In dit protocol werd de endotheelbarrièrefunctie van de submandibulaire klier (SMG) geëvalueerd door verschillende moleculair gewogen fluorescerende tracers in vivo in de hoekaders van proefdiermodellen te injecteren onder een laserscanmicroscoop met twee fotonen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
In vivo Vasculaire permeabiliteitsdetectie bij submandibulaire klier van muizen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Speeksel speelt een belangrijke rol in de mond- en algehele gezondheid. De intacte endotheelbarrièrefunctie van bloedvaten maakt speekselsecretie mogelijk, terwijl de disfunctie van de endotheelbarrière gerelateerd is aan veel secretoire stoornissen van de speekselklier. Het huidige protocol beschrijft een in vivo paracellulaire permeabiliteitsdetectiemethode om de functie van endotheel tight junctions (TJ's) in submandibulaire klieren van muizen (SMG) te evalueren. Ten eerste werden fluorescentie-gelabelde dextrans met verschillende molecuulgewichten (4 kDa, 40 kDa of 70 kDa) geïnjecteerd in de hoekaders van muizen. Daarna werd de eenzijdige SMG ontleed en bevestigd in de aangepaste houder onder een laserscanmicroscoop met twee fotonen en vervolgens werden beelden vastgelegd voor bloedvaten, acini en kanalen. Met behulp van deze methode werd de real-time dynamische lekkage van de tracers van verschillende grootte uit bloedvaten naar de basale zijden van de acini en zelfs over de acinaire epithelia in de kanalen gecontroleerd om de verandering van de endotheelbarrièrefunctie onder fysiologische of pathofysiologische omstandigheden te evalueren.
Inleiding
Verschillende speekselklieren produceren speeksel, dat voornamelijk fungeert als de eerste verdedigingslinie tegen infecties en de spijsvertering helpt, waardoor het een essentiële rol speelt in de mond- en algehele gezondheid1. Bloedtoevoer is cruciaal voor speekselkliersecretie, omdat het constant water, elektrolyten en moleculen levert die het primaire speeksel vormen. Endotheelbarrièrefunctie, gereguleerd door het tight junction (TJ) -complex, beperkt strikt en delicaat de permeatie van haarvaten, die zeer doorlaatbaar zijn voor water, opgeloste stoffen, eiwitten en zelfs cellen die van de circulerende bloedvaten naar de speekselklierweefsels bewegen 2,3. We hebben eerder ontdekt dat het openen van de endotheel-TJ's als reactie op een cholinerge stimulus speekselsecretie vergemakkelijkt, terwijl de aantasting van de endotheelbarrièrefunctie verband houdt met hyposecretie en lymfocytische infiltratie in de submandibulaire klieren (SMG's) bij syndroom van Sjögren4. Deze gegevens suggereren dat de bijdrage van de endotheelbarrièrefunctie voldoende aandacht moet krijgen met betrekking tot een verscheidenheid aan speekselklieraandoeningen.
Een laserscanmicroscoop met twee fotonen is een krachtig hulpmiddel voor het observeren van de dynamiek van cellen in intact weefsel in vivo. Een van de voordelen van deze techniek is dat nabij-infrarood licht (NIR) een diepere weefselpenetratie heeft dan zichtbaar of ultraviolet licht wanneer monsters worden geëxciteerd door NIR en geen duidelijke lichtschade aan weefsels veroorzaakt onder de juiste omstandigheden 5,6. Inderdaad, de speekselklieren zijn een zeer homogeen en oppervlakkig weefsel, waarin de oppervlakte-acinaire cellen slechts ongeveer 30 μm verwijderd zijn van het klieroppervlak 7,8. Het is aangetoond dat intravitale confocale microscopie exocriene secretie en actinecytoskelet kan bestuderen in levende muis speekselklieren met subcellulaire resolutie8. Twee-fotonen laserscanmicroscopie heeft echter niet alleen het voordeel van conventionele confocale microscopie, maar kan ook worden gebruikt om dieper weefsel en beeld duidelijker te detecteren. Hier kan fluorescentie-gelabelde dextrans, die vaak worden gebruikt als paracellulaire permeabiliteitstracers en het voordeel hebben van verschillende groottes, worden gebruikt om de grootte van TJ-porie9 te testen. In de huidige studie wordt een intravitale real-time twee-fotonen laserscanmicroscopietechniek vastgesteld voor in situ evaluatie van de endotheelbarrièrefunctie in muizen-SMG's. Elke werkstap voor in vivo vasculaire permeabiliteitsdetectie bij muis-SMG's wordt beschreven in het huidige protocol. Hier is een voorbeeld van het detecteren van de endotheelbarrièrefunctie in het SMG-kanaalligatiemodel van de muis.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle experimentele procedures werden goedgekeurd door de Ethische Commissie voor Dieronderzoek, Peking University Health Science Center, en voldeden aan de Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren (NIH-publicatie nr. 85-23, herzien 1996). Mannelijke wild-type (WT) muizen in de leeftijdsgroep van 8-10 weken werden gebruikt voor de huidige studie. De proefdieren werden zorgvuldig behandeld om hun pijn en ongemak te minimaliseren.
1. Procedures voor dieren
- Bereid en dien de anesthetica en tracers voor en dien ze toe.
- Handhaaf steriele omstandigheden gedurende het onderzoek en steriliseer de instrumenten door autoclaveren. Verdeel de muizen in twee groepen.
OPMERKING: De controlegroep werd onbehandeld gelaten en de andere groep met unilaterale SMG-kanaalligatie gedurende 1 dag diende als de experimentele groep. Bij het groeperen moeten muizen met een vergelijkbaar lichaamsgewicht en leeftijd worden geselecteerd om de invloed van gewicht en leeftijd op de vasculaire permeabiliteit te verminderen. - Kies geschikte tracers zoals fluoresceïne isothiocyanaat (FITC)-gelabelde dextran (molecuulgewicht: 4 kDa; FD4) en rhodamine B-gelabelde dextran (molecuulgewicht: 70 kDa; RD70) (zie Materiaaltabel) met verschillende excitatie-/emissiespectra om de interferentie tussen fluorescentiesignalen (met behulp van respectievelijk het FITC- of rhodamine B-filter) voor de permeabiliteitstest te minimaliseren.
OPMERKING: De excitatiegolflengten van FD4 en RD70 zijn respectievelijk 488 nm en 594 nm, en de geselecteerde emissiegolflengten zijn respectievelijk 511-564 nm en 617-669 nm. - Verdun de tracers in steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (1x PBS) in 100 mg/ml voorraden en bewaar de tegen licht beschermde aliquots bij −20 °C.
OPMERKING: Dextran met een molecuulgewicht zoals 4 kDa zal snel uit het bloed lekken in muizen-SMG's, zelfs zonder pathologische aandoeningen10. - Intraperitoneaal injecteren van de tribroomethanol (de dosis voor een muis van 25 g was ongeveer 600 μL) om de muizen te verdoven. Zorg voor analgesie zoals aanbevolen door de lokale commissie voor dierethiek.
OPMERKING: Gebruik na de inductie van anesthesie dierenartszalf op de ogen om uitdroging te voorkomen. Zorg goed voor de dieren11. Wacht tot de muis mechanische stimulatie verdraagt, bijvoorbeeld teenknijpen zonder motorische reactie. - Injecteer een mengsel van twee paracellulaire permeabiliteitstracers met verschillende molecuulgewichten (FD4 en RD70) in de hoekader (0,5 mg/g lichaamsgewicht). Injecteer elke muis met een mengsel van 100 μL traceroplossing, met 50 μL van elke kleurstof gemengd in een verhouding van 1:1.
- Houd na anesthesie voorzichtig het hoofd en de nek van de muis vast om een kant van de oogbol iets te laten uitsteken. Plaats een insulinespuit met fluorescerende tracers (pas op dat u geen lucht in de spuit brengt) langs de ooghoek in een rechte hoek met het oog.
OPMERKING: Als de hoekader correct wordt ingebracht, kan de kleurstofoplossing gemakkelijk in de ader worden geïnjecteerd en is er geen weerstand tijdens de injectie. Bovendien kan staartaderinjectie bij muizen ook een kandidaat zijn voor intraveneuze tracermoleculen.
- Houd na anesthesie voorzichtig het hoofd en de nek van de muis vast om een kant van de oogbol iets te laten uitsteken. Plaats een insulinespuit met fluorescerende tracers (pas op dat u geen lucht in de spuit brengt) langs de ooghoek in een rechte hoek met het oog.
- Handhaaf steriele omstandigheden gedurende het onderzoek en steriliseer de instrumenten door autoclaveren. Verdeel de muizen in twee groepen.
- Voer de SMG-isolatie uit volgens de onderstaande stappen.
OPMERKING: Gebruik steriele hulpmiddelen, waaronder een weefselschaar en scheidingsnikkel, voor de operatie.- Scheid een unilaterale klier zorgvuldig om de omliggende bloedvaten en zenuwen niet te beschadigen onder een stereoscopische microscoop.
- Na de injectie van paracellulaire permeabiliteitstracers, zet de muizen snel op het karton en plaats ze in rugligging met hun ledematen en hoofden afgeplakt. Breng ontharingscrème aan op de nekhuid om het haar van de muis te verwijderen. Gebruik 75% ethanol om de huid te desinfecteren voor de operatie.
- Snijd vervolgens onder een stereomicroscoop de epidermis van de nek met een algemene weefselschaar om beide zijden van de SMG's bloot te leggen (de rechterklier werd in dit experiment behandeld). Gebruik vervolgens een stomp weefselscheiding nikkel (zie Tabel van Materialen) om de capsule voorzichtig van het klieroppervlak te scheiden, waarbij u ervoor zorgt dat het klierweefsel en de bloedvaten niet worden beschadigd.
- Scheid de capsule van het klieroppervlak zonder de klierstructuur te beschadigen. Zorg er bovendien voor dat het hele proces van muisbeveiliging en klierscheiding binnen 10 minuten is voltooid.
- Scheid een unilaterale klier zorgvuldig om de omliggende bloedvaten en zenuwen niet te beschadigen onder een stereoscopische microscoop.
2. Twee-foton microscoop opstelling
- Sluit de aangepaste houder aan op het onderdrukapparaat en controleer van tevoren of het negatieve drukeffect goed is bereikt.
OPMERKING: De houder heeft de vorm van een miniatuur vergrootglas met een plat stuk rond glas in het midden (diameter: 4,32 mm, figuur 1). Het onderdrukapparaat is intern zo ontworpen dat de houder is verbonden met een rubberen buis, die is gekoppeld aan een drainagefles, en de fles is bevestigd aan de negatieve drukregelaar via een korte rubberen buis. Op deze manier kan de onderdrukregelaar de druk aanpassen om ervoor te zorgen dat het weefsel in de houder wordt opgezogen.- Koppel één zijde van de houder aan de onderdrukinrichting. Om te testen of het negatievedrukapparaat intact en geschikt is, draait u de houder ondersteboven, voegt u een druppel water toe en stelt u de negatieve drukwaarde in op 20 eenheden. Als het water volledig en snel wordt weggezogen, wordt het negatieve drukapparaat met succes met de houder geïnstalleerd.
- Plaats de blootgestelde SMG van de muis voorzichtig op de aangepaste houder en zuig het weefsel op door negatieve druk zo ver mogelijk van het muizenlichaam af te zuigen om bewegingsartefacten veroorzaakt door ademhaling en andere aandoeningen te verminderen.
- Afbeelding van het ondersteuningsmateriaal dat aan de klier is bevestigd onder een 25x / NA 1.0 waterdompelingsobjectief (speciaal voor NIR).
OPMERKING: Gebruik in dit experiment een rechtopstaande microscoop met twee fotonen (zie Materiaaltabel). De bloedvaten moeten onmiddellijk zichtbaar zijn met duidelijke fluorescentie na de tracerinjectie.
3. Vaatbeeldvorming en detectie van permeabiliteit
- Begin met beeldvorming kort nadat de aanblik van de klier is gekozen.
OPMERKING: Doorgaans worden tijdreeksen van 45-50 afbeeldingen in 20 s of langer over het algemeen vastgelegd, afhankelijk van het experimentele ontwerp. - Verkrijg sequentiële beelden langs de Z-as, 2 μm uit elkaar gestapt, van het oppervlak van de klier tot 70-140 μm in het weefsel om een driedimensionale (3D) constructie te genereren.
- Verkrijg time-lapse beeldvorming van de vaten om de vasculaire permeabiliteit in de SMG te meten.
OPMERKING: Stel de voorwaarden van het programmamenu als volgt in na het uitvoeren van de microscoopsoftware (zie Materiaaltabel).- Klik in het dialoogvenster Verkenner op Nieuwe map toevoegen en wijzig de bestandsnaam.
- Ga terug naar de kolom Acquisitie . In XY is het formaat 512 x 512 en de snelheid is 400 Hz. Schakel Bidirectioneel X in.
- Stel de zoomfactor in op 0,75 en 1,5 voor zoomen.
- Als u time-lapse-beeldvorming wilt verkrijgen, selecteert u xyt onder Acquisitiemodus. Stel de duur in op 20 s, 30 minuten of langer, afhankelijk van de experimentele behoefte.
- Als u de 3D-constructie wilt maken, stelt u de acquisitiemodus in op xyz. De grootte van Z-Step kan worden ingesteld op basis van de werkelijke situatie.
- Klik na het instellen van de voorwaarden op Live om de vasculaire beeldvorming van twee kanalen en overlappende kanalen in het fotovormende frame te observeren en de interessegebieden te kiezen.
- Klik op Start om de beeldvorming te starten.
OPMERKING: De muis mag niet onbeheerd worden achtergelaten tijdens het beeldvormingsproces terwijl hij onder narcose is.
4. Data-analyse
- Om de permeabiliteit van het vat te evalueren, gebruikt u image J-software om de fluorescentie-intensiteitsverhouding van FD4 en RD70 tussen de buiten- en binnenvaten te berekenen en deze aan te geven als extra- en intravasculaire intensiteit4.
OPMERKING: De verandering van vasculaire permeabiliteit door het traceren van het transport van dextrans weerspiegelt de verandering in de endotheelbarrièrefunctie. Observeer bovendien de vasculaire morfologie en dichtheid door de diameter en het aantal vaatveranderingen te berekenen.- Voer Image J-software uit (zie Materiaaltabel).
- Klik op Bestand en selecteer Openen om de bloedvatbeelden te openen die zijn vastgelegd onder de microscoop met twee fotonen.
- Selecteer Afbeelding en stel Type in op 16-bits om de afbeeldingsindeling te converteren.
- Selecteer Analyseren en selecteer Gebied, Gemiddelde, IntDen onder Metingen instellen. Klik op OK om te bevestigen.
- Selecteer onder Analyseren de optie Extra, open ROI-beheer en selecteer Alles en labels weergeven.
- Meet de intravasculaire fluorescentie-intensiteitswaarde: klik op het lasso-gereedschap op de hoofdinterface om de omtrek van het bloedvat te schetsen. Klik op Toevoegen in ROI Manager. Volg deze stap om door te gaan met het selecteren van meerdere schepen. Selecteer alle objecten van de ROI Manager en klik op Meten.
- Meet de totale fluorescentie-intensiteitswaarde: schets de hele afbeelding, klik op Meten en het resultaat is de totale fluorescentie-intensiteitswaarde van de afbeelding.
- Bereken de extravasculaire fluorescentie-intensiteitswaarde. Kopieer de gegevens naar Excel voor berekening. Extravasculaire fluorescentie-intensiteitsverhouding = (1 − intravasculaire fluorescentie-intensiteitswaarde/totale fluorescentie-intensiteitswaarde) × 100%.
5. Downstream-toepassingen
- Bereken tijdens het experiment de bloedstroomsnelheid door de afstand te meten die een rode cel (weergegeven als een zwarte stip onder de microscoop met twee fotonen)4 ondergaat in een tijdsduur.
- Om de beweging van bloedcellen over de endotheelcellen te visualiseren, labelt u de bloedcellen door fluorescentie. Injecteer vervolgens de fluorescentie-gelabelde cellen met FD4 of RD70 via de staartader van de muis. Na 5 minuten circuleren, traceer je de geïnteresseerde cellen gedurende een periode.
OPMERKING: Een totaal van 2 x 106 CVSE (carboxyfluoresceïne succinimidylester, een membraandoorlatende fluorescerende kleurstof)-gelabelde lymfocyten afgeleid van de milt van donormuizen werden overgebracht naar ontvangers door staartaderinjectie, en de infiltratie van lymfocyten in SMG's werd onderzocht in proefdiermodellen4.
6. Verzorging en herstel van dieren
- Zorg goed voor de dieren tijdens het experiment.
OPMERKING: Zorg ervoor dat het dier dat een operatie heeft ondergaan niet wordt teruggebracht naar het gezelschap van andere dieren totdat het volledig is hersteld tijdens het experiment. - Laat het dier niet onbeheerd achter totdat het weer voldoende bij bewustzijn is.
OPMERKING: Observeer de ademhalingsstatus van de muizen continu en houd ze warm door ze op het verwarmingskussen van het dier te leggen. Zorg voor postoperatieve pijnherstelhuisvesting en analgesie, zoals aanbevolen door de lokale commissie voor dierenethiek.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Volgens het protocol werd de unilaterale SMG bevestigd aan een op maat gemaakte houder en werd de klier zo ver mogelijk van het muizenlichaam gehouden om te voorkomen dat ademhaling bewegingsartefacten veroorzaakte. De snelle stroom van de rode bloedcellen (zwarte stippen) in bloedvaten werd waargenomen onder de microscoop. Na het vinden van het weefselveld onder een oculaire lens, moet men overschakelen om de microscoopsoftware te manipuleren. In de controlegroep bestonden beide tracers in de bloedvaten van de muis SMG....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het behoud en de regulatie van de endotheelbarrièrefunctie zijn essentieel voor vasculaire homeostase. Endotheelcellen en hun intercellulaire juncties spelen een cruciale rol bij het handhaven en beheersen van de vasculaire integriteit12. De schuifkracht van de bloedstroom, groeifactoren en ontstekingsfactoren kunnen veranderingen in de vasculaire permeabiliteit veroorzaken en dus deelnemen aan het optreden en de ontwikkeling van systemische ziekten zoals hypertensie, diabetes en auto-immuunziekte...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Deze studie werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (subsidies 31972908, 81991500, 81991502, 81771093 en 81974151) en de Beijing Natural Science Foundation (subsidie 7202082).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 2-foton microscoop (TCS-SP8 DIVE) | Leica, Duitsland | ||
| 4 kDa FITC-gelabeld dextran | Sigma Aldrich | 46944 | |
| 70 kDa rodamine B-gelabeld dextran | Sigma Aldrich | R9379 | |
| Blunt weefselscheidingsnikkel | Bejinghuabo Company | NZW28 | |
| Depilatiecrème | Veet | ||
| Sterile wegwerpspuit | Zhiyu Company | 1 mL | |
| Image J-software | National Institutes of Health | ||
| Insulinspuiten | Becton, Dickinson and Company | 0253316 | 1 mL |
| Leica Application Suite X-software | Leica Microsystems | ||
| Microbuisjes | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL |
| Fosfaatbufferoplossing 1x | Servicebio | G4207-500 | |
| Weefselschaar | Bejinghuabo Company | M286-05 | |
| Tribromoethanol | JITIAN Bio | JT0781 |
Referenties
- Carpenter, G. H. The secretion, components, and properties of saliva. Annual Review of Food Science and Technology. 4, 267-276 (2013).
- Garrett, J. R. The proper role of nerves in salivary secretion: A review. Journal of Dental Research. 66 (2), 387-397 (1987).
- Berndt, P., et al. Tight junction proteins at the blood-brain barrier: Far more than claudin-5. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (10), 1987-2002 (2019).
- Cong, X., et al. Disruption of endothelial barrier function is linked with hyposecretion and lymphocytic infiltration in salivary glands of Sjögren's syndrome. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1864 (10), 3154-3163 (2018).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: Multiphoton microscopy in the biosciences. Nature Biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
- Masedunskas, A., Sramkova, M., Weigert, R. Homeostasis of the apical plasma membrane during regulated exocytosis in the salivary glands of live rodents. Bioarchitecture. 1 (5), 225-229 (2011).
- Masedunskas, A., et al. Role for the actomyosin complex in regulated exocytosis revealed by intravital microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (33), 13552-13557 (2011).
- Balda, M. S., et al. Functional dissociation of paracellular permeability and transepithelial electrical resistance and disruption of the apical-basolateral intramembrane diffusion barrier by expression of a mutant tight junction membrane protein. The Journal of Cell Biology. 134 (4), 1031-1049 (1996).
- Enis, D. R., et al. Induction, differentiation, and remodeling of blood vessels after transplantation of Bcl-2-transduced endothelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (2), 425-430 (2005).
- Wang, X., et al. Application of digital subtraction angiography in canine hindlimb arteriography. Vascular. 30 (3), 474-480 (2022).
- Trani, M., Dejana, E. New insights in the control of vascular permeability: vascular endothelial-cadherin and other players. Current Opinion in Hematology. 22 (3), 267-272 (2015).
- Viazzi, F., et al. Vascular permeability, blood pressure, and organ damage in primary hypertension. Hypertension Research. 31 (5), 873-879 (2008).
- Scheppke, L., et al. Retinal vascular permeability suppression by topical application of a novel VEGFR2/Src kinase inhibitor in mice and rabbits. The Journal of Clinical Investigation. 118 (6), 2337-2346 (2008).
- Blanchet, M. R., et al. Loss of CD34 leads to exacerbated autoimmune arthritis through increased vascular permeability. Journal of Immunology. 184 (3), 1292-1299 (2010).
- Egawa, G., Ono, S., Kabashima, K. Intravital Imaging of vascular permeability by two-photon microscopy. Methods in Molecular Biology. 2223, 151-157 (2021).
- Vestweber, D., Wessel, F., Nottebaum, A. F. Similarities and differences in the regulation of leukocyte extravasation and vascular permeability. Seminars in Immunopathology. 36 (2), 177-192 (2014).
- Schulte, D., et al. Stabilizing the VE-cadherin-catenin complex blocks leukocyte extravasation and vascular permeability. The EMBO Journal. 30 (20), 4157-4170 (2011).
- Uhl, B., et al. A novel experimental approach for in vivo analyses of the salivary gland microvasculature. Frontiers in Immunology. 11, 604470(2020).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
