Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Isolatie en directe neuronale herprogrammering van muisastryoten

3.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/64175

⸱

7 juli 2022

 ,  , 
1Institute of Stem Cell Research, Helmholtz Zentrum München, German Research Center for Environmental Health, 2Department of Physiological Genomics, Biomedical Center Munich, Ludwig-Maximilians University, 3Graduate School of Systemic Neurosciences, BioCenter, Ludwig-Maximilians University

In dit artikel

Samenvatting

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol om sterk verrijkte culturen van astrocyten te genereren die zijn afgeleid van verschillende regio's van het centrale zenuwstelsel van postnatale muizen en hun directe omzetting in functionele neuronen door de geforceerde expressie van transcriptiefactoren.

Samenvatting

Directe neuronale herprogrammering is een krachtige benadering om functionele neuronen te genereren uit verschillende startcelpopulaties zonder door multipotente tussenproducten te gaan. Deze techniek houdt niet alleen grote beloften in op het gebied van ziektemodellering, omdat het bijvoorbeeld fibroblasten voor patiënten met neurodegeneratieve ziekten kan omzetten in neuronen, maar vertegenwoordigt ook een veelbelovend alternatief voor celgebaseerde vervangingstherapieën. In deze context was een belangrijke wetenschappelijke doorbraak de demonstratie dat gedifferentieerde niet-neurale cellen in het centrale zenuwstelsel, zoals astrocyten, in vitro konden worden omgezet in functionele neuronen. Sindsdien heeft in vitro directe herprogrammering van astrocyten in neuronen substantiële inzichten opgeleverd in de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan gedwongen identiteitsconversie en de hindernissen die efficiënte herprogrammering voorkomen. Resultaten van in vitro experimenten uitgevoerd in verschillende laboratoria zijn echter moeilijk te vergelijken vanwege verschillen in de methoden die worden gebruikt om astrocyten te isoleren, te kweken en te herprogrammeren. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol om astrocyten met hoge zuiverheid betrouwbaar te isoleren en te kweken uit verschillende regio's van het centrale zenuwstelsel van muizen op postnatale leeftijd via magnetische celsortering. Verder bieden we protocollen om gekweekte astrocyten te herprogrammeren tot neuronen via virale transductie of DNA-transfectie. Dit gestroomlijnde en gestandaardiseerde protocol kan worden gebruikt om de moleculaire mechanismen te onderzoeken die ten grondslag liggen aan het behoud van de celidentiteit, de vaststelling van een nieuwe neuronale identiteit, evenals het genereren van specifieke neuronale subtypen en hun functionele eigenschappen.

Inleiding

Het centrale zenuwstelsel van zoogdieren (CZS) is zeer complex en bestaat uit honderden verschillende celtypen, waaronder een groot aantal verschillende neuronale subtypen 1,2,3,4,5,6. In tegenstelling tot andere organen of weefsels 7,8,9 heeft het CZS van zoogdieren een zeer beperkt regeneratief vermogen; neuronaal verlies na traumatisch hersenletsel of neurodegeneratie is onomkeerbaar en resulteert vaak in motorische en cognitieve tekorten10. Gericht op het redden van hersenfuncties, worden verschillende strategieën om verloren neuronen te vervangen intensief onderzocht11. Onder hen is directe herprogrammering van somatische cellen in functionele neuronen in opkomst als een veelbelovende therapeutische aanpak12. Directe herprogrammering, of transdifferentiatie, is het proces van het omzetten van een gedifferentieerd celtype in een nieuwe identiteit zonder door een intermediaire proliferatieve of pluripotente toestand te gaan 13,14,15,16. Gepionierd door de identificatie van MyoD1 als een factor die voldoende is om fibroblasten om te zetten in spiercellen 17,18, is deze methode met succes toegepast om verschillende celtypen te herprogrammeren in functionele neuronen 19,20,21.

Astrocyten, de meest voorkomende macroglia in het CZS 22,23, zijn om verschillende redenen een bijzonder veelbelovend celtype voor directe neuronale herprogrammering. Ten eerste zijn ze wijd en gelijkmatig verdeeld over het CZS, wat een overvloedige locobron voor nieuwe neuronen oplevert. Ten tweede zijn astrocyten en neuronen ontwikkelingsmatig nauw verwant, omdat ze een gemeenschappelijke voorouder delen tijdens de embryonale ontwikkeling, de radiale gliacellen24. De gemeenschappelijke embryonale oorsprong van de twee celtypen lijkt neuronale conversie te vergemakkelijken in vergelijking met herprogrammering van cellen uit verschillende kiemlagen19,21. Bovendien wordt patrooninformatie die door astrocyten wordt geërfd door hun radiale glia-oorsprong ook gehandhaafd in volwassen astrocyten 25,26,27, en lijkt het bij te dragen aan het genereren van regionaal geschikte neuronale subtypen 28,29,30. Daarom is het onderzoeken en begrijpen van de omzetting van astrocyten in neuronen een belangrijk onderdeel van het bereiken van het volledige potentieel van deze techniek voor op cellen gebaseerde vervangingsstrategieën.

De omzetting van in vitro gekweekte astrocyten in neuronen heeft geleid tot verschillende doorbraken op het gebied van directe neuronale herprogrammering, waaronder: i) de identificatie van transcriptiefactoren die voldoende zijn om neuronen uit astrocyten te genereren 15,19,31, ii) het ontrafelen van moleculaire mechanismen veroorzaakt door verschillende herprogrammeringsfactoren in dezelfde cellulaire context 32 , en iii) het benadrukken van de impact van de ontwikkelingsoorsprong van de astrocyten op het induceren van verschillende neuronale subtypen 28,29,33. Bovendien ontrafelde in vitro directe conversie van astrocyten verschillende belangrijke hindernissen die directe neuronale herprogrammeringbeperken 34,35, zoals verhoogde reactieve zuurstofsoorten (ROS) productie34 en verschillen tussen het mitochondriale proteoom van astrocyten en neuronen35. Vandaar dat deze waarnemingen sterk het gebruik van primaire culturen van astrocyten ondersteunen als een model voor directe neuronale herprogrammering om verschillende fundamentele vragen in de biologie te onderzoeken12, gerelateerd aan het onderhoud van de celidentiteit, wegversperringen die veranderingen in het lot van cellen voorkomen, evenals de rol van het metabolisme bij herprogrammering.

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol om astrocyten te isoleren van muizen op postnatale (P) leeftijd met een zeer hoge zuiverheid, zoals aangetoond door het isoleren van astrocyten uit het muizenmerg29. We bieden ook protocollen om astrocyten te herprogrammeren in neuronen via virale transductie of DNA-plasmidetransfectie. Geherprogrammeerde cellen kunnen worden geanalyseerd op 7 dagen na transductie (7 DPT) om verschillende aspecten te beoordelen, zoals herprogrammeringsefficiëntie en neuronale morfologie, of kunnen gedurende enkele weken in cultuur worden gehouden om hun rijping in de loop van de tijd te beoordelen. Belangrijk is dat dit protocol niet specifiek is voor ruggenmergastrocyten en gemakkelijk kan worden toegepast om astrocyten te isoleren uit verschillende andere hersengebieden, waaronder de corticale grijze stof, middenhersenen en cerebellum.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De volgende procedure volgt de richtlijnen voor dierverzorging van het Helmholtz Zentrum München in overeenstemming met de richtlijn 2010/63/EU inzake de bescherming van dieren die voor wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt. Zorg ervoor dat u voldoet aan de richtlijnen voor dierverzorging van de instelling waar de dissectie wordt uitgevoerd.

1. Voorbereiding van dissectie-, dissociatie- en cultuurmaterialen

OPMERKING: Bereid alle kweekreagentia voor in een biologische veiligheidskast en werk met alleen geautoclaveerde of steriele apparatuur. Dissectie- en dissociatiereagentia kunnen buiten een biologische veiligheidskast worden bereid.

  1. Bereid kweekkolven door een T25-kweekkolf te bedekken met poly-D-lysine (bouillon 1 mg/ml; werkoplossing 20 μg/ml) in H2O gedurende ten minste 2 uur. Spoel daarna 3x af met H2O en droog aan de lucht.
  2. Bereid de dissectiebuffer voor door 5 ml 1 M HEPES-bufferoplossing toe te voegen aan 500 ml hank's gebalanceerde zoutoplossing (HBSS).
  3. Bereid één C-buis (zie Materiaaltabel) per zes ruggenmerg door 1950 μL buffer X uit de dissociatiekit voor neuraal weefsel toe te voegen (zie Materiaaltabel). Bewaar op ijs tijdens de dissectie. Bereid enzymatische digestie master mix door toevoeging van 20 μL buffer Y en 10 μL buffer A per C-buis (onderdeel van de neurale weefsel dissociatie kit; zie Tabel van materialen). Meng goed en bewaar op 4 °C totdat het nodig is.
  4. Bereid 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (1x PBS) met calcium en magnesium en plaats op ijs. Bereid basiskweekmedium door toevoeging van 5 ml penicilline-streptomycine (eindconcentratie, 100 U / ml), 5 ml 45% D-glucose en 5 ml glutaminesupplement (eindconcentratie 2 mM; zie materiaaltabel) tot 485 ml DMEM / F12. Basismedium is stabiel bij 4 °C gedurende 4 weken.
  5. Bereid astrocytenkweekmedium voor door 1 ml B27-supplement en 5 ml foetaal runderserum (FBS) toe te voegen aan 44 ml basiskweekmedium. Vul medium aan met epidermale groeifactor (EGF) en basic-fibroblast groeifactor (bFGF) (elk 10 ng/ml). Voeg EGF en bFGF vlak voor gebruik toe aan de juiste hoeveelheid medium.
  6. Gebruik voor de dissectie van ruggenmergweefsel een paar grote tangen met gebogen punt, een paar kleine tangen met gebogen punt, een paar kleine tangen, een kleine schaar en een kleine spatel.

2. Astrocyten isolatie

  1. Isoleer astrocyten uit het ruggenmerg van postnatale muizen voor het uitvoeren van hun directe herprogrammering tot functionele neuronen (figuur 1A). Verzamel voor dit protocol ruggenmergweefsel van muizen op dag 2-3 na de geboorte. Verzamel zes tot acht ruggenmerggen voor astrocytenisolatie. Gebruik hetzelfde protocol om astrocyten te isoleren van andere regio's van het zenuwstelsel, zoals de cortex, middenhersenen en het cerebellum. Voor deze regio's, verkrijg cellen op vijf tot zeven dagen na de geboorte.
    OPMERKING: Wanneer u astrocyten wilt isoleren van gebieden die niet in dit protocol worden genoemd, moeten de leeftijd en het invoermateriaal experimenteel worden bepaald.

3. Dissectie van ruggenmergweefsel

OPMERKING: Dissectie van weefsel kan buiten een biologische veiligheidskast worden uitgevoerd.

  1. Offer muizen op P2-P3 door onthoofding zonder het dier te verdoven. Plaats de romp in een petrischaaltje van 35 mm en bewaar op ijs.
  2. Open de huid met een schaar, verwijder de wervel met een kleine schaar, haal het ruggenmerg eruit en plaats het in de dissectiebuffer op ijs. Verwijder onder een stereotactische dissectiemicroscoop met 2x vergroting de hersenvliezen uit het geïsoleerde ruggenmerg met behulp van een tang en breng ontleed en gereinigd ruggenmergweefsel over naar een C-buis.

4. Magnetische geactiveerde cel sortering (MACS)

  1. Voeg 50 μL enzym P uit de neurale weefseldissociatiekit (zie Materiaaltabel) en 30 μL eerder bereide enzymmix toe aan elke C-buis. Keer de C-buizen om en plaats ze op een verwarmde dissociator (zie Materiaaltabel), zorg ervoor dat al het weefsel in het deksel van de buis wordt verzameld.
  2. Voer het 37_NTDK_1 dissociatieprogramma uit met een looptijd van ongeveer 22 minuten. Plaats kort voor het einde van het programma een zeef van 70 μm (zie Materiaaltabel) op een aantal buizen van 15 ml gelijk aan het aantal gebruikte C-buizen en maak de zeef voorbevochtigd met 2 ml ijskoude PBS. Bewaar 1x PBS op ijs tijdens de gehele MACS-procedure.
  3. Na voltooiing van het programma verwijdert u C-buizen en centrifugeert u ze kort om het weefsel aan de onderkant van de buizen te verzamelen. Breng het gedissocieerde weefsel over van de C-buizen naar de 15 ml buizen die zijn voorbereid door het door de zeef te laten gaan. Laat de zeef op 15 ml buizen.
  4. Spoel C-tube af met 10 ml 1x PBS om overgebleven weefsel te verzamelen en te verzamelen in dezelfde buis van 15 ml door nogmaals door de zeef te gaan. Centrifugeer de buizen van 15 ml met gedissocieerd weefsel bij 300 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
    OPMERKING: Koel de centrifuge na deze stap af tot 4 °C.
  5. Verwijder het supernatant zonder de celpellet te verstoren voordat u de cellen resuspendeert in 80 μL 1x PBS; voeg 10 μL blokkerend reagens toe uit de anti-ACSA-2 MicroBead-kit van de muis (zie materiaaltabel). Meng voorzichtig door te pipetteren.
  6. Incubeer bij 4 °C gedurende 10 min in het donker (koelkast). Voeg 10 μL anti-astrocytenceloppervlak antigeen-2-gekoppelde microbeads toe (zie Materiaaltabel) en meng voorzichtig door pipetteren. Incubeer gedurende 15 min bij 4 °C in het donker.
  7. Was cellen door toevoeging van 3 ml 1x PBS en centrifugeer bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Monteer tijdens het centrifugeren een magnetische separator (zie Tabel van Materialen) door het juiste aantal magnetische sorteerkolommen (zie Tabel van Materialen) op de separator te plaatsen met een verzamelbuis van 15 ml eronder. Spoel de kolommen af met 500 μL 1x PBS.
  8. Verwijder supernatant en resuspensieer de cellen in 500 μL van 1x PBS voordat de celsuspensies naar de magnetische kolommen worden overgebracht. Laat uitlekken door de zwaartekracht. Was de 15 ml buisjes met 500 μL 1x PBS en breng aan op de kolom. Waskolommen met 500 μL 1x PBS voor nog eens twee wasbeurten.
  9. Eluteer cellen door de kolom uit de separator te verwijderen, 800 μL astrocytenkweekmedium toe te voegen en cellen uit de kolom te duwen met de meegeleverde plunjer.
  10. Plaatcellen in de eerder bereide kweekkolven door toevoeging van 4,2 ml astrocytenkweekmedium aangevuld met EFG en bFGF en kweek bij 37 °C en 5% CO2.
    OPMERKING: Coatingkweekkolven is niet nodig voor astrocyten geïsoleerd uit andere hersengebieden, maar biedt een beter substraat voor astrocyten geïsoleerd uit het ruggenmerg.
  11. Kweekcellen gedurende ongeveer 7 dagen tot samenvloeiing (80%-90%). Als de cellen na 7 dagen niet confluent zijn, wacht dan tot 10 dagen voordat u ze platt. Na 10 dagen vermenigvuldigen cellen zich niet meer en neemt de herprogrammeringsefficiëntie af.

5. Zaaien van astrocyten voor herprogrammering

OPMERKING: De volgende stappen moeten worden uitgevoerd onder een biologische veiligheidskast met een veiligheidsniveau 1 (SL1).

  1. Bereid 24-well platen met poly-D-lysine gecoate glazen coverslips op dezelfde manier als kweekkolven eerder werden bereid. Om het aantal benodigde platen te bepalen, moet u bedenken dat astrocyten worden verguld met een dichtheid van 5-5,5 x 104 cellen per put in een plaat met 24 putten. Meestal levert het isoleren van zes ruggenmerggen van P2-muizen ongeveer 1 x 106 cellen op.
  2. Aspirateer media uit de T25 kweekkolven met de gekweekte astrocyten en was één keer met 1x PBS. Maak de astrocyten los van de kweekkolf door toevoeging van 0,5 ml 0,05% Trypsine/EDTA en incubeer bij 37 °C gedurende 5 minuten. Tik voorzichtig op de zijkant van de kolf om cellen van het oppervlak van de kweekkolf vrij te maken en controleer het losmaken onder een brightfieldmicroscoop met behulp van een vergroting van 10x.
  3. Stop trypsinisatie met 2,5 ml astrocytenkweekmedium en verzamel celsuspensie in buizen van 15 ml. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 minuten, aspirateer supernatant en resuspensie cellen in 1 ml astrocytenkweekmedium. Bereken de celconcentratie met behulp van een hemocytometer of een geautomatiseerd celtelsysteem.
  4. Verdun op basis van het aantal cellen de celsuspensie met vers astrocytenmedium om een oplossing van 1-1,1 x 105 cellen per ml te verkrijgen. Vul het medium aan met EGF en bFGF bij 10 ng/ml per factor. Voeg 500 μL celsuspensie, overeenkomend met 5-5,5 x 104 cellen, toe aan elk putje van de eerder bereide 24-well platen en kweekcellen bij 37 °C en 5% CO2.

6. Gedwongen expressie van transcriptiefactoren

OPMERKING: Voordat u verdergaat met het protocol, is het essentieel om het experiment goed te ontwerpen. In het bijzonder is het belangrijk om altijd een negatieve controle voor de herprogrammering op te nemen, namelijk een voorwaarde waarbij geen herprogrammeringsfactor wordt uitgedrukt. Bijvoorbeeld, bij het gebruik van vectoren die de cDNA dragen voor de herprogrammeringsfactor en een reporter (bijv. Groen fluorescerend eiwit (GFP), DsRed), wordt de negatieve controle weergegeven door dezelfde vector die alleen de verslaggever draagt. Bij het uitdrukken van meerdere factoren die verschillende verslaggevers dragen, moet de negatieve controle dienovereenkomstig worden aangepast.

  1. Inspecteer de dag na het plateren de 24-wellplaten om er zeker van te zijn dat cellen zich aan de coverslips hebben gehecht.
  2. Op basis van het experimentele doel en de beschikbare middelen kan de geforceerde expressie van herprogrammeringsfactoren worden bereikt door virale transductie (zie stap 6.3) of DNA-transfectie (zie stap 6.4).
    OPMERKING: Het gebruik van retrovirus of lentivirus vereist de goedkeuring van overheidsinstanties en moet worden uitgevoerd onder een biologische veiligheidskast in een laboratorium met veiligheidsniveau 2 (SL2).
  3. Herprogrammeer de astrocyten door de cellen te transduceren met het retrovirus of lentivirus dat de genetische informatie draagt om de herprogrammeringsfactor (en) van belang uit te drukken zoals hieronder beschreven.
    1. Transduceer cellen met een hoge virustiter van 1 x 1010-1 x 1012 deeltjes/ml door 1 μL van de celsuspensie rechtstreeks aan het astrocytenmedium toe te voegen. Dit zorgt voor een hoge infectiegraad. Kweek de cellen met het astrocytenmedium dat virale deeltjes bij 37 °C bevat gedurende 24-36 uur voordat u verdergaat met rubriek 7 of rubriek 8, afhankelijk van het doel van het experiment.
      OPMERKING: Verschillende promotors kunnen worden gebruikt om de expressie van de transgenen aan te sturen (zie ook Representatieve resultaten). Constitutieve promotors (bijv. CMV, CAG) induceren de expressie van het transgen eerder dan induceerbare promotors; beide soorten promotortypen zijn echter met succes gebruikt om cellen te herprogrammeren tot neuronen.
  4. DNA-plasmiden kunnen ook in astrocyten worden geïntroduceerd via DNA-transfectie zoals hieronder beschreven.
    OPMERKING: Dit kan worden gedaan onder een biologische veiligheidskast die is goedgekeurd voor SL1.
    1. Verkrijg vóór transfectie het transfectieregens, een plasmide-DNA van de gewenste constructen, vers astrocytenmedium en serumgelimiteerd medium (zie Materiaaltabel). Bereken de vereiste hoeveelheid serumgecomprimeerd medium (zie materiaaltabel) door te bedenken dat elke put van een 24-wellsplaat 300 μL serumgecomprimeerd medium nodig heeft. Voeg de juiste hoeveelheid serumgecomprimeerd medium toe aan een tube van 50 ml en verwarm deze tot 37 °C.
    2. Wanneer het serum-gereduceerde medium warm is, aspirate astrocytenmedium uit alle putten en verzamel het in een buis van 50 ml. Filter het verzamelde astrocytenmedium met een spuitfilter van 0,45 μM om losse cellen te verwijderen.
    3. Voeg een gelijk volume vers astrocytenmedium toe aan het gefilterde medium om een oplossing te verkrijgen die voldoende is om 1 ml astrocytenmedium per put toe te voegen. Houd het astrocytengeconditioneerde medium in de incubator op 37 °C tot gebruik (stap 6.4.9).
      OPMERKING: Het kweekmedium wordt hergebruikt omdat het verschillende uitgescheiden factoren bevat die de levensvatbaarheid van de cultuur ondersteunen.
    4. Voeg 300 μL voorverwarmd serumgecomprimeerd medium toe aan elke put en plaats de 24-wellsplaat terug naar de incubator.
    5. Bereid oplossing A, bestaande uit DNA en serumgecomprimeerd medium. Gebruik voor elke put in totaal 0,6 μg DNA en voeg dit toe aan 50 μL serumgecomprimeerd medium. Bewaar oplossing A bij kamertemperatuur tot gebruik.
      OPMERKING: Meestal wordt een technisch drievoud per aandoening overwogen. Daarom wordt een mengsel bereid dat voldoende is voor een reactie van 3,5 (bijv. 2,1 μg totaal DNA verdund in 175 μL serumgedroord medium) om voldoende materiaal te garanderen om drie putten van een 24-wellsplaat te transfecteren.
    6. Bereid oplossing B, samengesteld uit het transfectieregens en het serumgecomduceerde medium. Voeg voor elke put 0,75 μL transfectiereagens toe aan 50 μL serumgecomprimeerd medium. Aangezien deze oplossing gemeenschappelijk is voor alle transfectiecondities, bereidt u deze in bulk om de variabiliteit tussen transfecties te verminderen.
    7. Incubeer oplossing B bij kamertemperatuur gedurende 5 min. Voeg oplossing B druppelsgewijs toe aan oplossing A in een verhouding van 1:1 en meng voorzichtig. Draai niet vortex. Incubeer oplossing A+B gedurende 20-30 min bij kamertemperatuur onder de kap.
    8. Herhaal stap 6.4.5-6.4.7 voor alle transfectieomstandigheden. Voeg na 20-30 minuten druppelsgewijs oplossing A+B toe aan elke put voor een laatste volume van 100 μL. Schud de plaat voorzichtig en plaats de cellen gedurende 4 uur terug in de incubator bij 37 °C.
    9. Verwijder na 4 uur het transfectiemedium en voeg 1 ml van het voorverwarmde astrocytengeconditioneerde medium toe, bereid in stap 6.4.3. Houd cellen gedurende 36-48 uur aan voordat u doorgaat met sectie 7 of sectie 8, afhankelijk van het doel van het experiment.

7. Herprogrammering van astrocyten (7 dagen analyse)

  1. Bereid neuronaal differentiatiemedium voor door 1 ml B27-supplement toe te voegen aan 49 ml basiscultuurmedium (zie stap 1.4). Vervang na 24-48 uur, afhankelijk van het feit of cellen zijn getransduceerd of getransfecteerd (zie respectievelijk stappen 6.3 en 6.4), astrocytenmedium door 1 ml neuronaal differentiatiemedium per put en kweekcellen bij 37 °C en 9% CO2.
    OPMERKING: Cellen kunnen ook op 5% CO2 worden gehouden als er geen 9% CO2-incubator beschikbaar is. Neuronale herprogrammering is echter efficiënter onder deze omstandigheden.
  2. Optioneel: Om de herprogrammeringsefficiëntie te verhogen, vult u neuronale differentiatiemedium aan met Forskolin (eindconcentratie van 30 μM) en Dorsomorfine (eindconcentratie van 1 μM) bij vervanging van het astrocytenmedium door differentiatiemedium. Wanneer u ervoor kiest om cellen te behandelen met Forskolin en Dorsomorphin, geef dan een tweede dosis Dorsomorphin 2 dagen na de eerste behandeling. Voeg deze tweede behandeling direct toe aan het kweekmedium.
  3. Directe herprogrammering van murine astrocyten in neuronale cellen vindt normaal gesproken plaats binnen 7 dagen na het veranderen van het medium. Daarom, 7 dagen na de start van neuronale herprogrammering, fixeren of verzamelen cellen voor downstream analyse.

8. Herprogrammering van astrocyten tot volwassen neuronen (lange termijn culturen)

  1. Bereid neuronaal differentiatiemedium voor door 1 ml B27-supplement toe te voegen aan 49 ml basiscultuurmedium (zie stap 1.4). Vervang na 24-48 uur, afhankelijk van het feit of cellen werden getransduceerd of getransfecteerd (zie respectievelijk stappen 6.3 en 6.4), astrocytenmedium door 1 ml neuronaal differentiatiemedium aangevuld met Forskolin (eindconcentratie van 30 μM) en Dorsomorfine (eindconcentratie van 1 μM) per put en kweekcellen bij 37 °C en 9% CO2.
    OPMERKING: Cellen kunnen ook op 5% CO2 worden gehouden als er geen 9% CO2-incubator beschikbaar is. Neuronale herprogrammering is echter efficiënter onder deze omstandigheden.
  2. Herhaal de behandeling met Dorsomorphin 2 dagen na de eerste behandeling door deze rechtstreeks toe te voegen aan het neuronale differentiatiemedium.
  3. Bereid na 7 dagen vanaf het begin van de neuronale herprogrammering het rijpingsmedium voor door toevoeging van 6 μL N2, 1,2 μL NT3 (stam 20 μg/ml), 1,2 μL BDNF (bouillon 20 μg/ml), 1,2 μL GDNF (stam 20 μg/ml) en 1,2 μL cAMP (stam 100 mM) tot 189,2 μL neuronaal differentiatiemedium. Vul neuronaal differentiatiemedium aanwezig in elke put aan met 200 μL rijpingsmedium.
    OPMERKING: Rijpingsmedium wordt alleen aangevuld voor de eerste behandeling. Alle volgende behandelingen worden uitgevoerd door het neuronale differentiatiemedium gedeeltelijk te vervangen zoals hieronder beschreven.
  4. Herhaal de behandeling met kleine moleculen door 200 μL neuronaal differentiatiemedium te verwijderen en tweemaal per week gedurende maximaal 6 weken 200 μL vers rijpingsmedium toe te voegen. Gebruik tijdens de rijping cellen voor elektrofysiologische experimenten (meestal op dag 21 of later) of fix voor downstream-analyse (bijv. Immunofluorescentie).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Primaire culturen van astrocyten bereiken doorgaans 80% -90% confluentie tussen 7 en 10 dagen na MAC-sortering en plating (figuur 1B). Over het algemeen levert een enkele T25-kweekkolf ongeveer 1-1,5 x 106 cellen op, wat voldoende is voor 20-30 coverslips bij het zaaien van cellen met een dichtheid van 5-5,5 x 104 cellen per put. De dag na het plateren bedekken cellen meestal 50% -60% van het coverslipoppervlak (figuur 1C). In dit stadium b...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Primaire culturen van muizenastrocyten zijn een opmerkelijk in vitro modelsysteem om directe neuronale herprogrammering te bestuderen. In feite, ondanks dat ze geïsoleerd zijn in een postnatale fase, brengen cellen typische astrocytenmarkers29 tot expressie, behouden ze de expressie van patroongenen 28,29 en behouden ze het vermogen om zich te vermenigvuldigen, vergelijkbaar met in vivo astrocyten op een vergelijkbare leeftijdvan 38...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

We willen Ines Mühlhahn bedanken voor het klonen van de constructies voor herprogrammering, Paulina Chlebik voor virale productie en Magdalena Götz en Judith Fischer-Sternjak voor commentaar op het manuscript.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.05% Trypsin/EDTALife Technologies25300054
4', 6-Diamidino-2-fenylindool, dilactaat (DAPI)Sigma-AldrichD9564
anti-muis IgG1 Alexa 647Thermo FisherA21240
anti-Muis IgG1 BiotinSouthernbiotechCat# 1070-08; RRID: AB_2794413
anti-muis IgG2b Alexa 488Thermo FisherA21121
anti-konijn Alexa 546Thermo FisherA11010
Aqua Poly/MountPolysciencesCat# 18606-20
B27 SupplementLife Technologies17504044
BDNFPeprotech450-02
bFGFLife Technologies13256029
Bos Serum Albumine (BSA)Sigma-AldrichCat# A9418
cAMPSigma AldrichD0260
C-TubesMiltenyi Biotec130-093-237
DMEM/F12Life Technologies21331020
DorsomorphinSigma AldrichP5499
EGFLife TechnologiesPHG0311
Fetaal Rund SerumPAN BiotechP30-3302
ForskolinSigma AldrichF6886
GDNFPeprotech450-10
gentleMACS Octo DissociatorMiltenyi Biotec130-096-427
GFAPDakoCat# Z0334; RRID: AB_100013482
GlucoseSigma AldrichG8769
GlutaMaxLife Technologies35050038
HBSSLife Technologies14025050
HepesLife Technologies15630056
Lipofectamine 2000 (Transfectiereagens)Thermo FisherCat# 11668019
MACS SmartStrainer 70µmMiltenyi Biotec130-098-462
MiniMACS SeperatorMiltenyi Biotec130-042-102
Muis anti-ACSA-2 MicroBeat Kit Miltenyi Biotec130-097-678
Muis IgG1 anti-Synaptophysine 1Synaptic SystemsCat# 101 011 RRID:AB_887824)
Muis IgG2b anti-Tuj-1 (βIII-tub)Sigma AldrichT8660
MS kolommenMiltenyi Biotec130-042-201
N2 SupplementLife Technologies17502048
Neural Tissue Dissociation Kit Miltenyi Biotec130-092-628
NT3Peprotech450-03
octoMACS SeparatorMiltenyi Biotec130-042-109
OptiMEM – GlutaMAX (serum-verminderd medium)Thermo FisherCat# 51985-026
Penicillin/StreptomycinLife Technologies15140122
Poly-D-LysineSigma AldrichP1149
Konijn anti-RFPRocklandCat# 600-401-379; RRID:AB_2209751
Konijn anti-Sox9Sigma-AldrichCat# AB5535; RRID:AB_2239761
Streptavidin Alexa 405Thermo FisherCat# S32351
Triton X-100Sigma-AldrichCat# T9284

Referenties

  1. Johnson, T. S., et al. Spatial cell type composition in normal and Alzheimers human brains is revealed using integrated mouse and human single cell RNA sequencing. Scientific Reports. 10 (1), 18014(2020).
  2. Lake, B. B., et al. Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain. Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).
  3. Mayer, C., et al. Developmental diversification of cortical inhibitory interneurons. Nature. 555 (7697), 457-462 (2018).
  4. Nowakowski, T. J., et al. Spatiotemporal gene expression trajectories reveal developmental hierarchies of the human cortex. Science. 358 (6368), 1318-1323 (2017).
  5. Sagner, A., Briscoe, J. Establishing neuronal diversity in the spinal cord: a time and a place. Development. 146 (22), (2019).
  6. Zeisel, A., et al. Molecular architecture of the mouse nervous system. Cell. 174 (4), 999-1014 (2018).
  7. Iismaa, S. E., et al. Comparative regenerative mechanisms across different mammalian tissues. NPJ Regenerative Medicine. 3, 6(2018).
  8. Lange, C., Brand, M. Vertebrate brain regeneration - a community effort of fate-restricted precursor cell types. Current Opinion in Genetics & Development. 64, 101-108 (2020).
  9. Poss, K. D. Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals. Nature Reviews Genetics. 11 (10), 710-722 (2010).
  10. Grade, S., Gotz, M. Neuronal replacement therapy: previous achievements and challenges ahead. NPJ Regenerative Medicine. 2, 29(2017).
  11. Barker, R. A., Gotz, M., Parmar, M. New approaches for brain repair-from rescue to reprogramming. Nature. 557 (7705), 329-334 (2018).
  12. Bocchi, R., Masserdotti, G., Gotz, M. Direct neuronal reprogramming: Fast forward from new concepts toward therapeutic approaches. Neuron. 110 (3), 366-393 (2022).
  13. Di Tullio, A., et al. CCAAT/enhancer binding protein alpha (C/EBP(alpha))-induced transdifferentiation of pre-B cells into macrophages involves no overt retrodifferentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (41), 17016-17021 (2011).
  14. Fishman, V. S., et al. Cell divisions are not essential for the direct conversion of fibroblasts into neuronal cells. Cell Cycle. 14 (8), 1188-1196 (2015).
  15. Heinrich, C., et al. Directing astroglia from the cerebral cortex into subtype specific functional neurons. PLoS Biology. 8 (5), 1000373(2010).
  16. Treutlein, B., et al. Dissecting direct reprogramming from fibroblast to neuron using single-cell RNA-seq. Nature. 534 (7607), 391-395 (2016).
  17. Tapscott, S. J., et al. MyoD1: a nuclear phosphoprotein requiring a Myc homology region to convert fibroblasts to myoblasts. Science. 242 (4877), 405-411 (1988).
  18. Taylor, S. M., Jones, P. A. Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine. Cell. 17 (4), 771-779 (1979).
  19. Berninger, B., et al. Functional properties of neurons derived from in vitro reprogrammed postnatal astroglia. Journal of Neuroscience. 27 (32), 8654-8664 (2007).
  20. Marro, S., et al. Direct lineage conversion of terminally differentiated hepatocytes to functional neurons. Cell Stem Cell. 9 (4), 374-382 (2011).
  21. Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).
  22. Bass, N. H., Hess, H. H., Pope, A., Thalheimer, C. Quantitative cytoarchitectonic distribution of neurons, glia, and DNa in rat cerebral cortex. The Journal of Comparative Neurology. 143 (4), 481-490 (1971).
  23. Yoon, H., Walters, G., Paulsen, A. R., Scarisbrick, I. A. Astrocyte heterogeneity across the brain and spinal cord occurs developmentally, in adulthood and in response to demyelination. PLoS One. 12 (7), 0180697(2017).
  24. Taverna, E., Gotz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).
  25. Batiuk, M. Y., et al. Identification of region-specific astrocyte subtypes at single cell resolution. Nature Communication. 11 (1), 1220(2020).
  26. Boisvert, M. M., Erikson, G. A., Shokhirev, M. N., Allen, N. J. The aging astrocyte transcriptome from multiple regions of the mouse brain. Cell Reports. 22 (1), 269-285 (2018).
  27. Ohlig, S., et al. Molecular diversity of diencephalic astrocytes reveals adult astrogenesis regulated by Smad4. The EMBO Journal. 40 (21), 107532(2021).
  28. Herrero-Navarro, A., et al. Astrocytes and neurons share region-specific transcriptional signatures that confer regional identity to neuronal reprogramming. Science Advances. 7 (15), (2021).
  29. Kempf, J., et al. Heterogeneity of neurons reprogrammed from spinal cord astrocytes by the proneural factors Ascl1 and Neurogenin2. Cell Reports. 36 (3), 109409(2021).
  30. Mattugini, N., et al. Inducing Different Neuronal Subtypes from Astrocytes in the Injured Mouse Cerebral Cortex. Neuron. 103 (6), 1086-1095 (2019).
  31. Heins, N., et al. Glial cells generate neurons: the role of the transcription factor Pax6. Nature Neuroscience. 5 (4), 308-315 (2002).
  32. Masserdotti, G., et al. Transcriptional mechanisms of proneural factors and REST in regulating neuronal reprogramming of astrocytes. Cell Stem Cell. 17 (1), 74-88 (2015).
  33. Rao, Z., et al. Molecular mechanisms underlying Ascl1-mediated astrocyte-to-neuron conversion. Stem Cell Reports. 16 (3), 534-547 (2021).
  34. Gascon, S., et al. Identification and successful negotiation of a metabolic checkpoint in direct neuronal reprogramming. Cell Stem Cell. 18 (3), 396-409 (2016).
  35. Russo, G. L., et al. CRISPR-mediated induction of neuron-enriched mitochondrial proteins boosts direct glia-to-neuron conversion. Cell Stem Cell. 28 (3), 524-534 (2021).
  36. Guo, S., et al. Nonstochastic reprogramming from a privileged somatic cell state. Cell. 156 (4), 649-662 (2014).
  37. Hu, X., et al. Region-restrict astrocytes exhibit heterogeneous susceptibility to neuronal reprogramming. Stem Cell Reports. 12 (2), 290-304 (2019).
  38. Ge, W. P., Miyawaki, A., Gage, F. H., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Local generation of glia is a major astrocyte source in postnatal cortex. Nature. 484 (7394), 376-380 (2012).
  39. Price, J. D., et al. The Ink4a/Arf locus is a barrier to direct neuronal transdifferentiation. The Journal of Neuroscience. 34 (37), 12560-12567 (2014).
  40. Heinrich, C., et al. Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex. Nature Protocols. 6 (2), 214-228 (2011).
  41. Batiuk, M. Y., et al. An immunoaffinity-based method for isolating ultrapure adult astrocytes based on ATP1B2 targeting by the ACSA-2 antibody. The Journal of Biological Chemistry. 292 (21), 8874-8891 (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Isolatie van astrocytenmagnetische cel sorteringneuronale differentiatievirale transductieDNA transfectiecentraal zenuwstelselneuronale markersfunctionele neuronen
Isolatie en directe neuronale herprogrammering van muisastryoten
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.