 2x laadbuffer als volgt voor. Voeg in een buis van 50 ml 21,636 g ureum (8 M), 1,675 g EDTA (1 mM) en 4,5 ml 10x TBE toe. Vul tot 45 ml met gedestilleerd water en meng tot alle componenten zijn opgelost.
  4. Bereid de extractiebuffer voor door 100 mM natriumacetaat en 1 mM EDTA (dinatriumzout) toe te voegen. Stel de uiteindelijke pH in op 5.
  5. Bereid ethanolprecipitatieoplossingen als volgt. Bereid 3 M natriumacetaat, stel aan tot pH 5,2 en bewaar bij 4 °C. Bereid 70% ethanol v/v en bewaar bij -20 °C. Bereid 100% ethanol en bewaar bij -20 °C.
  6. Bereid 500 ml SELEX-buffer met 1x PBS, 2,5 mM MgCl 2 en 0,5 mM CaCl2. Stel in op pH 7,4. Bereid 100 ml SELEX-buffer met 8 M ureum door 1x PBS, 2,5 mM MgCl 2, 0,5 mM CaCl2 en 8 M ureum toe te voegen. Stel in op pH 7,4.
    OPMERKING: De keuze van de SELEX-buffer is van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat de geselecteerde aptamer zal werken op het uiteindelijke monster waar de aptamer zal worden aangebracht. Aptameren die specifiek zijn voor SARS-CoV-2 zullen bijvoorbeeld worden gebruikt in biologische monsters (bijv. Speeksel of nasofarynges-swabs). Het is dus belangrijk om ionenconcentraties, pH en buffer te kiezen die die omstandigheden in de beoogde biologische monsters nauw nabootsen.
  7. Bereid de bind- en wasbuffer als volgt voor. Bereid in een buis van 50 ml 5 mM Tris, 0,5 mM EDTA (dinatriumzout) en 2 M NaCl. Stel in op pH 7,5.

2. Ontwerp en synthese van DNA-bibliotheek en primers

  1. Ontwerp de initiële ssDNA-bibliotheek en primers met de volgende criteria (zie tabel 1 voor een voorbeeld van een ssDNA-bibliotheek en een reeks primers, waarbij N een willekeurige nucleotidepositie aangeeft).
    1. Zorg ervoor dat de bibliotheek een centraal willekeurig gebied van 35 tot 60 nucleotiden bevat, geflankeerd door twee constante sequenties aan de 3'- en 5'-uiteinden die fungeren als primergebieden voor amplificatie. Een typische bibliotheeklengte is 45 willekeurige nucleotiden.
    2. Zorg ervoor dat de omgekeerde primer een biotinemodificatie bevat om ssDNA te scheiden van versterkte dubbelstrengs PCR-producten met behulp van streptavidine-gecoate kralen tijdens het in vitro selectieproces.
  2. Koop de DNA-oligo's uit commerciële bronnen met standaard ontzoutingszuivering. Zuiver de ssDNA-bibliotheek en primers met 10% denaturerende polyacrylamidegelelektroforese (dPAGE), gevolgd door ethanolprecipitatie volgens standaardprocedures24.
    LET OP: Acrylamidemonomeer en ethidiumbromide zijn gevaarlijke chemicaliën (kankerverwekkende stoffen voor de mens), dus gebruik geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (laboratoriumjassen, handschoenen en oogbescherming) tijdens het uitvoeren van PAGE. Vermijd indien mogelijk het gebruik van ethidiumbromide en vervang het door een veiligere kleurstof.
    OPMERKING: Het is mogelijk om de oligo's met HPLC-zuivering te bestellen om te voorkomen dat deze zuiveringsstap wordt uitgevoerd, hoewel dit korte oligonucleotiden niet zo effectief zal verwijderen.
  3. Voeg nucleasevrij water toe om ssDNA na ethanolprecipitatie te resuspenderen tot de gewenste concentratie (100 μM). Bepaal de concentratie van de ssDNA-bibliotheek en primers door UV-absorptie bij λ = 260 nm. Bewaren bij -20 °C.
  4. Koop een ongewijzigde omgekeerde primer om te gebruiken voor high-throughput sequencing, bibliotheekvoorbereiding en qPCR-kwantificering.

3. Infectieuze en niet-infectieuze virusmonsters

LET OP: De infectieuze en niet-infectieuze virusmonsters zijn bioveiligheidsniveau 2 (BSL2) monsters die extra zorg vereisen om veilig en op de juiste manier te hanteren. Alle stappen van de procedure die deze monsters bevatten, moeten worden uitgevoerd in een bioveiligheidskast of de virusoplossing moet zich in een afgesloten container bevinden (bijvoorbeeld afgedekte plastic buizen).

  1. Verkrijg een stamoplossing van infectieuze virussen of bereid ze voor, volgens het overeenkomstige protocol voor elk virus. De SARS-CoV-2, SARS-CoV-1 en H5N1 pseudovirussen die hier worden gebruikt, werden geleverd door het laboratorium van Prof. Lijun Rong (UIC) in PBS-buffer en werden voorbereid volgens de gerapporteerde protocollen22,25,26.
    OPMERKING: Voor virussen die bioveiligheidsniveau 3-faciliteiten nodig hebben om het intacte infectieuze virus te verwerken, is het mogelijk om met pseudovirussen te werken. Een pseudogetypeerd virus wordt gegenereerd uit een lentivirus (HIV) dat de oppervlakte-eiwitten van het virus in de virale envelop weergeeft en zo het oppervlak en het ingangsmechanisme van het virus nabootst, maar defect is in continue virale replicatie.
  2. Verkrijg een niet-infectieuze virusoplossing of bereid deze door de desinfectieprocedure te volgen. De UV-geïnactiveerde SARS-CoV-2 pseudovirus (p-SARS-CoV-2) voorraad die hier wordt gebruikt, werd geleverd door Prof. Rong lab (UIC) in PBS-buffer, en het eerder gerapporteerde protocol werd gebruikt voor UV-inactivatie22.
    OPMERKING: Voer indien mogelijk een test uit om de infectiviteit van het virus te testen om er zeker van te zijn dat het virus volledig is geïnactiveerd.
  3. Kwantificeer de virusvoorraden
    1. Kwantificeer het virus met behulp van een plaquetest volgens standaardprocedures27,28,29. Deze test maakt niet alleen de kwantificering van het virus mogelijk, maar geeft ook de infectiviteitsstatus van het virus aan, wat de concentratie van het infectieuze virus bevestigt.
    2. Voor pseudovirussen of virussen waarvoor geen plaquetest beschikbaar is, kwantificeert u het virus met behulp van een in de handel verkrijgbare kwantitatieve lentivirus ELISA-kit.
    3. Bereid 1 x 108 kopieën/ml stamoplossing voor p-SARS-CoV-2, p-SARS-CoV-1 en p-H5N1. Scheid elke stamoplossing in aliquots met elk 50 μL en bewaar bij -80 °C. Ontdooi een nieuw aliquot voor elk experiment.

4. In vitro selectie of SELEX-proces: eerste ronde

OPMERKING: Voor alle stappen met behulp van het besmettelijke virus, werk in een BSL2-kast.

  1. Denatureer de ssDNA-bibliotheek. Neem 10 μL van 100 μM van de ssDNA-bibliotheek (1 nmol) en meng met 240 μL SELEX-buffer. Verwarm gedurende 15 minuten op 95 °C in een droogbad en plaats de buis vervolgens gedurende 15 minuten op ijs.
  2. Incubeer de ssDNA-bibliotheek als volgt met het infectieuze virus (positieve selectiestap). Meng 250 μL ssDNA-bibliotheek in SELEX-buffer uit stap 4.1 met 50 μL infectieus virus (1 x 108 kopieën/ml). Incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
  3. Blokkeer de niet-specifieke locaties in centrifugefilters als volgt. Terwijl u wacht op stap 4.2, bereidt u de centrifugefilters voor op de volgende stappen.
    1. Voeg 400 μL 1 mM T20-sequentie (tabel 1) toe aan elk centrifugefilter van 0,5 ml dat zal worden gebruikt- één centrifugefilter met een afsnijding van 100 kDa en één met een afsnijding van 10 kDa.
    2. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 14.000 x g om de T20-oplossing in het filter te verwijderen. Was 3x met SELEX buffer om overtollige T20 sequenties te verwijderen.
  4. Was ongebonden sequenties als volgt. Voeg het in stap 4.2 geïncubeerde mengsel toe aan het geblokkeerde centrifugefilter van 100 kDa en centrifugeer gedurende 10 minuten op 14.000 x g . 3x wassen, 400 μL SELEX-buffer toevoegen en centrifugeren op 14.000 x g gedurende 10 minuten. Houd de fractie in het filter en gooi de doorstroom weg.
  5. Elut gebonden sequenties zoals hieronder beschreven.
    1. Vervang de opvangbuis van het centrifugefilter en voeg in stap 4.4 300 μL SELEX-buffer met 8 M ureum toe aan het centrifugefilter. Verwarm het centrifugefilter gedurende 15 minuten op 95 °C in een droogbad en centrifugeer vervolgens gedurende 10 minuten op 14.000 x g .
    2. Verzamel de fractie die door het filter met de geëlueerde sequenties is gestroomd. Herhaal dit nog drie keer. Werk in een BSL2-kast en was alle materialen met 10% bleekmiddel om het virus te inactiveren voordat u de materialen weggooit.
  6. Concentreer en ontzout als volgt. Voeg de in 4.5 opgevangen oplossing toe aan een geblokkeerd centrifugefilter van 10 kDa. Centrifugeer op 14.000 x g gedurende 15 min. Gooi de fractie weg die door het filter is gestroomd.
    OPMERKING: Aangezien de virussen in de vorige stap worden vastgehouden en geïnactiveerd met 8 M ureum in het filter, hoeven deze en de volgende stappen niet in de bioveiligheidskast te worden uitgevoerd. Deze procedure moet worden herhaald als een centrifugebuis van 0,5 ml wordt gebruikt totdat alle oplossing is verzameld, zoals in stap 4.5, 1,2 ml stroomt door het filter.
  7. Was 3x met 300 μL SELEX-buffer om het ureum te verwijderen door gedurende 15 minuten te centrifugeren op 14.000 x g . Gooi de fractie weg die door het filter is gestroomd. Recupereer de oplossing in het filter door deze ondersteboven te draaien in een schone opvangbuis en gedurende 5 minuten te centrifugeren.
  8. Meet het uiteindelijke volume van de teruggewonnen oplossing van 4.7 met behulp van een pipet in een plastic buis. Deze oplossing heet R i a, waarbij i overeenkomt met het ronde getal. Doorgaans worden volumes tussen 30 μL en 50 μL verkregen. Neem 1 μL van het geëlueerde ssDNA om de hoeveelheid DNA met qPCR te kwantificeren.
    OPMERKING: Dit is een mogelijk pauzepunt, waar het R1a-monster op −20 °C kan worden bewaard om op een ander tijdstip verder te gaan.
  9. Voer PCR-versterking uit zoals hieronder beschreven.
    1. Neem in de eerste ronde 90% van de R1een monster als PCR-sjabloon. Neem in de volgende rondes 60% van het totale volume in stap 4.8 om PCR uit te voeren en bewaar de andere fractie bij -20 °C.
    2. Stel een 50 μL PCR-reactie op met de volgende met de gespecificeerde eindconcentratie: 1x PCR-reactiebuffer, 200 μM dNTPs, 10 μL DNA-sjabloon (R 1 eenmonster), 200 nM elke primer en 1,25 U polymerase (2,5 U/μL voorraad).
    3. Optimaliseer de PCR-condities, inclusief het aantal cycli en de gloeitemperatuur voor elke set primers en ssDNA-bibliotheek. Vermijd het gebruik van te veel cycli, die ongewenste PCR-subproducten zoals primer-dimeren zullen produceren. Test verschillende gloeitemperaturen op basis van de smelttemperatuur van de primers.
    4. Voer de PCR uit met geoptimaliseerde omstandigheden bij 95 °C gedurende 5 minuten, gevolgd door 18 cycli van 1 min bij 95 °C, 30 s bij 52 °C en 1 min bij 72 °C, met een laatste uitbreidingsstap bij 72 °C gedurende 10 minuten, om de dsDNA-pool te verkrijgen.
      OPMERKING: Dit is een ander mogelijk pauzepunt, waar het PCR-product op −20 °C kan worden gehouden om op een ander moment door te gaan.
  10. Herstel ssDNA met behulp van streptavidin-gemodificeerde magnetische kralen.
    1. Neem 80% van het PCR-product. Bewaar de resterende fractie bij -20 °C.
    2. Splits het PCR-product in aliquots van 50 μL en voeg ze toe aan microfugebuizen die 50 μL streptavidin-gemodificeerde magnetische kralen (MB) bevatten. Incubeer gedurende 30 minuten met milde agitatie (gebruik bijvoorbeeld een roterende schudder) bij kamertemperatuur. Plaats vervolgens de microfugebuis op het magnetische rek om de MB te isoleren en verwijder het supernatant door pipetteren (het moet een duidelijke oplossing zijn).
    3. Wassen door 200 μL bind- en wasbuffer aan de buis toe te voegen. Verwijder de buis uit het magnetische rek, tik op de buis en resuspensie van de MB tot een homogene oplossing door pipetteren. Plaats de microfugebuis terug op het magnetische rek om de MB te isoleren en verwijder het supernatant door pipetteren. Herhaal deze wasstap twee keer.
    4. Zodra het wassen is voltooid, resuspendeert u de MB in een totaal van 100 μL SELEX-buffer en verwarmt u de oplossing gedurende 10 minuten tot 95 °C. Plaats de buis onmiddellijk in het magnetische rek voordat de buis afkoelt en neem het supernatant met de ssDNA-pool. Herhaal deze herstelstap en voeg 50 μL SELEX-buffer toe.
  11. Meet het uiteindelijke volume van de teruggewonnen fractie van 4.10 met behulp van een pipet. Deze breuk wordt R i x genoemd, waarbij i overeenkomt met het ronde getal. Over het algemeen worden volumes tussen 140 en 150 μL verkregen. Neem 1 μL R1x om de hoeveelheid DNA te kwantificeren met qPCR.

5. Volgende selectierondes

  1. Denatureer de ssDNA-pool. Neem 60% van monster R1x en meng met 50 μL SELEX-buffer. Verwarm gedurende 15 minuten op 95 °C in een droog bad. Plaats de buis 15 minuten op ijs.
  2. Incubeer de ssDNA-pool met het niet-infectieuze virus en andere potentieel storende virussen (tegenselectiestap). Meng de gedenatureerde ssDNA-pool in SELEX-buffer van 5,1 met 50 μL van elk virus (5 x 109 kopieën/ml; bijv. niet-infectieuze p-SARS-CoV-2, p-SARS-CoV-1 en p-H5N1). Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
  3. Blokkeer niet-specifieke locaties in centrifugefilters. Terwijl u wacht op stap 5.2, bereidt u de centrifugefilters voor op de volgende stappen. Gebruik meestal twee centrifugefilters, één met een cut-off van 100 kDa en één met een cut-off van 10 kDa. Volg dezelfde procedure als in 4.3.
  4. Was de sequenties weg die gebonden zijn aan niet-doelvirussen. Voeg het in stap 5.2 geïncubeerde mengsel toe aan een geblokkeerd centrifugefilter van 100 kDa. Centrifugeer gedurende 10 minuten op 14.000 x g en win de fractie terug die door het centrifugefilter stroomt. Was 2x, voeg 100 μL SELEX-buffer toe en centrifugeer gedurende 10 minuten op 14.000 x g . Bewaar de fractie die door het filter is gestroomd.
  5. Incubeer de ssDNA-pool met het infectieuze virus (positieve selectiestap). Neem de fractie van 300 μL uit stap 5.4 en meng met 50 μL van het infectieuze virus (1 x 108 kopieën/ml). Incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur. Volg stap 4.4 tot en met 4.11.

6. Monitoring van het SELEX-proces

OPMERKING: Om de verrijking van het zwembad te controleren, wordt qPCR op twee manieren gebruikt. Ten eerste is het door absolute kwantificering mogelijk om de verrijking van de pools te testen (elutieopbrengst). Ten tweede kan door het monitoren van de smeltcurve de diversiteit van de poelen (convergentie van de aptamersoorten) worden geëvalueerd30.

  1. Voer alle qPCR-assays uit met een reactievolume van 10 μL in 96-well-platen die zijn ontworpen voor qPCR.
  2. Bereid een standaard qPCR-mengsel met 5 μL mastermix, 0,3 μL 500 nM van elke niet-gelabelde primer, 3,4 μL H2O en 1 μL DNA-sjabloon.
    1. Bereid verdunningen van de gezuiverde ssDNA-bibliotheek voor (stap 2.3) om de standaardcurve uit te voeren.
    2. Verdun de DNA-monsters om hun concentratie in de standaardcurve te laten passen. Voeg voor Ria-monsters 1 μl van het monster zonder verdunning en 1 μl 1:10-verdunning toe aan het qPCR-mengsel. Neem voor Rix-monsters verdunningen van 1:10 of 1:100 op.
  3. Voer qPCR uit door het volgende protocol in te stellen. Stel eerst een eerste denaturatiestap in op 98 °C gedurende 2 minuten. Stel vervolgens 40 cycli van denaturatie in bij 98 °C gedurende 5 s en gloeien en verlengen bij 52 °C gedurende 10 s. Stel ten slotte een smeltcurveanalyse in van 65 tot 95 °C. Bepaal ct-waarden (threshold cycle) door geautomatiseerde drempelanalyse.
  4. Kwantificeer met behulp van de standaardcurve de hoeveelheid ssDNA in R i a- enRix-monsters.
  5. Bereken de elutieopbrengst als de hoeveelheid gebonden DNA (aantal mol in R i a) gedeeld door de hoeveelheid initieel DNA (aantal mol in Ri-1x). Plot de elutieopbrengst versus het ronde getal om te zien of er een verrijking over de rondes wordt waargenomen.
  6. Zet de smeltcurves uit voor verschillende rondes. Een verschuiving naar hogere smelttemperaturen in de piek in de buurt van 75/85 °C wordt verwacht naarmate het aantal rondes toeneemt. Hierdoor neemt de diversiteit van het zwembad af.

7. High-throughput sequencing

  1. Overleg met de high-throughput sequencing-faciliteit over welke sequencingtypen en schalen beschikbaar zijn, die de voorbereidingsmethode van de bibliotheek bepalen.
    OPMERKING: Deze beslissing houdt rekening met zowel de lengte van de pools die moeten worden gesequenced (inclusief de primers) als het aantal pools dat moet worden ingediend (streef over het algemeen naar ten minste 1 x 105-10 6 sequenties per zwembad). Als een bepaalde sequencingschaal niet de volledige lengte van de pool kan lezen, kan paired-end sequencing worden gebruikt om van beide uiteinden van de reeks te lezen, in tegenstelling tot single-end dat van slechts één uiteinde leest.
  2. Selecteer een geschikte commercieel verkrijgbare kit op basis van het type sequencing, in overleg met de sequencingfaciliteit. Bereid meerdere pools van selectierondes voor die hoge, gemiddelde en lage verrijking vertegenwoordigen, evenals de uiteindelijke pool, met behulp van een ander paar indexen in de adapters voor elke pool die de monsteranalyse van alle rondes met behulp van één baan mogelijk maakten.
    OPMERKING: PCR-versterking kan ook worden gebruikt om de adapters en indexen op te nemen die nodig zijn voor sequencing met hoge doorvoer, maar dit kost over het algemeen vergelijkbaar met de commerciële kits en presteert niet beter.
    1. Voer de bibliotheekvoorbereiding uit door deze stappen te volgen: beëindig reparatie van gefragmenteerd DNA, adapterligatie en PCR-amplificatie om de uiteindelijke bibliotheken te produceren.
    2. Zuiver het PCR-product met magnetische DNA-opruimkralen volgens de instructies van de fabrikant.
    3. Kwantificeer het DNA met behulp van een op fluorescentie gebaseerde kwantificeringskit. Vermijd het gebruik van minder nauwkeurige methoden, zoals uv-metingen met een klein volume.
    4. Meng ongeveer gelijke hoeveelheden (op basis van hoeveelheid DNA, niet op volume) van elke poolbibliotheek met specifieke indexen.
    5. Controleer de kwaliteit van de uiteindelijke bibliotheek met qPCR-kwantificering en een DNA-fragmentanalysator. Deze stap wordt vaak uitgevoerd door de sequencingfaciliteit.
      OPMERKING: Het personeel van de sequencingfaciliteit kan nuttige informatie geven over hoe de bibliotheek moet worden voorbereid en welke kwaliteitscontroles worden voorgesteld. Overleg met hen is vereist voordat de bibliotheken worden voorbereid.
  3. Stuur de voorbereide definitieve bibliotheek naar de sequencingfaciliteit volgens hun vereisten.

8. Sequencing analyse

  1. De meeste software die beschikbaar is voor sequencing-analyse is ontworpen om te worden uitgevoerd op de opdrachtregel op een Linux-besturingssysteem. Voor kleine datasets stelt u het gewenste Linux-besturingssysteem in en installeert u de vereiste programma's op een pc; voor grotere gegevenssets wordt HTS-analyse uitgevoerd op high-performance computing-resources of supercomputers (aanbevolen).
    OPMERKING: Toegang en training zijn nodig om high-performance computing-bronnen te gebruiken, wat enige tijd kan duren om te verkrijgen. Daarnaast is basiskennis van unix-opdrachtregelgebruik vereist. Veel gratis bronnen over basisgebruik vanaf de opdrachtregel zijn online beschikbaar en de computerbronnen zullen waarschijnlijk aanvullende informatie bieden voor het gebruik van hun systemen.
  2. Open de sequencingbestanden, meestal in een gecomprimeerde FastQ-bestandsindeling, met behulp van de informatie die door de sequencingfaciliteit wordt verstrekt.
    1. Gebruik een FTP-client om de bestanden over te brengen naar uw eigen computer en/of de high-performance computerbron. Veel sequentieanalyseprogramma's kunnen rechtstreeks gecomprimeerde bestanden gebruiken, dus houd de bestanden indien mogelijk gecomprimeerd om hun bestandsgrootte te beperken (grote reekslezingen van 50 M + -sequenties kunnen 100 Gb + bestandsruimte in beslag nemen wanneer ze niet zijn gecomprimeerd).
    2. Als sequentiebestanden moeten worden gedecomprimeerd, gebruik dan de gzip-functie die standaard is op de meeste Linux-installaties. Verkrijg aanvullende informatie over gzip en de opties uit de geïnstalleerde handleiding door "man gzip" op de opdrachtregel te typen.
  3. Ruim de sequenties op vóór de analyse door te demultiplexen, de sequencingadapters te verwijderen, leesbewerkingen van lage kwaliteit te verwijderen en zowel voorwaartse als omgekeerde richtingsleesbewerkingen op te nemen.
    1. Gebruik het FastQC-programma31 na elk van de volgende stappen om basisinformatie over kwaliteitscontrole over de sequenties te krijgen om de effectiviteit van elke opschoningsstap te beoordelen.
    2. Demultiplex de sequenties om alle sequenties van een enkel leesbestand te scheiden in de verschillende pools op basis van de indexen in de sequencingadapters. Deze stap wordt vaak uitgevoerd door de sequencingfaciliteit, die moet worden geraadpleegd omdat de exacte procedure afhankelijk is van de gebruikte sequencingmachine.
    3. Verwijder de sequencingadapters met het opdrachtregelprogramma Cutadapt32. Gebruik de selectieprimers (in plaats van sequencingadapters) als invoer in de modus Gekoppelde adapter. Gebruik de optie --distributed-untrimmed om reeksen te verwijderen die de selectieprimers niet bevatten.
    4. Stel opties in voor het maximale foutenpercentage dat overeenkomt met de adapters en de minimale en maximale lengte van reeksen die moeten worden geaccepteerd. Als u gekoppelde eindleesbewerkingen gebruikt, voert u specifieke parameters in die beschikbaar zijn en geeft u zowel de volgorde van Lezen 1 als die van Lezen 2. Stel indien nodig aanvullende parameters in door te verwijzen naar de Cutadapt-handleiding32.
      OPMERKING: De ligatie van sequencingadapters naar pools is richtingonafhankelijk en omvat ongeveer 50% van de sequenties in de voorwaartse richting en 50% in de omgekeerde richting. Om te voorkomen dat de 50% van de sequenties in de omgekeerde richting verloren gaat, kan Cutadapt een tweede keer worden uitgevoerd met behulp van de omgekeerde aanvulling van de selectieprimers als invoer.
    5. (Optioneel) Als paired-end sequencing wordt gebruikt, voegt u de Read 1- en Read 2-bestanden samen met het programma PEAR33.
    6. Gebruik het FASTX-Toolkit-programma34 om sequenties van lage kwaliteit te verwijderen die een kwaliteit hebben onder een bepaalde drempel bij elk nucleotide. Een kwaliteitsscore van 30 is een goed uitgangspunt. Als de algehele kwaliteit over het algemeen goed is, kan deze stap worden overgeslagen.
    7. Om de sequentiebestanden in de omgekeerde richting samen te voegen met die in de voorwaartse richting, gebruikt u de FASTX-Toolkit fastx_reverse_complement functie op de bestanden in omgekeerde richting. Gebruik vervolgens het ingebouwde cat-programma (standaard op de meeste Linux-installaties) om de forward en reverse-complement - reverse bestanden samen te voegen tot één bestand.
  4. Om de verrijking van sequenties in verschillende selectiepools te analyseren, gebruikt u de FASTAptamer-analysetoolkit35.
    1. Gebruik FASTAptamer-Count om het aantal keren te tellen dat elke reeks verschijnt. Rangschik en sorteer vervolgens de reeksen op overvloed. Het count-uitvoerbestand is vereist als invoer voor alle andere FASTAptamer-programma's.
    2. Gebruik FASTAptamer-Clust om alle sequenties in een bestand te groeperen in clusters van nauw verwante sequenties. Gebruik de parameter "afstand" om het aantal afzonderlijke nucleotidemutaties of indels te definiëren dat in een cluster mag worden gegroepeerd.
      OPMERKING: Het FASTAptamer-Clust-programma kan rekenkundig erg duur zijn als er een groot aantal unieke sequenties aanwezig is (vooral voor vroege rondes), wat dagen of zelfs weken kan duren om volledig te voltooien. De parameter cut-off filter kan worden gebruikt om sequenties met een lage abundantie uit te sluiten van clustering. Over het algemeen is het goed om te beginnen met een hogere cut-off, zoals 10 of 5 reads per million (RPM) en deze te verlagen als het programma snel klaar is. Als de pools zeer heterogeen zijn, is het mogelijk niet haalbaar om de sequenties binnen een redelijk tijdsbestek te clusteren.
    3. Gebruik FASTAptamer-Enrich om de verrijking van elke sequentie te berekenen die in meer dan één ronde van de selectie aanwezig is. Vergelijk het toerental van de reeks van de ene populatie met het toerental van de ene populatie met het toerental van een andere. Gebruik het programma Verrijken op de bestanden Count of Cluster. De uitvoer is een tab-separated-value (.tsv) -bestand dat in elke spreadsheetsoftware kan worden geopend voor verdere analyse en eenvoudige sortering.
      OPMERKING: Het FASTAptamer-Enrich-programma kan ook zeer rekenkundig duur zijn als er een groot aantal unieke sequenties aanwezig zijn. De parameter cut-off filter kan worden gebruikt om reeksen met een lage abundantie uit te sluiten van de uitvoer om bestanden te vermijden die te groot zijn om te openen in spreadsheetsoftware.
    4. (Optioneel) Als veel pools te heterogeen zijn (veel unieke sequenties en weinig dubbele sequenties), is het mogelijk niet haalbaar om de programma's Clust of Enrich te gebruiken. Voer in dit geval een handmatige verrijkingscontrole uit met behulp van het Count-uitvoerbestand dat sequenties sorteert op abundantie (meest overvloedig de bovenaan) en de sequentie-id hernoemt om belangrijke informatie zoals RPM op te nemen.
      1. Gebruik het standaard Linux "head" -programma op de Count-bestanden om een lijst met de meest voorkomende sequenties te krijgen. Gebruik vervolgens het standaard Linux "grep" -programma om elk van de meest voorkomende sequenties in de Count-bestanden van alle andere relevante pools te doorzoeken. Als er overeenkomsten zijn, gebruikt u de gewijzigde sequentie-id om de RPM in die pool te bepalen om de verrijkingsinformatie handmatig samen te stellen.
        OPMERKING: Scripts voor alle sequencing-analysestappen zijn te vinden in de aanvullende coderingsbestanden 1-11.

9. Aptamer bindende validatie en assays

  1. Identificeer op basis van de verrijkingsinformatie die door middel van sequentieanalyse is verkregen, kandidaat-aptamersequenties op basis van sequenties die de meeste verrijking hebben tijdens volgende selectierondes en/of de meest voorkomende sequenties in de laatste selectieronde. Selecteer verschillende kandidaat-sequenties (ten minste 10-20) voor verdere tests, omdat de meest verrijkte niet noodzakelijkerwijs de best presterende aptameren zijn.
  2. Voer de eerste screening van kandidaat-aptameren uit met behulp van een bindingstest die snel kan worden uitgevoerd voor meerdere monsters. Een kolomgebaseerde ultrafiltratiebindingstest36 of enzymgebonden oligonucleotidetest (ELONA) zijn goede methoden voor deze eerste screening.
  3. Analyseer de specificiteit en affiniteit van de sequenties die de beste bindingsactiviteit van de eerste screening vertonen, met behulp van ten minste twee onafhankelijke bindingstests (bijv. MicroScale Thermophoresis (MST)37,38, Enzyme-Linked Oligonucleotide Assay (ELONA)39, oppervlakteplasmonresonantie 40 of biolayer interferometrie (BLI)41).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Aangezien DNA-aptameren kunnen worden verkregen met behulp van SELEX in een reageerbuis15, is deze SELEX-strategie zorgvuldig ontworpen om zowel positieve selectiestappen naar het intacte, hele infectieuze virus te omvatten (d.w.z. de DNA-moleculen te behouden die aan het infectieuze virus binden), als tegenselectiestappen voor hetzelfde virus dat niet-infectieus is gemaakt door een bepaalde desinfectiemethode, specifiek UV-behandeling, door het weggooien van de DNA-sequenties die kunnen binden a...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

SELEX maakt niet alleen de identificatie mogelijk van aptameren met een hoge affiniteit, in het pM-nM-bereik 22,43,44,45, maar ook met een hoge en instelbare selectiviteit. Door gebruik te maken van tegenselectie kunnen aptameren met uitdagende selectiviteit worden verkregen. De Li-groep heeft bijvoorbeeld het vermogen aangetoond om sequenties te verkrijgen die pathogene bacteriestammen kunnen...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

We willen mevrouw Laura M. Cooper en Dr. Lijun Rong van de Universiteit van Illinois in Chicago bedanken voor het verstrekken van de pseudovirusmonsters die in dit protocol worden gebruikt (SARS-CoV-2, SARS-CoV-1, H5N1), evenals Dr. Alvaro Hernandez en Dr. Chris Wright van de DNA Services-faciliteit van het Roy J. Carver Biotechnology Center aan de Universiteit van Illinois in Urbana-Champaign voor hun hulp bij high-throughput sequencing, en veel leden van de Lu-groep die ons hebben geholpen met in vitro selectie en aptamer karakteriseringstechnieken. Dit werk werd ondersteund door een RAPID-subsidie van de National Science Foundation (CBET 20-29215) en een zaadsubsidie van het Institute for Sustainability, Energy and Environment aan de Universiteit van Illinois in Urbana-Champaign en Illinois-JITRI Institute (JITRI 23965). A.S.P. bedankt de PEW Latin American Fellowship voor de financiële steun. We bedanken ook de Robert A. Welch Foundation (Grant F-0020) voor de ondersteuning van het Lu-groepsonderzoeksprogramma aan de Universiteit van Texas in Austin.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
10% Ammonium persulfate (APS)BioRad1610700
100% EthanolSigma-AldrichE7023
1x PBS without calcium & magnesiumCorning21-040-CM
40% acrylamide/bisacrylamide (29:1) solutionBioRad1610146
Agencourt AMPure XP BeadsBeckman CoulterA63880DNA clean-up beads - Section 7.2.2
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter UnitMerckUFC501024cut-off 10 kDa
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter UnitMerckUFC510024cut-off 100 kDa
Boric AcidSigma-Aldrich100165
C1000 Touch Thermal Cycler with Dual 48/48 Fast Reaction ModuleBioRad1851148
Calcium ChlorideSigma-AldrichC4901
CFX Connect Real-Time PCR Detection SystemBioRad1855201
Digital Dry Baths/Block HeatersThermo Scientific88870001
Dynabeads MyOne Streptavidin C1Thermo Fisher65001streptavidin-modified magnetic beads - Section 4.9
EDTA disodium saltSigma-Aldrich324503
Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubesSigma-AldrichT96611.5 mL
Lenti-X p24 Rapid Titer KitTakara Bio USA, Inc.632200Lentivirus quantification kit - Section 3.3.2.1
MagJET Separation Rack, 12 x 1.5 mL tubeThermo ScientificMR02
Magnesium chlorideSigma-AldrichM8266
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, opticalBioRadMSB1001non-UV absorbing
Mini-PROTEAN Tetra Cell for Ready Gel Precast GelsBioRad1658004EDU
Mini-PROTEAN Short PlatesBioRad1653308
Mini-PROTEAN Spacer Plates with 0.75 mm Integrated SpacersBioRad1653310
Molecular Biology Grade WaterLonza51200
Multiplate 96-Well PCR Plates, high profile, unskirted, clearBioRadMLP9611
Nanodrop OneThermo ScientificND-ONE-W
OneTaq DNA PolymeraseNew England BioLabM0480S
Ovation Ultralow v2 + UDITecan0344NB-A01High-troughput sequencing library preparation kit - Section 7.2.
PIPETMAN G (100-1000 µL, 20-200 µL, 2-20 µL and 0.2-2 µL)GilsonF144059M, F144058M, F144056M, F144054M
Purifier Logic+ Class II, Type A2 Biosafety CabinetsLabconco4261
Qubit dsDNA BR Assay KitInvitrogenQ32850fluorescence-based  dsDNA quantification  kit - Section 7.2.3
SHARP Classic Low Retention Pipet Tips (10 uL, 200 uL, 1000 uL)Thomas Scientific1158U43, 1159M44, 1158U40
Sodium acetateSigma-AldrichS2889
Sodium chlorideSigma-AldrichS7653
Sorvall Legend Micro 17R MicrocentrifugeThermo Scientific75002440
SsoFast EvaGreen SupermixBioRad1725201qPCR mastermix - Section 6.2.
Tris(hydroxymethyl)aminomethaneSigma-AldrichT1503
Tubes and Ultra Clear Caps, strips of 8USA scientificAB1183PCR tubes
UreaSigma-AldrichU5128

Referenties

  1. Carter, L. J., et al. Assay techniques and test development for COVID-19 diagnosis. ACS Central Science. 6 (5), 591-605 (2020).
  2. Ranoa, D. R. E., et al. Saliva-based molecular testing for SARS-CoV-2 that bypasses RNA extraction. bioRxiv. , 1-35 (2020).
  3. Tang, Z., et al. A materials-science perspective on tackling COVID-19. Nature Reviews Materials. 5 (11), 847-860 (2020).
  4. Cook, N., Cliver, D. O. VIRUSES | Detection. Encyclopedia of Food Microbiology. 3, 727-731 (2014).
  5. Weissleder, R., Lee, H., Ko, J., Pittet, M. J. COVID-19 diagnostics in context. Science Translational Medicine. 12 (546), 1-7 (2020).
  6. Joynt, G. M., Wu, W. K. Understanding COVID-19: what does viral RNA load really mean. The Lancet Infectious Diseases. 3099 (20), 19-20 (2020).
  7. Wölfel, R., et al. Virological assessment of hospitalized patients with COVID-2019. Nature. 581 (7809), 465-469 (2020).
  8. Perera, R. A. P. M., et al. SARS-CoV-2 virus culture and subgenomic RNA for respiratory specimens from patients with mild coronavirus disease. Emerging Infectious Diseases. 26 (11), 2701-2704 (2020).
  9. Sethuraman, N., Jeremiah, S. S., Ryo, A. Interpreting diagnostic tests for SARS-CoV-2. JAMA - Journal of the American Medical Association. 323 (22), 2249-2251 (2020).
  10. Basile, K., et al. Cell-based culture informs infectivity and safe de-isolation assessments in patients with coronavirus disease 2019. Clinical Infectious Diseases. 73 (9), 2952-2959 (2021).
  11. Xing, H., Hwang, K., Li, J., Torabi, S. -F., Lu, Y. DNA aptamer technology for personalized medicine. Current Opinion in Chemical Engineering. 4, 79-87 (2014).
  12. Xiong, Y., et al. Functional DNA regulated CRISPR-Cas12a sensors for point-of-care diagnostics of non-nucleic-acid targets. Journal of the American Chemical Society. 142 (1), 207-213 (2020).
  13. Lake, R. J., Yang, Z., Zhang, J., Lu, Y. DNAzymes as activity-based sensors for metal ions: recent applications, demonstrated advantages, current challenges, and future directions. Accounts of Chemical Research. 52 (12), 3275-3286 (2019).
  14. Chakraborty, B., et al. Aptamers for viral detection and inhibition. ACS Infectious Diseases. 8 (4), 667-692 (2022).
  15. Liu, J., Cao, Z., Lu, Y. Functional nucleic acid sensors. Chemical Reviews. 109 (5), 1948-1998 (2009).
  16. Dunn, M. R., Jimenez, R. M., Chaput, J. C. Analysis of aptamer discovery and technology. Nature Reviews Chemistry. 1 (10), 1-16 (2017).
  17. Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
  18. Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249 (4968), 505-510 (1990).
  19. Sefah, K., Shangguan, D., Xiong, X., O'Donoghue, M. B., Tan, W. Development of DNA aptamers using Cell-SELEX. Nature Protocols. 5 (6), 1169-1185 (2010).
  20. Bruesehoff, P. J., Li, J., Augustine, A. J., Lu, Y. Improving metal ion specificity during in vitro selection of catalytic DNA. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 5 (4), 327-335 (2012).
  21. Shen, Z., et al. A catalytic DNA activated by a specific strain of bacterial pathogen. Angewandte Chemie International Edition. 55 (7), 2431-2434 (2016).
  22. Peinetti, A. S., et al. Direct detection of human adenovirus or SARS-CoV-2 with ability to inform infectivity using DNA aptamer-nanopore sensors. Science Advances. 7 (39), (2021).
  23. Ihms, H. E., Lu, Y. In vitro selection of metal ion-selective DNAzymes. Ribozymes: Methods and Protocols. , 297-316 (2012).
  24. Summer, H., Grämer, R., Dröge, P. Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (urea PAGE). Journal of Visualized Experiments. (32), e1485(2009).
  25. Cui, Q., et al. Identification of diaryl-quinoline compounds as entry inhibitors of Ebola virus. Viruses. 10 (12), 678(2018).
  26. Guo, Y., et al. Identification of a new region of SARS-CoV S protein critical for viral entry. Journal of Molecular Biology. 394 (4), 600-605 (2009).
  27. Panec, M., Katz, D. S. Plaque assay protocols. Protocols American Society for Microbiology. 7, 1-5 (2011).
  28. Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: Using traditional and novel overlay systems. Journal of Visualized Experiments. (93), 1-10 (2014).
  29. Mendoza, E. J., Manguiat, K., Wood, H., Drebot, M. Two detailed plaque assay protocols for the quantification of infectious SARS-CoV-2. Current Protocols in Microbiology. 57 (1), 1-15 (2020).
  30. Luo, Z., He, L., Wang, J., Fang, X., Zhang, L. Developing a combined strategy for monitoring the progress of aptamer selection. The Analyst. 142 (17), 3136-3139 (2017).
  31. Babraham bioinformatics - FastQC a quality control tool for high throughput sequence data. , Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2022).
  32. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10(2011).
  33. Zhang, J., Kobert, K., Flouri, T., Stamatakis, A. P. E. A. R. PEAR: a fast and accurate Illumina Paired-End reAd mergeR. Bioinformatics. 30 (5), 614-620 (2014).
  34. FASTX-Toolkit. , Available from: http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/ (2022).
  35. Alam, K. K., Chang, J. L., Burke, D. H. FASTAptamer: A bioinformatic toolkit for high-throughput sequence analysis of combinatorial selections. Molecular Therapy-Nucleic Acids. 4 (3), 230(2015).
  36. McKeague, M., et al. Comprehensive analytical comparison of strategies used for small molecule aptamer evaluation. Analytical Chemistry. 87 (17), 8608-8612 (2015).
  37. Entzian, C., Schubert, T. Mapping the binding site of an aptamer on ATP using MicroScale Thermophoresis. Journal of Visualized Experiments. (119), e55070(2017).
  38. Romain, M., Thiroux, B., Tardy, M., Quesnel, B., Thuru, X. Measurement of protein-protein interactions through microscale thermophoresis (MST). Bio-Protocol. 10 (7), 1-10 (2020).
  39. Eble, J. A. Titration ELISA as a method to determine the dissociation constant of receptor ligand interaction. Journal of Visualized Experiments. (132), e57334(2018).
  40. Chang, A. L., McKeague, M., Liang, J. C., Smolke, C. D. Kinetic and equilibrium binding characterization of aptamers to small molecules using a label-free, sensitive, and scalable platform. Analytical Chemistry. 86 (7), 3273-3278 (2014).
  41. Lou, X., Egli, M., Yang, X. Determining functional aptamer-protein interaction by biolayer interferometry. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. 67 (1), 7-25 (2016).
  42. Cheng, H., et al. Identification of a coumarin-based antihistamine-like small molecule as an anti-filoviral entry inhibitor. Antiviral Research. 145, 24-32 (2017).
  43. Sun, M., et al. Aptamer blocking strategy inhibits SARS-CoV-2 virus infection. Angewandte Chemie International Edition. 60 (18), 10266-10272 (2021).
  44. Li, J., et al. Diverse high-affinity DNA aptamers for wild-type and B.1.1.7 SARS-CoV-2 spike proteins from a pre-structured DNA library. Nucleic Acids Research. 49 (13), 7267-7279 (2021).
  45. Zhang, L., et al. Discovery of sandwich type COVID-19 nucleocapsid protein DNA aptamers. Chemical Communications. 56 (70), 10235-10238 (2020).
  46. Hamula, C. L. A., et al. An improved SELEX technique for selection of DNA aptamers binding to M-type 11 of Streptococcus pyogenes. Methods. 97, 51-57 (2016).
  47. Liu, J., Lu, Y. Rational design of "turn-on" allosteric DNAzyme catalytic beacons for aqueous mercury ions with ultrahigh sensitivity and selectivity. Angewandte Chemie International Edition. 46 (40), 7587-7590 (2007).
  48. Liu, J., Mazumdar, D., Lu, Y. A simple and sensitive "dipstick" test in serum based on lateral flow separation of aptamer-linked nanostructures. Angewandte Chemie International Edition. 45 (47), 7955-7959 (2006).
  49. Xiang, Y., Lu, Y. Using personal glucose meters and functional DNA sensors to quantify a variety of analytical targets. Nature Chemistry. 3 (9), 697-703 (2011).
  50. Lake, R. J., Yang, Z., Zhang, J., Lu, Y. DNAzymes as activity-based sensors for metal ions: recent applications, demonstrated advantages, current challenges, and future directions. Accounts of Chemical Research. 52 (12), 3275-3286 (2019).
  51. Li, N., et al. Overcoming the limitations of COVID-19 diagnostics with nanostructures, nucleic acid engineering, and additive manufacturing. Current Opinion in Solid State & Materials Science. 26, 100966(2022).
  52. Li, N., et al. Label-free digital detection of intact virions by enhanced scattering microscopy. Journal of the American Chemical Society. 144 (4), 1498-1502 (2022).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Aptamerselectiedetectie van infectieuze virussenSELEX protocolDNA aptamerencounterselectievirusdifferentiatieqPCR monitoringbindingsassayhigh throughput sequencingmonitoring van milieuvirussen

Gerelateerde artikelen